Orientador : Prof. Dr. João Carlos Bespalhok Filho / Coorientador : Dr. Douglas Silva Domingues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Defesa: Curitiba, 27/11/2015 / Inclui referências : 22-44;80-91 / Área de concentração: Produção vegetal / Resumo: O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), seguido pela Índia e China. A cana é produzida em quase todas as regiões do Brasil e, devido às diferentes condições edafo-climáticas encontradas no país, a cultura está sujeita a estresses ambientais, como o déficit hídrico. Até o momento, o desenvolvimento de variedades melhoradas tem sido a principal estratégia para a produção de materiais tolerantes a ambientes com condições de crescimento sub-ótimas. No entanto, novas ferramentas permitem o estudo e a manipulação da expressão dos genes, possibilitando um melhor entendimento dos mecanismos biológicos, e o consequente uso de plantas geneticamente modificadas com a introdução de genes que confiram tolerância a estresses. Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de plantas de cana-de-açúcar transgênicas mais tolerantes ao déficit hídrico superexpressando o gene NPK1. Este gene foi isolado de plantas de tabaco, sendo ativado na presença dos H2O2 e inicia uma cascata metabólica de proteínas-quinases ativadas por MAPKs. A cascata MAPK funciona em resposta a estresses osmóticos que ocorrem nas plantas em condições extremas de seca. Para tanto, foi utilizado o vetor pSHX004, que é composto pelo domínio catalítico do gene NPK1, sob controle de promotor constitutivo CaMV35S modificado. Foram utilizados os métodos de transformação por bombardeamento de partículas e infecção por Agrobacterium tumefaciens e, para ambos, calos embriogênicos da variedade RB855536 foram selecionados com 5 mg/L de glufosinato de amônio. Plantas de cana-de-açúcar transgênicas potencialmente transformadas geneticamente foram obtidas pelos dois métodos apresentando o fragmento do transgene confirmado por PCR. Foram então selecionados dois eventos transgênicos - um de cada método de transformação - para as análises de tolerância ao estresse hídrico em casa de vegetação. Estes eventos foram submetidos à restrição hídrica por 12 dias e em seguida foram reidratados. As plantas transgênicas apresentaram melhor desempenho, em relação à plantas-testemunha (não transformadas geneticamente) nas análises de relação hídrica nas folhas, a partir do sexto dia de estresse hídrico. Nas análises de assimilação de gás carbônico, condutância estomática e transpiração, as plantas com NPK1 apresentaram melhor desempenho a partir do nono dia, e também apresentaram menor conteúdo de prolina livre no 6o, 9o e 12o dias após a suspensão da irrigação e menor dano celular, medido pelo conteúdo de malondialdeído, após 12o dia de restrição hídrica e na reidratação. Dessa forma, espera-se que essas plantas tenham maior potencial de produtividade em situações comumente observadas em períodos sazonais de seca verificados nas principais regiões produtoras do país. Palavra-chave: Saccharum spp.; estresse abiótico; proteína quinase; MAPK / Abstract: Brazil is the largest producer of sugarcane (Saccharum spp.), followed by India and China. Sugarcane is produced in almost all regions of Brazil and, due to different soil and climatic conditions of the country, the culture is subjected to environmental stresses such as drought. Until now, the development of improved varieties has been the main strategy for the production of materials tolerant to environments with sub-optimal growth conditions. However, new tools enable the study and manipulation of gene expression, providing a better understanding of the biological mechanisms and the use of genetically modified plants by introducing genes that confer stress tolerance. This study aimed to develop transgenic sugarcane plants more tolerant to drought by overexpressing the gene NPK1 of tobacco plants, which is activated in the presence of H2O2 and initiates a metabolic cascade of protein kinases activated by MAPKs. The MAPK cascade operates in response to osmotic stress that occurs in plants under extreme conditions of drought. For this, we used the pSHX004 vector, which contains the catalytic domain of NPK1 gene under control of a modified CaMV35S constitutive promoter. Embryogenic calli of variety RB855536 were transformed with particle bombardment and Agrobacterium tumefaciens and selection was done using 5 mg/L ammonium glufosinate. Putative transgenic sugarcane plants were obtained by the two methods and confirmation of the insertion of the transgene was done by PCR. Two transgenic events obtained by each transformation method were selected for the analysis of tolerance to water deficit under greenhouse conditions. These events were submitted to water restriction for 12 days and then were rehydrated. Transgenic plants performed better compared to non transgenic plants in the analysis of water potential and relative water content (RWC) in the leaves, from the sixth day of water stress. Regarding carbon dioxide assimilation, stomatal conductance and transpiration, plants with NPK1 performed better from the ninth day, and had lower free proline content in the 6th, 9th and 12th days after stopping irrigation and less cell damage, measured by malondialdehyde content, at the end of the experiment. Thus, our data showed that these plants have great potential in situations commonly found in seasonal drought periods observed in the main producing regions. Key words: Saccharum spp., abiotic stress, protein kinase, MAPK

