Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T13:01:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 663177 bytes, checksum: ffa992f1521764da943dc8672729f08e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T13:01:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 663177 bytes, checksum: ffa992f1521764da943dc8672729f08e (MD5) Previous issue date: 2003-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, destacando-se a flatulência. Flatulência é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. A hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o tratamento mais promissor para a redução do conteúdo de RO em produtos derivados de soja. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de α-galactosidases de várias fontes para hidrolisar os RO presentes no extrato desengordurado de soja e nos produtos melaço leve e pesado. Foram testadas α-galactosidase de sementes germinadas de soja e de Tachigali multijuga , α-galactosidases de Aspergillus terreus e de Penicillium griseoroseum. O processo de purificação do extrato enzimático, obtido de sementes de soja var. Monarca, embebidas por 60 h, consistiu das etapas de crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de filtração em gel e de troca iônica, resultando numa preparação contendo atividade de α-galactosidase. A enzima foi purificada 19,74 vezes, com rendimento de 36,64%. Atividade máxima de α- galactosidase foi detectada em pH 5,0 a 50 °C. Cerca de 90% da atividade enzimática original foi mantida, após pré-incubação por 4 h a 40 °C. Os valores de K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose foram de 0,47 mM, 1,46 mM e 3,43 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade o ρNPGal, seguido por rafinose, estaquiose e melibiose. Galactose, SDS, CuSO 4 , rafinose, estaquiose e melibiose atuaram como inibidores da atividade de α-galactosidase. Os resultados dos tratamentos do extrato desengordurado de soja com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, mostraram redução de 100% de rafinose e 53% de estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C. Quando o extrato desengordurado de soja foi tratado com a α-galactosidase de Tachigali multijuga, a S1 de A. terreus e a de P. griseoroseum, constatou-se redução no teor de rafinose de 72%, 100% e 66%, e no teor de estaquiose de 49%, 100% e 100%, respectivamente, após incubação por 8 h, a 40 °C. A redução no teor de RO nos produtos melaço leve e pesado de soja, tratados com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, foi de 100% para rafinose e 58% para estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C, para ambos os produtos. Conclui-se que as α-galactosidases testadas hidrolisaram substancialmente os carboidratos não- digeríveis, rafinose e estaquiose, do extrato desengordurado de soja e dos produtos melaço leve e pesado de soja, indicando uma possível utilização destas enzimas em processos industriais, visando a diminuição dos RO e o aumento do uso da soja como fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal. / The intake of legume seeds, like soybean and its derived products, results in unpleasant symptoms, including flatulence. It results from the anaerobic metabolism of α-1,6-galactosides of raffinose (RO: Raffinose Oligosaccharides) that is generally present in legume seeds. The removal of these sugars would have a positive impact in soybean food consumption. The enzymatic hydrolysis of RO by α-galactosidase, seems to be the most promising treatment, for the reduction of RO content in derived soybean products. The objective of this work was to verity the efficiency of α-galactosidases from various sources in hydrolyze RO present in soybean extract and soybean molasses. The α-galactosidases tested were purified from germinating seeds of soybean and seeds of Tachigali multijuga, of the Aspergillus terreus and of Penicillium griseoroseum cultures. The purification process of the enzymatic extract from germinating soybean seeds at 60 h was submitted to cryoprecipitation, acid precipitation, fractionation with ammonium sulphate, gel filtration and ion exchange chromatographys, resulting in a preparation with activity for α-galactosidase. The purification factor was 19.74 fold with enzymatic activity recovery of 36.64%. Maximum α-galactosidase activity was detected in pH 5.0 and 50 °C. The enzyme maintained near 90% of its original activity after pre-incubation for 4 h at 40 °C. The K M ap values for hydrolysis of ρNPGal, melibiose and raffinose were of 0.47 mM, 1.46 mM and 3.43 mM, respectively. The highest enzyme activity was observed with ρNPGal, followed by raffinose, stachyose and melibiose. Galactose, SDS, CuSO 4 , raffinose, stachyose and melibiose inhibited the