Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-18T18:24:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T18:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 370583 bytes, checksum: 949df73c78eb106c4c4cee4a0d7df145 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, o que limita o seu consumo. Dentre os sintomas desagradáveis, destaca-se a flatulência, que é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares das sementes ou do extrato hidrossolúvel poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. Vários processos para redução do conteúdo de RO em derivados de soja já foram descritos; entretanto, a hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o mais promissor. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência da α-galactosidase de sementes de soja em germinação para hidrolisar os RO presentes no extrato de soja. Sementes de soja (Glycine max , vr. CAC-1) foram germinadas por 60 h, a 27 °C. O extrato enzimático foi obtido pela trituração das sementes em tampão citrato/fosfato de sódio, pH 5,0. A suspensão foi filtrada e centrifugada, e o extrato enzimático resultante, utilizado para a purificação da α-galactosidase. Em uma primeira abordagem, o extrato enzimático foi fracionado em um sistema de duas fases aquosas (SDFA), formado por uma mistura de 16% (p/p) de PEG 1500, 16% (p/p) de fosfato de sódio pH 5,0 e 12% (p/p) de NaCl. A enzima presente na fase superior do SDFA foi dialisada e submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose, pH 4,0. As frações com atividade de α-galactosidase, eluídas com um gradiente de NaCl (0-0,8M), foram reunidas, concentradas por ultrafiltração, originando a α-galactosidase semi-purificada. A α-galactosidase foi purificada 12,4 vezes e o rendimento do processo de purificação foi de 13,5%. Atividade máxima de α-galactosidase foi detectada em pH 5-6 a 50 °C. A enzima manteve-se em torno de 100% da atividade original após pré- incubação por 3 h, a 35 e 40 °C, mas somente 50% da atividade original foi mantida após pré-incubação a 45 °C. K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose determinados pelo método do duplo-recíproco foram de 0,30 mM, 0,63 mM e 6,16 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade rafinose, seguido de ρNPGal, estaquiose e melibiose. Galactose, rafinose, melibiose, CuSO 4 , SDS e CAC-1l 2 atuaram como inibidores da atividade da enzima parcialmente purificada. Resultados do tratamento do leite de soja com a enzima mostraram redução de 72,3% de estaquiose e 89,2% de rafinose após um período de incubação de 6h, a 40 °C. Com o objetivo de aumentar o rendimento do processo de purificação, visando futuras aplicações em ensaios biológicos, um segundo protocolo foi estabelecido. O extrato enzimático obtido, como já descrito, foi submetido à crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio (20-50% de saturação) e cromatografia de filtração gélica em Sephadex G-100. A α-galactosidase foi semi purificada em quatro etapas, com índice de purificação de 21,33 vezes e recuperação de 44% da atividade enzimática. Em conclusão, observamos que a adição de α -galactosidase ao extrato de soja hidrolisou uma fração significativa dos carboidratos não digeríveis, estaquiose e rafinose, podendo diminuir a flatulência causada por esses oligossacarídeos e assim aumentar o uso desta fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal. Além disso, essa enzima apresenta características cinéticas compatíveis com as exigências para sua utilização em processos industriais, visando a diminuição nos teores dos oligossacarídeos de rafinose. / The ingestion of legume seeds, like soy and derived products, results in unpleasant symptoms, which limits its consumption. Among the unpleasant symptoms, flatulence is the major one, which results from the anaerobic metabolism of α-1,6-galactosides of raffinose (RO: Raffinose oligosaccharides) generally presents in legume seeds. Removal of those sugars from soy seeds or soybean derived products would have a positive impact in soy food consumption. Several processes for RO content reduction in soy products were described, however, enzymatic hydrolyze of RO by α-galactosidase seems to be the most promising. The objectives of this work were to text α -galactosidase the efficiency from germinated soy seeds to hydrolyze RO present in soybean milk. Soy seeds (Glycine max , cv CAC-1) were allowed to germinate for 60 h, at 27 °C. The enzymatic extract was obtained by seed trituration in a citrate /sodium phosphate, pH 5.0. Then the suspension was filtered, centrifuged and the resulting enzymatic crude extract used for α-galactosidase purification. First, the enzymatic extract was fractionated in a Aqueous Two-Phase System (ATPS) consisted of a 16 % (w/w) polyethyleneglycol (PEG 1500) solution, 16% (w/w) of sodium phosphate pH 5.0 and 12% (w/w) of NaCl. The enzyme present in the upper phase of the ATPS was dialyzed and loaded onto a CM-Sepharose Fast Flow ionic exchange column, pH 4.0. The fractions with activity of α- galactosidase, were eluted with a gradient of NaCl (0-0.8M), they were pooled together, concentrated by ultra filtration, producing α-galactosidase partially purified. α-Galactosidase was partially purified in two stages. Purification index was 12.4 times with enzymatic activity recovery of 13.5%. Maximum α- galactosidase activity was detected in pH range of 5-6 and 50 °C. The enzyme maintained near 100% of original activity after pre-incubation for 3h at 35 and 40 °C, but only 50% of original activity after pre-incubation at 45 °C. K M app values for hydrolyze of ρNPGal, melibiose and rafinose was of 0.30, 0.63 and 6.16 mM, respectively. The enzyme was able to hydrolyze better rafinose, followed by ρNPGal, stachyose and melibiose. Galactose, raffinose, melibiose, CuSO 4 , SDS and CAC-1l 2 inhibited the enzyme activity. Soybean milk treated with α-galactosidase showed reduction of 72.3 and 89.2% in the stachyose and raffinose contents, respectively, after incubation for 6h at 40oC. In order to increasing the purification process efficiency, seeking future application in biological assays, a second protocol was established. Enzymatic extract was submitted to cryoprecipitation, acid precipitation and fractionation with ammonium sulphate (20-50% of saturation) and filtrated by gel chromatography. The extract was loaded onto Sephadex G-100 column. α-Galactosidase was partially purified in four stages. Purification index was 21.33 times with enzymatic activity recovery of 44%. In conclusion, we observed that the addition of α-galactosidase to soybean extract hydrolyzed a significant fraction of the carbohydrates non digestible, rafinose oligosaccharides, that can reduce the flatulence caused by those oligosaccharides and also can increase the use of this protein vegetable source in the human and animal feeding. Besides, that enzyme presents compatible kinetic characteristics for use in industrial processes, with the objective to reduce rafinose oligosaccharides content. / Dissertação importada do Alexandria