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

A soja é uma das espécies cultivadas de maior importância econômica para o Brasil, atualmente o segundo maior produtor mundial deste grão. Contudo, doenças causadas por fungos são um dos principais problemas enfrentados pelos produtores de soja, o que leva a grandes perdas. Uma das alternativas para superar este problema é a utilização de cultivares com resistência genética. Com este objetivo, foram realizados quatro experimentos independentes de transformação genética de soja, em que o gene chit1, que codifica uma quitinase, enzima capaz de degradar paredes fúngicas, foi transferido para culturas embriogênicas, através da metodologia de biobalística. O gene marcador hpt, que confere resistência ao antibiótico higromicina, também foi utilizado. Em três dos experimentos realizados, uma nova metodologia foi testada, em que sequências desnecessárias, presentes nos vetores de transformação, não são colocadas na planta, e sim apenas os cassetes gênicos, contendo regiões regulatórias e codificadoras. No 1° Experimento realizado, foram obtidas plantas transgênicas transformadas com plasmídeos, mas estas não produziram sementes. No 2° Experimento, foi obtida uma linhagem transgênica, oriunda da transformação com plasmídeos. Foi confirmada a presença e a expressão do gene de quitinase em uma planta T0. Esta planta gerou uma progênie de 16 plântulas. Destas, 10 foram analisadas por PCR e foi confirmada a transmissão do transgene marcador para seis plantas T1. Análises moleculares complementares são necessárias para a determinação do padrão de herança dos transgenes. Como resultado do 3º Experimento realizado, foram obtidos 3.298 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (2.804 oriundos da transformação com plasmídeos e 494 da transformação com cassetes) e 2.286 para a cultivar IAS (759 com plasmídeos e 1.527 com cassetes). Do 4º Experimento realizado, foram obtidos 1.339 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (1.312 oriundos da transformação com plasmídeos e 27 da transformação com cassetes) e 1.035 para a cultivar IAS5 (851 com plasmídeos e 184 com cassetes). Mesmo considerando a possibilidade de alguns dos embriões obtidos serem escapes à seleção, a resistência ao antibiótico é um forte indício de transformação estável. Já foram obtidos embriões germinados oriundos da transformação com cassetes, resultantes dos 3° e 4° Experimentos. Com a condição transgênica comprovada, será realizada uma comparação dos padrões de integração gerados por transformação com plasmídeos e cassetes gênicos. / Soybean is one of the most important crops in Brazil, which is nowadays the second world largest producer. However, injuries caused by fungus are one of the main problems faced by the producers, causing great losses. One of the possibilities to deal with this problem is the utilization of cultivars with genetic resistance. With this goal, four independent soybean transformation experiments were performed. A chitinase gene, chit1, which can break fungal cell walls, was transferred to soybean embryogenic cultures, through the use of biolistic. The selection marker gene hpt, which confers hygromycin resistance, was also transferred to the embryos. In three of the performed experiments, a new methodology was tested, where unnecessary sequences, that are part of the transformation vectors, were not introduced into the plant, but only the gene cassettes, which contain regulatory and coding sequences. In the first experiment, transgenic plants were obtained, but they left no progeny. In the second experiment, one transgenic line was obtained from the plasmid transformation. The presence and expression of the chitinase gene in one T0 plant was confirmed. 16 T1 plantlets were obtained. 10 were analyzed by PCR, and the transmission of the marker gene to six T1 plants was confirmed. Further molecular analyses are necessary in order to determine the inheritance pattern of the transgenes. As a result of the 3rd Experiment, 3.298 histodifferentiated embryos of the cultivar Bragg were obtained (2.804 from the plasmid transformation and 494 from the gene cassettes transformation) and 2.286 of the cultivar IAS (759 from the plasmid transformation and 1.527 from the gene cassettes transformation). From the 4th Experiment, 1.339 histodifferentiated embryos were obtained for cultivar Bragg (1.312 from the plasmid transformation and 27 from the cassettes) and 1.035 for IAS (851 from the plasmid transformation and 184 from the cassettes). Even considering the possibility that some of the embryos obtained may have escaped selection, the hygromycin resistance is a great indication of stable transformation. Plants transformed, resulting from the 3rd and 4th experiments, were already obtained with the minimal cassettes. Once their transgenic nature is proved, the patterns of integration of plasmid transformed plants and cassette transformed plants will be compared.