enzyme activity. The results of the treatment of soybean extract with the enzymatic preparation of α- galactosidase, after incubation for 8 h at 40 °C, showed a reduction of 100% and 53% in the raffinose and stachyose contents, respectively. When the soybean extract was treated with α-galactosidases of T. multijuga, S1 of A. terreus and P. griseoroseum, a reduction of 72%, 100% and 66%, and of 49%, 100% and 100%, it was verified in the raffinose and stachyose contents, respectively, after incubation for 8 h, at 40 °C. The reduction in the level of RO in the soybean molasses, treated with the enzymatic preparation with α- galactosidase activity, was from 100% for raffinose and 58% for stachyose, respectively, after incubation for 8 h, at 40 °C. In conclusion, it was observed that the α-galactosidases tested in this study, were able to hydrolyze substantially the non digestible carbohydrates (raffinose oligosaccharides) present in soybean extract and soybean molasses, indicating a possible use of these enzymes in the industrial process, seeking the decrease of RO and the increase of the use of the soybean as a source of vegetable protein for human and animal feeding. / Dissertação importada do Alexandria.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-18T18:24:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T18:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, o que limita o seu consumo. Dentre os sintomas desagradáveis, destaca-se a flatulência, que é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares das sementes ou do extrato hidrossolúvel poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. Vários processos para redução do conteúdo de RO em derivados de soja já foram descritos; entretanto, a hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o mais promissor. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência da α-galactosidase de sementes de soja em germinação para hidrolisar os RO presentes no extrato de soja. Sementes de soja (Glycine max , vr. CAC-1) foram germinadas por 60 h, a 27 °C. O extrato enzimático foi obtido pela trituração das sementes em tampão citrato/fosfato de sódio, pH 5,0. A suspensão foi filtrada e centrifugada, e o extrato enzimático resultante, utilizado para a purificação da α-galactosidase. Em uma primeira abordagem, o extrato enzimático foi fracionado em um sistema de duas fases aquosas (SDFA), formado por uma mistura de 16% (p/p) de PEG 1500, 16% (p/p) de fosfato de sódio pH 5,0 e 12% (p/p) de NaCl. A enzima presente na fase superior do SDFA foi dialisada e submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose, pH 4,0. As frações com atividade de α-galactosidase, eluídas com um gradiente de NaCl (0-0,8M), foram reunidas, concentradas por ultrafiltração, originando a α-galactosidase semi-purificada. A α-galactosidase foi purificada 12,4 vezes e o rendimento do processo de purificação foi de 13,5%. Atividade máxima de α-galactosidase foi detectada em pH 5-6 a 50 °C. A enzima manteve-se em torno de 100% da atividade original após pré- incubação por 3 h, a 35 e 40 °C, mas somente 50% da atividade original foi mantida após pré-incubação a 45 °C. K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose determinados pelo método do duplo-recíproco foram de 0,30 mM, 0,63 mM e 6,16 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade rafinose, seguido de ρNPGal, estaquiose e melibiose. Galactose, rafinose, melibiose, CuSO 4 , SDS e CAC-1l 2 atuaram como inibidores da atividade da enzima parcialmente purificada. Resultados do tratamento do leite de soja com a enzima mostraram redução de 72,3% de estaquiose e 89,2% de rafinose após um período de incubação de 6h, a 40 °C. Com o objetivo de aumentar o rendimento do processo de purificação, visando futuras aplicações em ensaios biológicos, um segundo protocolo foi estabelecido. O extrato enzimático obtido, como já descrito, foi submetido à crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio (20-50% de saturação) e cromatografia de filtração gélica em Sephadex G-100. A α-galactosidase foi semi purificada em quatro etapas, com índice de purificação de 21,33 vezes e recuperação de 44% da atividade enzimática. Em conclusão, observamos que a adição de α -galactosidase ao extrato de soja hidrolisou uma fração significativa dos carboidratos não digeríveis, estaquiose e rafinose, podendo diminuir a flatulência causada por esses oligossacarídeos e assim aumentar o uso desta fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal. Além disso, essa enzima apresenta características cinéticas compatíveis com as exigências para sua utilização em processos industriais, visando a diminuição nos teores dos oligossacarídeos de rafinose. / The ingestion of legume