Orientador: Hélio Grassi Filho / Banca: Silvio Jose Bicudo / Banca: Júlio César Thoaldo Romeiro / Resumo: O milho (Zea mays L.), uma das gramíneas de maior importância econômica do mundo, é cultivado em países de clima tropical, subtropical e de clima temperado. No Brasil a produção de milho tem-se caracterizado pela divisão em duas épocas de semeadura, a semeadura de verão, ou primeira safra, e mais recentemente, temos a produção obtida na safrinha, ou segunda safra. O estresse hídrico é a maior fonte de instabilidade do rendimento de grãos de milho, em áreas de milho, e as estimativas de perdas na produção de milho, causadas pelo déficit hídrico, estão entre 14% e 28% do total produzido, estudos envolvendo o milho nesse segmento podem trazer melhorias no rendimento da cultura em diversas regiões. O objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos fisiológicos, biométricos e produtivos do estresse hídrico no híbrido de milho 2B587 e seu isogênico 2B587 Hx. O experimento foi conduzido em ambiente protegido do Departamento de Solos e Recursos Ambientais - Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, campus de Botucatu, SP. Localizado entre os paralelos 22º30' a 23º05' de latitude sul e os meridianos 48º15' a 48º52' de longitude Oeste de Greenwich, e altitude média de 830 metros. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados, com 5 repetições, em esquema fatorial 2 X 4, sendo o primeiro fator o híbrido de milho convencional e o híbrido de milho transgênico (Hx), e o segundo fator representa os quatro diferentes estresse hídrico, correspondentes a irrigar quando a tensão de água no solo atingir 16.6, 22.4, 31.1, 45.2 Kpa. Conclui-se que o fator água é de extrema importância para a desenvolvimento do milho, sendo ... / Abstract: The corn (Zea mays L.), is one of the most economically important grasses of the world, is grown in tropical, subtropical and temperate countries. In Brazil, corn production has been characterized according to two different seasons of sowing: summer plantation, or first crop-rotation, and "safrinha" or second crop, most recently implemented in the system of cultivation of maize. Drought stress is a major source of instability in the yield of maize, and estimates of losses in maize production caused by water deficit are between 14 % and 28 % of total production. Studies developed in different regions in the country can help to improve crop yield. The aim of this study was to evaluate the physiological, biometric and productive effects of water stress in both maize hybrid variety and its isogenic 2B587 2B587 Hx. The experiment was conducted in a greenhouse of the Department of Soil and Environmental Resources - College of Agricultural Sciences of UNESP, Botucatu, SP. The experimental design was randomized blocks with five replications in a factorial 2 X 4. The first factor was the conventional hybrid corn and hybrid transgenic maize (Hx), and the second factor represented the four different water stress conditions, corresponding to irrigate when the soil water tension reached 16.6 , 22.4 , 31.1 and 45.2 kPa . It can be concluded that the water factor is of utmost importance for the development of corn. The increase of water stress condition in the plant caused a large decrease in productivity. It shows that it is inevitable the proper crop management and monitoring, in order to focus on the efficient use of water resources and to be able to explore the maximum potential of maize productivity / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronegócios, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-13T14:37:59Z No. of bitstreams: 1 2014_HelioSabinoSa.pdf: 1432784 bytes, checksum: 97f6964cf46fbe53a65739b3a573f321 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-14T12:33:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_HelioSabinoSa.pdf: 1432784 bytes, checksum: 97f6964cf46fbe53a65739b3a573f321 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-14T12:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_HelioSabinoSa.pdf: 1432784 bytes, checksum: 97f6964cf46fbe53a65739b3a573f321 (MD5) / Este estudo exploratório e descritivo, baseado em revisão de literatura e pesquisa de campo na modalidade estudo de caso coletivo, com aplicação de survey interseccional, adotou como referenciais teóricos a análise econômica dos direitos de propriedade no contexto da Nova Economia Institucional, em conjunto com as ideias de Joseph Schumpeter sobre inovação como fator determinante do desenvolvimento econômico. Com base nesse referencial, buscou avaliar a percepção dos agricultores quanto aos riscos econômicos decorrentes da violação dos direitos de propriedade intelectual sobre sementes de alto desempenho produtivo, pertencentes às organizações de pesquisa e aos melhoristas, e que são utilizadas como insumo essencial da agricultura contemporânea. Buscou ainda, avaliar a existência real e as causas desse fenômeno entre os agentes componentes da amostra estudada. O estudo de caso coletivo adotou a metodologia de seleção de amostra não randômica do tipo bola de neve, na qual o respondente indica a localização do próximo potencial participante. Foram visitadas 186 glebas rurais na microrregião agrícola do Distrito Federal resultando na aplicação de sessenta instrumentos estruturados de pesquisa. A análise do conjunto de dados obtidos: na revisão de literatura empreendida, nas inferências ambientais de campo e dos dados tabulados extraídos dos formulários estruturados respondidos, revelam a existência da prática de violações de propriedade intelectual sobre sementes certificadas entre os participantes do estudo, entretanto em níveis e sob conformação diferenciada da apontada na literatura, restringindo-se modo relevante às sementes certificadas de soja. Quanto à percepção dos participantes do estudo sobre os riscos econômicos para o agronegócio que possam decorrer de tais violações, os dados apontam que esses agricultores possuem bom nível de percepção quanto ao conjunto de riscos apontados no instrumento de pesquisa, excetuado o risco para a segurança alimentar global, que restou prejudicado pela inserção do substantivo fome na formulação do quesito. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This exploratory and descriptive study, based on literature review and field research in the form of collective case study, with application of intersectional survey, adopts the economic analysis of property rights in the context of the New Institutional Economics as a theoretical referential, coupled with the ideas of Joseph Schumpeter about innovation as a determinant of economic development. Based on this theoretical referential, it sought to assess the perceptions of farmers about the economic risks of infringement of intellectual property rights on seeds with high yield performance, pertaining to research organizations and plant breeders, and what are used as an essential ingredient of modern agriculture. It has also sought to assess the actual existence and causes of this phenomenon among the agents sample components. The collective case study adopted the methodology of selection of nonrandom sample of the snowball kind, in which the respondent indicates the localization of the next potential participant. 186 rural properties were visited in the agricultural microregion of Federal District resulting in the application of sixty structured research instruments. The analysis of the data obtained in the literature review undertaken, during and field research and of inferences obtained from the tabulated data extracted of the answers of structured instrument reveal the existence of the practice of intellectual property violations on certified seeds among the study participants, however at levels and under different conformation of reported in the literature, mainly limited to certified seed of soybean. Regarding the perception of the study participants about the economic risks to agribusiness that may result from such violations, the data indicate that those farmers have a good level of awareness on the set of risks mentioned in the survey instrument, with exception of the risk to global food security, which was affected by the inclusion of substantive hunger in the formulation of this question.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-06-26T22:46:49Z No. of bitstreams: 1 2010_WelcimarGoncalvesCunha.pdf: 2975091 bytes, checksum: 539028d8614ac1d1f4d4b204dd2e7de4 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T14:27:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_WelcimarGoncalvesCunha.pdf: 2975091 bytes, checksum: 539028d8614ac1d1f4d4b204dd2e7de4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T14:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_WelcimarGoncalvesCunha.pdf: 2975091 bytes, checksum: 539028d8614ac1d1f4d4b204dd2e7de4 (MD5) / O mofo branco, causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum, é hoje um dos principais problemas da cultura da soja e afeta diretamente a economia dos principais países produtores. A incidência desse patógeno acarreta em danos expressivos na produção e qualidade dos grãos, podendo atingir perdas em torno de 80%. O ácido oxálico, produzido pelo fungo durante o processo de infecção, é considerado o principal fator de patogenicidade do fungo S. sclerotiorum. A