seeds, like soy and derived products, results in unpleasant symptoms, which limits its consumption. Among the unpleasant symptoms, flatulence is the major one, which results from the anaerobic metabolism of α-1,6-galactosides of raffinose (RO: Raffinose oligosaccharides) generally presents in legume seeds. Removal of those sugars from soy seeds or soybean derived products would have a positive impact in soy food consumption. Several processes for RO content reduction in soy products were described, however, enzymatic hydrolyze of RO by α-galactosidase seems to be the most promising. The objectives of this work were to text α -galactosidase the efficiency from germinated soy seeds to hydrolyze RO present in soybean milk. Soy seeds (Glycine max , cv CAC-1) were allowed to germinate for 60 h, at 27 °C. The enzymatic extract was obtained by seed trituration in a citrate /sodium phosphate, pH 5.0. Then the suspension was filtered, centrifuged and the resulting enzymatic crude extract used for α-galactosidase purification. First, the enzymatic extract was fractionated in a Aqueous Two-Phase System (ATPS) consisted of a 16 % (w/w) polyethyleneglycol (PEG 1500) solution, 16% (w/w) of sodium phosphate pH 5.0 and 12% (w/w) of NaCl. The enzyme present in the upper phase of the ATPS was dialyzed and loaded onto a CM-Sepharose Fast Flow ionic exchange column, pH 4.0. The fractions with activity of α- galactosidase, were eluted with a gradient of NaCl (0-0.8M), they were pooled together, concentrated by ultra filtration, producing α-galactosidase partially purified. α-Galactosidase was partially purified in two stages. Purification index was 12.4 times with enzymatic activity recovery of 13.5%. Maximum α- galactosidase activity was detected in pH range of 5-6 and 50 °C. The enzyme maintained near 100% of original activity after pre-incubation for 3h at 35 and 40 °C, but only 50% of original activity after pre-incubation at 45 °C. K M app values for hydrolyze of ρNPGal, melibiose and rafinose was of 0.30, 0.63 and 6.16 mM, respectively. The enzyme was able to hydrolyze better rafinose, followed by ρNPGal, stachyose and melibiose. Galactose, raffinose, melibiose, CuSO 4 , SDS and CAC-1l 2 inhibited the enzyme activity. Soybean milk treated with α-galactosidase showed reduction of 72.3 and 89.2% in the stachyose and raffinose contents, respectively, after incubation for 6h at 40oC. In order to increasing the purification process efficiency, seeking future application in biological assays, a second protocol was established. Enzymatic extract was submitted to cryoprecipitation, acid precipitation and fractionation with ammonium sulphate (20-50% of saturation) and filtrated by gel chromatography. The extract was loaded onto Sephadex G-100 column. α-Galactosidase was partially purified in four stages. Purification index was 21.33 times with enzymatic activity recovery of 44%. In conclusion, we observed that the addition of α-galactosidase to soybean extract hydrolyzed a significant fraction of the carbohydrates non digestible, rafinose oligosaccharides, that can reduce the flatulence caused by those oligosaccharides and also can increase the use of this protein vegetable source in the human and animal feeding. Besides, that enzyme presents compatible kinetic characteristics for use in industrial processes, with the objective to reduce rafinose oligosaccharides content. / Dissertação importada do Alexandria

Orientadora: Profª. Drª. Hana Paula Masuda / Coorientador: Prof. Dr. Danilo da Cruz Centeno / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, São Bernardo do Campo, 2018. / Os oligossacarídeos da série da rafinose (OSRs) são carboidratos formados pela adição sequencial de um grupo galactosil, geralmente doado por uma molécula de galactinol, à molécula de sacarose. Essa via é regulada principalmente por três enzimas. A galactinol sintase (GOLS) que é responsável pela síntese de galactinol. A rafinose sintase (RAFS) que transfere o resíduo galactosil do galactinol à molécula de sacarose dando origem a rafinose. E a estaquiose sintase (STS) que é responsável pela transferência de galactosil para a rafinose, dando origem a estaquiose. Esses açúcares desempenham importantes papéis fisiológicos nas células vegetais e têm sido considerados como moléculas chave na resposta ao estresse abiótico. Cada enzima envolvida no metabolismo dos OSRs é codificada por uma família de gênica. No entanto, ainda são escassos os trabalhos que apresentem descrições sistemáticas dos genes e suas relações evolutivas nas espécies vegetais. Os poucos trabalhos disponíveis focam nos genes que codificam GOLS, frequentemente considerada a enzima-chave da via. O objetivo deste trabalho foi estudar a diversidade e