expressão de enzimas que degradam o ácido oxálico em plantas transgênicas tem sido utilizada em diversas culturas visando o desenvolvimento de cultivares resistentes. No presente trabalho, o gene oxdc que codifica para a enzima oxalato descarboxilase, isolado do fungo Flammulina velutipes, foi inserido via biobalística no genoma da soja. Dezesseis eventos T2 foram avaliados via inoculação de discos de micélio do fungo S. sclerotiorum em folhas destacadas. A análise da curva de progresso da doença revelou que todos os eventos transgênicos apresentaram atraso no desenvolvimento dos sintomas quando comparados com o controle não transgênico. A área abaixo da curva de progresso da doença foi utilizada para sumarizar a severidade da doença em cada evento transgênico e no controle. O teste de Kruskal-Wallis revelou que houve diferença significativa (P ≤ 0,05) entre os tratamentos. Os eventos OXDC.9.21 e OXDC.8.18 tiveram os menores índices de severidade. Tais eventos apresentaram respectivamente, índices de severidade 96% e 93% menor que o apurado para o controle. Os resultados impetrados a partir da curva de progresso da doença e da severidade da doença utilizando o teste de inoculação da folha destacada com o fungo S. sclerotiorum sugerem que a expressão do gene da oxdc em soja confere aumento do nível de resistência das plantas ao patógeno.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

A soja é uma das espécies cultivadas de maior importância econômica para o Brasil, atualmente o segundo maior produtor mundial deste grão. Contudo, doenças causadas por fungos são um dos principais problemas enfrentados pelos produtores de soja, o que leva a grandes perdas. Uma das alternativas para superar este problema é a utilização de cultivares com resistência genética. Com este objetivo, foram realizados quatro experimentos independentes de transformação genética de soja, em que o gene chit1, que codifica uma quitinase, enzima capaz de degradar paredes fúngicas, foi transferido para culturas embriogênicas, através da metodologia de biobalística. O gene marcador hpt, que confere resistência ao antibiótico higromicina, também foi utilizado. Em três dos experimentos realizados, uma nova metodologia foi testada, em que sequências desnecessárias, presentes nos vetores de transformação, não são colocadas na planta, e sim apenas os cassetes gênicos, contendo regiões regulatórias e codificadoras. No 1° Experimento realizado, foram obtidas plantas transgênicas transformadas com plasmídeos, mas estas não produziram sementes. No 2° Experimento, foi obtida uma linhagem transgênica, oriunda da transformação com plasmídeos. Foi confirmada a presença e a expressão do gene de quitinase em uma planta T0. Esta planta gerou uma progênie de 16 plântulas. Destas, 10 foram analisadas por PCR e foi confirmada a transmissão do transgene marcador para seis plantas T1. Análises moleculares complementares são necessárias para a determinação do padrão de herança dos transgenes. Como resultado do 3º Experimento realizado, foram obtidos 3.298 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (2.804 oriundos da transformação com plasmídeos e 494 da transformação com cassetes) e 2.286 para a cultivar IAS (759 com plasmídeos e 1.527 com cassetes). Do 4º Experimento realizado, foram obtidos 1.339 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (1.312 oriundos da transformação com plasmídeos e 27 da transformação com cassetes) e 1.035 para a cultivar IAS5 (851 com plasmídeos e 184 com cassetes). Mesmo considerando a possibilidade de alguns dos embriões obtidos serem escapes à seleção, a resistência ao antibiótico é um forte indício de transformação estável. Já foram obtidos embriões germinados oriundos da transformação com cassetes, resultantes dos 3° e 4° Experimentos. Com a condição transgênica comprovada, será realizada uma comparação dos padrões de integração gerados por transformação com plasmídeos e cassetes gênicos. / Soybean is one of the most important crops in Brazil, which is nowadays the second world largest producer. However, injuries caused by fungus are one of the main problems faced by the producers, causing great losses. One of the possibilities to deal with this problem is the utilization of cultivars with genetic resistance. With this goal, four independent soybean transformation experiments were performed. A chitinase gene, chit1, which can break fungal cell walls, was transferred to soybean embryogenic cultures, through the use of biolistic. The selection marker gene hpt, which confers hygromycin resistance, was also transferred to the embryos. In three of the performed experiments, a new methodology was tested, where unnecessary sequences, that are part of the transformation vectors, were not introduced into the plant, but only the gene cassettes, which contain regulatory and coding sequences. In the first experiment, transgenic plants were obtained, but they left no progeny. In the second experiment, one transgenic line was obtained from the plasmid transformation. The presence and expression of the chitinase gene in one T0 plant was confirmed. 