evolução dos genes rafs e sts em monocotiledôneas, para ampliar o conhecimento sobre os genes nessas espécies. Foram investigados genes rafs e sts em oito espécies vegetais, seis monocotiledôneas e duas dicotiledôneas. Também foram produzidas análises filogenéticas, de ortologia e a caracterização dos domínios proteicos nos genes identificados. Os resultados mostraram que RAFS e STS existem em grande diversidade e que são codificadas por vários genes putativos. As árvores filogenéticas permitiram diferenciar rafs de sts, sugerir relações evolutivas entre os genes e identificar diferentes grupos nessa família gênica. Análises de sintenia indicam a existência de genes ortólogos e duplicações in tandem. Por fim, a análise dos domínios proteicos confirmou a similaridade entre rafs e sts. Como conclusão, essa dissertação expande o conhecimento a respeito dos genes codificadores da via do OSRs, fornece informações para futuros trabalhos com foco em biotecnologia e contribui com a descrição das informações genômicas obtidas nos projetos de sequenciamento genético de espécies vegetais. / The raffinose series oligosaccharides (RFOs) are small carbohydrates synthetized by the sequential addition of a galactosil group, usually donated by a galactinol to sucrose. This metabolic pathway is regulated, among others, by the galactinol synthase (GOLS) enzyme, responsible for the synthesis of galactinol; the raffinose synthase (RAFS), responsible for the transfer of a galactosil group to sucrose, synthetizing rafinose, and; stachyose synthase (STS), responsible for the transfer of another galactosil group to raffinose, thus producing stachyose. These sugars play important physiological roles on plant cells and are considered key molecules in the response to abiotic stress. The enzymes involved on the RFOs metabolism exhibit a large number of functional genes. However, few studies present systematic descriptions of these genes and their evolutionary relationships on plant species. The few available studies focused on the genes that code for GOLS, frequently considered the key enzyme of RFOs metabolic pathway. The objective of this study was to understand the diversity and evolution of the rafs and sts genes in monocot species, to extend the knowledge on these plant genes. Rafs and sts genes were surveyed in eight plant species, six monocot and two dicot species. Phylogenetic and synteny analyses were performed, as well as, the characterization of the protein domains. The results showed that a large number of putative genes codifies both RAFS and STS, indicating that this gene family have a high diversity in plant genomes. The phylogenetic trees allowed proposing the evolutionary relationships between those genes and suggested the existence of different sequence groups. Synteny analyses showed groups of orthologue genes and in tandem gene duplications. Finally, the protein domain analyses corroborated the high similarity between rafs and sts. In conclusion, this work expands the knowledge about RFOs metabolism genes, provided information for further biotechnology studies and contributes to the description of sequence data from genomics projects.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-10-09. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:14Z : No. of bitstreams: 1 000868507_20161020.pdf: 285189 bytes, checksum: b85306372b47acfd2d205957d3ba6810 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-10-21T11:52:44Z: 000868507_20161020.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-10-21T11:53:23Z : No. of bitstreams: 1 000868507.pdf: 2029237 bytes, checksum: d3b1875d2d1132ea3143df460c8cda27 (MD5) / A aplicação energética dos subprodutos da cana-de-açúcar faz dessa cultura uma das líderes em investimentos do agronegócio internacional. Para suprir a demanda mundial e expandir o setor sucroenergético, estratégias de engenharia genética que possam gerar plantas transgênicas mais tolerantes a estreses bióticos e abióticos podem ser uma alternativa para ganhos de produtividade. Um dos mecanismos mais utilizados em plantas para minimizar os efeitos causados por estresses é o acúmulo de solutos. Entre eles, pode ser destacada a família de oligossacarídeos da rafinose (RFOs). Ela é formada a partir da adição sucessiva de radicais galactosil a uma molécula de sacarose, em reação catalisada pelas enzimas galactinol sintase (GolS), rafinose sintase e estaquiose sintase. A GolS é considerada o passo-chave de regulação da síntese de RFOs em plantas modelo. Embora a compreensão das etapas moleculares da produção de RFOs e sua modulação por estresses abióticos tenham potencial de contribuir na tolerância a estresses em plantas, esta estratégia é pouco compreendida em gramíneas, entre elas a cana-de-açúcar. Neste sentido, o presente trabalho pretende compreender aspectos moleculares relativos à produção de RFOs em cana-de-açúcar e sua relação com estresses abióticos e desenvolvimento. Para tanto, foram avaliados transcricionalmente genes relacionados a síntese de RFOs em cana sob estresse hídrico, bem como obteve-se plantas transgênicas com expressão constitutiva do gene CaGolS2, uma galactinol sintase de cafeeiro. Sob estresse hídrico, gene ScGolS1 teve seu nível transcricional reduzido em folhas e induzido em colmo. ScRFS1 nos dois tecidos tem o padrão transcricional diretamente relacionado ao aumento da severidade do estresse, e o mesmo é observado em ScSTS1. Foram também obtidos 10 eventos transgênicos de cana-de-açúcar com a região codificante do gene CaGolS2 de Coffea arabica, dos quais... / Bioenergy application of sugarcane byproducts are making this crop one of the most important in the international agribusiness investments. To meet global demand and expand the sugarcane sector, genetic engineering strategies generating transgenic plants more tolerance to biotic and abiotic stresses is a promising to improve productivity. One of the most relevant mechanism related to stress tolerance in plants involves the accumulation of distinct solutes. The Raffinose Oligosaccharids Family synthesis starts from the successive addition of galactosyl radicals to a sucrose molecule, in a reaction catalyzed by galactinol synthase (GolS), raffinose synthase and stachyose synthase. GolS plays a key role in RFOs production in model plants. Although the stress-responsive action of RFOs may improve abiotic stress tolerance in plants, these mechanisms are almost completely unknown in grasses, like sugarcane. In this context, this study aims to understand molecular aspects of RFOs synthesis and its relation with abiotic stresses. We have evaluated the transcriptional level of genes related RFOs synthesis under water stress and we produced transgenic plants constitutively expressing a coffee galactinol synthase (CaGolS2). Under water stress, ScGolS1 was downregulated in leaves, but upregulated in stems. ScRFS1 and ScSTS1 were upregulated in both tissues, in a direct correlation between transcription level and stress. We produced 10 transgenic events containing the coding region of CaGolS2; in six events, the transgene were transcriptionally active. Transgenic plants presented differences in morphology and carbon assimilation when compared to non-transgenic controls. Overall, we inferred that the stress-responsive pattern of RFO synthesis genes might help carbon relocation during water stress. Raffinose and stachyose seems to have greater impact than galactinol in this process. Furthermore, CaGolS2 transgenic plants have promising traits for...

Orientador: Douglas Silva Domingues / Banca: Danilo Centeno / Banca: Monalisa Sampaio Carneiro / Resumo: A aplicação energética dos subprodutos da cana-de-açúcar faz dessa cultura uma das líderes em investimentos do agronegócio internacional. Para suprir a demanda mundial e expandir o setor sucroenergético, estratégias de engenharia genética que possam gerar plantas transgênicas mais tolerantes a estreses bióticos e abióticos podem ser uma alternativa para ganhos de produtividade. Um dos mecanismos mais utilizados em plantas para minimizar os efeitos causados por estresses é o acúmulo de solutos. Entre eles, pode ser destacada a família de oligossacarídeos da rafinose (RFOs). Ela é formada a partir da adição sucessiva de radicais galactosil a uma molécula de sacarose, em reação catalisada pelas enzimas galactinol sintase (GolS), rafinose sintase e estaquiose sintase. A GolS é considerada o passo-chave de regulação da síntese de RFOs em plantas modelo. Embora a compreensão das etapas moleculares da produção de RFOs e sua modulação por estresses abióticos tenham potencial de contribuir na tolerância a estresses em plantas, esta estratégia é pouco compreendida em gramíneas, entre elas a cana-de-açúcar. Neste sentido, o presente trabalho pretende compreender aspectos moleculares relativos à produção de RFOs em cana-de-açúcar e sua relação com estresses abióticos e desenvolvimento. Para tanto, foram avaliados transcricionalmente genes relacionados a síntese de RFOs em cana sob estresse hídrico, bem como obteve-se plantas transgênicas com expressão constitutiva do gene CaGolS2, uma galactinol sintase de cafeeiro. Sob estresse hídrico, gene ScGolS1 teve seu nível transcricional reduzido em folhas e induzido em colmo. ScRFS1 nos dois tecidos tem o padrão transcricional diretamente relacionado ao aumento da severidade do estresse, e o mesmo é observado em ScSTS1. Foram também obtidos 10 eventos transgênicos de cana-de-açúcar com