16 T1 plantlets were obtained. 10 were analyzed by PCR, and the transmission of the marker gene to six T1 plants was confirmed. Further molecular analyses are necessary in order to determine the inheritance pattern of the transgenes. As a result of the 3rd Experiment, 3.298 histodifferentiated embryos of the cultivar Bragg were obtained (2.804 from the plasmid transformation and 494 from the gene cassettes transformation) and 2.286 of the cultivar IAS (759 from the plasmid transformation and 1.527 from the gene cassettes transformation). From the 4th Experiment, 1.339 histodifferentiated embryos were obtained for cultivar Bragg (1.312 from the plasmid transformation and 27 from the cassettes) and 1.035 for IAS (851 from the plasmid transformation and 184 from the cassettes). Even considering the possibility that some of the embryos obtained may have escaped selection, the hygromycin resistance is a great indication of stable transformation. Plants transformed, resulting from the 3rd and 4th experiments, were already obtained with the minimal cassettes. Once their transgenic nature is proved, the patterns of integration of plasmid transformed plants and cassette transformed plants will be compared.

O oxigênio atua como substrato ou cofator numa série de reações bioquímicas do metabolismo primário e secundário das plantas. Várias estratégias têm sido utilizadas no sentido de interferir neste metabolismo aeróbico, visando, entre outras possibilidades, reduzir a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). A fim de alterar a disponibilidade de oxigênio no interior da organela, foram produzidas plantas de fumo (Nicotiana tabacum) expressando a leghemoglobina de soja no interior das mitocôndrias. Para tanto, as plantas foram transformadas, via Agrobacterium tumefaciens, com uma construção quimérica, onde o gene da Lba de soja foi fusionado a uma seqüência de direcionamento mitocondrial. A expressão do gene quimérico foi assegurada pela presença do promotor constitutivo 35S, do vírus do mosaico da couve-flor. A proteína foi corretamente importada e processada no interior das mitocôndrias. Entretanto, não foi possível detectar alterações significativas na função mitocondrial. Numa segunda etapa do presente trabalho, plantas transgênicas de batata (Solanum tuberosum cv Bintje) expressando a leghemoglobina de soja no interior dos cloroplastos, foram caracterizadas do ponto de vista molecular e fenotípico. Observou-se que as plantas apresentaram um fenótipo semelhante àquelas deficientes na biossíntese de giberelina / not available

Esta pesquisa teve como principais objetivos o desenvolvimento de um protocolo de regeneração de plantas de soja in vitro e a obtenção de tecidos transformados, utilizando-se o Agrobacterium tumefasciens como vetor de transformação. Inicialmente, os objetivos foram direcionados para obter um protocolo de regeneração in vitro para três genótipoes de soja. Utilizando-se nós-cotiledonares como explantes, inoculados em meio de cultura MS/2 suplementado com 2,5 μM de BA + 30 g/l de sacarose + 0,7% (p/v) de ágar, obteve-se altas taxas de regeneração e múltipla brotação. Vencida a etapa da cultura in vitro, dois métodos de infecção foram avaliados, usando-se a linhagem GV2260 de Agrobacterium. Após ferir os explantes com bisturi, foram feitos dois cocultivos: em meio líquido por 16 h e em meio sólido por 48 h. Este procedimento interferiu drasticamente no processo de regeneração, sendo que apenas 8% dos explantes apresentaram brotos, a maioria, com vitrificação. No segundo método, os explantes foram infectados, na região onde ocorre a regeneração, com uma seringa contendo uma cultura líquida do Agrobacterium. Em seguida, procedeu-se o cocultivo em meio sólido por 48 h. Este ensaio mostrou 96% de regeneração com brotação abundante. Nos dois processos, foi observada a expressão transitória do gene da β-glucuronidase (GUS), usado como reporter na construção do plasmídio. Fica demonstrado neste trabalho que a utilização do Agrobacterium como vetor de transformação de soja independe do método de infecção. Porém, a regeneração de brotos está condicionada à não exposição dos explantes ao cocultivo em meio líquido. / not available