a região codificante do gene CaGolS2 de Coffea arabica, dos quais... / Abstract: Bioenergy application of sugarcane byproducts are making this crop one of the most important in the international agribusiness investments. To meet global demand and expand the sugarcane sector, genetic engineering strategies generating transgenic plants more tolerance to biotic and abiotic stresses is a promising to improve productivity. One of the most relevant mechanism related to stress tolerance in plants involves the accumulation of distinct solutes. The Raffinose Oligosaccharids Family synthesis starts from the successive addition of galactosyl radicals to a sucrose molecule, in a reaction catalyzed by galactinol synthase (GolS), raffinose synthase and stachyose synthase. GolS plays a key role in RFOs production in model plants. Although the stress-responsive action of RFOs may improve abiotic stress tolerance in plants, these mechanisms are almost completely unknown in grasses, like sugarcane. In this context, this study aims to understand molecular aspects of RFOs synthesis and its relation with abiotic stresses. We have evaluated the transcriptional level of genes related RFOs synthesis under water stress and we produced transgenic plants constitutively expressing a coffee galactinol synthase (CaGolS2). Under water stress, ScGolS1 was downregulated in leaves, but upregulated in stems. ScRFS1 and ScSTS1 were upregulated in both tissues, in a direct correlation between transcription level and stress. We produced 10 transgenic events containing the coding region of CaGolS2; in six events, the transgene were transcriptionally active. Transgenic plants presented differences in morphology and carbon assimilation when compared to non-transgenic controls. Overall, we inferred that the stress-responsive pattern of RFO synthesis genes might help carbon relocation during water stress. Raffinose and stachyose seems to have greater impact than galactinol in this process. Furthermore, CaGolS2 transgenic plants have promising traits for... / Mestre

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Immobilized enzymes provide many advantages when compared to the usage of their free forms. Among these ones, remarkable advantages are the possibility of the biocatalyst reusability, easy separation at the end of the process, its usage in continuous way and the enhancement of its stability. This work was performed aiming the immobilization of the α-galactosidase enzyme from Aspergillus niger in ion exchange resin and the evaluation of its catalytic activity. Firstly, tests were performed in five different resins: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. According to the results, Duolite A-568 was chosen as the best support. Therefore, studies were done aiming the optimization of the immobilization process in this resin. Glutaraldehyde 1% (v/v) was used before the enzyme adsorption process and it enhanced the operational stability of the immobilized enzyme. Preliminary tests did not showed difference for the immobilization process at the temperatures of 25 and 40°C. A full factorial design and a central composite design were performed to study the best immobilization conditions varying the pH, the α-galactosidase concentration and the immobilization time. The results led to use the following immobilization conditions: pH 4.5; 15 g/L of α-galactosidase and 3 hours of immobilization. The temperature of maximum activity occurred at 60°C for both free and immobilized enzyme. The activation energy calculated by linear adjustment of Arrhenius equation was 5.66 kcal/mol for soluble α-galactosidase and 4.48 kcal/mol for immobilized α-galactosidase. The optimum pH range obtained for free enzyme was 4.0-5.0 and for immobilized enzyme it was 3.0-6.0. The immobilization process improved the α-galactosidase activity in alkaline pHs. Analysis of pH stability showed that both forms of enzyme were resistant for the pH ranges studied (3.5 to 7.5 for free and 3.0 to 8.0 for immobilized). However, the thermal stability of the biocatalyst immobilized in the support decreased. The kinetic studies without inhibition showed closed values of maximum speed (Vmax) for both enzyme forms (194.5 U for free and 187.7 U for immobilized). Although, the Michaelis-Menten constant (Km) of immobilized enzyme was higher than the free one (18.8 and 12.5 g/L, respectively). The hydrolysis reaction of raffinose was inhibited by the addition of the reaction products, sucrose and galactose, and the results of inhibition by galactose pointed for the competitive inhibition type. Then, storage tests of immobilized α-galactosidase showed that the enzyme maintained its activity even after 145 days when kept at the temperature of 4°C. / O uso de enzimas imobilizadas proporciona muitas vantagens em relação ao seu uso na forma livre. Dentre estas vantagens se destacam a possibilidade de reutilização do biocatalisador, a sua fácil separação ao final do processo, a utilização em modo contínuo e o aumento de sua estabilidade. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de imobilizar a enzima α-galactosidase de Aspergillus niger em resina de troca iônica e avaliar a sua atividade catalítica. Inicialmente, foram feitos testes preliminares de imobilização em 5 tipos de resinas: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. Pelos resultados obtidos, Duolite A-568 foi selecionada como melhor suporte e, portanto, estudos foram feitos para a otimização do processo de imobilização nesta resina. Glutaraldeído na concentração de 1% (v/v) foi utilizado anteriormente ao processo de adsorção da enzima e melhorou a estabilidade operacional da α-galactosidase imobilizada. Testes preliminares não indicaram diferença do processo de imobilização para temperaturas de 25 e 40°C. Realizou-se um planejamento fatorial completo e um planejamento composto central para estudar as melhores condições de imobilização variando-se o pH, concentração de α-galactosidase e tempo de imobilização. Os resultados obtidos levaram a utilizar as seguintes condições de imobilização: pH 4,5, concentração de α-galactosidase de 15 g/L e tempo de imobilização de 3 horas. A temperatura de máxima atividade enzimática foi 60°C tanto para a enzima livre quanto imobilizada. O valor da energia de ativação encontrado pelo ajuste linear da equação de Arrhenius foi de 5,66 kcal/mol para α-galactosidase solúvel e 4,48 kcal/mol para α-galactosidase imobilizada. A faixa de pH ótimo obtido para a enzima livre foi 4,0-6,0 e para a enzima imobilizada foi 3,0-6,0. O processo de imobilização melhorou a atividade da α-galactosidase para pHs mais alcalinos. A análise de resistência ao pH mostrou que ambas as formas da enzima foram resistentes para as faixas estudadas (3,5 a 7,5 para livre e 3,0 a 8,0 para imobilizada). No entanto, a resistência térmica do biocatalisador retido no suporte foi menor. O estudo cinético sem inibição apresentou valores de velocidade máxima (Vmáx) próximos para as duas formas da α-galactosidase (194,5 U para livre e 187,7 U para imobilizada), porém o Km da forma imobilizada foi maior que o da livre (18,8 g/L e 12, 5 g/L de rafinose, respectivamente). A reação de hidrólise da rafinose foi inibida pela adição dos produtos da reação, sacarose e galactose, sendo que os resultados de inibição por galactose apontam para o tipo de inibição competitiva Por fim, testes de estocagem da α-galactosidase imobilizada mostraram que a enzima manteve sua atividade mesmo após 145 dias mantida a temperatura de 4°C. / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Prof. Dr. Danilo da Cruz Centeno / Coorientadora: Profª. Drª. Hana Paula Masuda / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, São Bernardo do Campo, 2018. / A busca por fontes renováveis de energia tem aumentado devido à preocupação mundial com o uso excessivo de combustíveis fósseis, destacando-se como alternativa o etanol produzido a partir da cana-de-açúcar. O plantio de cana é intenso no Brasil, por ser uma cultura relativamente bem adaptada às distintas condições locais. No entanto, condições de estresse biótico e abiótico podem reduzir a produtividade e gerar grandes prejuízos, sobretudo em períodos de seca. Nesta perspectiva, o estudo de características agronomicamente desejáveis, como a tolerância ao déficit hídrico, em diferentes variedades é fundamental para a seleção de cultivares apropriadas e o desenvolvimento de cultivares mais produtivas, que elevem a produção de etanol, sem que haja uma expansão demasiada das áreas de cultivo de cana. Neste trabalho, indivíduos de cana-de-açúcar SP80-3280, uma das cultivares mais produzidas no Estado de São Paulo, foram cultivados em condições hídricas distintas e tiveram suas folhas mais jovens (folha +1) analisadas em diferentes aspectos. Os dados fisiológicos foram medidos no Infra-Red GAS Analyzer (IRGA). A quantificação relativa de transcritos foi feita através do método de PCR em tempo real (qPCR), para galactinol sintase (ScgolS), rafinose sintase (ScrafS) e estaquiose sintase (ScstaS), genes-chave na via dos Oligossacarídeos da Série da Rafinose (OSR), envolvida na tolerância à seca. As sequências codificantes de ScgolS, ScrafS e ScstaS, foram obtidas através de análises fenéticas, realizadas com as regiões codificantes de homólogos em milho, sorgo e cana. A quantificação dos metabólitos primários foi realizada através da técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Plantas que permaneceram sob déficit hídrico por 7 dias (DH - 7 dias) apresentaram diminuição em todos os parâmetros ecofisiológicos, e aumento nos níveis de mio-inositol, manitol, glicose, frutose, ácido quínico e ácido chiquímico. Já plantas com 20 dias de déficit hídrico (DH - 20 dias) mostraram diminuição na taxa de crescimento, no número de folhas verdes e na taxa fotossintética, mesmo com aumento nos níveis de condutância estomática e na concentração interna de CO2. Também apresentaram aumento nos níveis de frutose, galactose, ácido quínico e ácido chiquímico, e redução nos níveis de manitol. As plantas Reidratadas sobreviverem à reidratação e voltaram à crescer após o reestabelecimento da água, apresentando aumento na taxa fotossintética, mesmo com redução nos níveis de condutância estomática, na concentração interna de CO2 e na transpiração. Apresentaram também, aumento nos níveis de mio-inositol, manitol, frutose, ácidos orgânicos e ácidos graxos, e na quantidade relativa de transcritos de ScstaS. Em conclusão, plantas que passaram pelo déficit hídrico apresentaram redução da taxa de crescimento, maior quantidade de compostos relacionados ao ajuste osmótico, e não foi observada indução elevada dos genes-chave da via dos OSR. A sensibilidade de SP80-3280 ao déficit hídrico foi reafirmada, mas foi surpreendente a sobrevivência e reestabelecimento após a reidratação. Aparentemente, SP80-3280 induz mecanismos de prevenção ao déficit hídrico, que possibilitam sua sobrevivência, mas não consegue induzir suficientemente mecanismos de tolerância que garantam à planta melhores condições de crescimento diante do estresse. / The search for renewable sources of energy has increased due to the worldwide preoccupation with the excessive use of fossil fuels, highlighting as alternative the ethanol produced from sugarcane. Cane planting is intense in Brazil, because it is a relatively well adapted crop to the different local conditions. However, biotic and abiotic stress can reduce productivity and generate great losses, especially in periods of drought. In this perspective, the study of agronomically desirable characteristics, such as tolerance to water deficit, in different varieties is fundamental for the selection of appropriate cultivars and the development of more productive cultivars, increasing the ethanol production, without extensive expansion of sugarcane planting areas. In this work, individuals of cultivar SP80-3280, one of the most produced in the State of São Paulo, were cultivated under different water conditions and had their youngest leaves (leaf +1) analyzed in different aspects. Physiological data were measured in the Infra-Red GAS Analyzer (IRGA). The relative quantification of transcripts was done by real-time PCR method (qPCR) for galactinol synthase (ScgolS), raffinose synthase (ScrafS) and stachyose synthase (ScstaS), keygenes in the Raffinose Family Oligosaccharides (RFO), involved in drought tolerance. The coding sequences of ScgolS, ScrafS and ScstaS were obtained through phenetic analyzes performed with the homologous coding regions of maize, sorghum and cane. The primary metabolites were quantified by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The plants that remained under water deficit for 7 days (DH - 7 days) presented a decrease in all the ecophysiological parameters, and increased levels of myo-inositol, mannitol, glucose, fructose, quinic acid and shikimic acid. Plants with 20 days of water deficit (DH - 20 days) showed a decrease in the growth rate, in the number of green leaves and in the photosynthetic rate, even with an increase in stomatal conductance and in the internal CO2 concentration. There was also an increase in the levels of fructose, galactose, quinic acid and shikimic acid, and reduction in mannitol levels. The rehydrated plants survived rehydration and returned to grow after water reestablishment, with an increasing in the photosynthetic rate, even with a reduction in stomatal conductance, internal CO2 concentration and transpiration levels. They also showed increased levels of myo-inositol, mannitol, fructose, organic acids and fatty acids, and at the relative amount of ScstaS transcripts. In conclusion, plants that underwent water deficit had a reduction in the growth rate, a greater number of compounds related to the osmotic adjustment, and no high induction of the key genes of the RFO pathway was observed. The sensitivity of SP80-3280 to water deficit was reaffirmed, but survival and reestablishment after rehydration was surprising. Apparently, SP80-3280 induces prevention mechanisms that allow its survival, but it can not sufficiently induce tolerance mechanisms that guarantee the plant better growth conditions in the face of stress.