A broca-da-cana Diatraeasaccharalis(Fabricius) é uma das pragas-alvo do milho geneticamente modificado que expressagene(s) que codifica(m) proteína(s) de BacillusthuringiensisBerliner(milho Bt) no Brasil. Para estabelecer estratégias proativas de manejo de resistência, os objetivos do presente trabalho foram (1)estabelecer linhas-básicas de suscetibilidade à proteína Cry1F de B. thuringiensisem populações de D. saccharalis coletadas nas principais regiões produtoras de milho no Brasil na safra de 2010/2011, (2) realizar monitoramentoda suscetibilidade de populações de D. saccharalis na safra 2011/2012 e (3) avaliar a atividade biológica do milho Bt (evento TC1507) em diferentes estádios fenológicos no controle de D. saccharalis em condições laboratoriais. Para a caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade foram realizados bioensaios com a proteína purificada Cry1F aplicada superficialmente em dieta artificial.As CL50 de Cry1F estimadas variaram de 0,47 a 7,02 ng de Cry1F/ cm2 dieta artificial para as populações avaliadas (variação de ?15 vezes). Foi definida e validada a concentração diagnóstica de 112 ng de Cry1F/cm²,baseada na estimativa da CL99 das populações testadas para o monitoramento da suscetibilidade. A avaliação da atividade biológica de milho Bt (evento TC1507) foi realizada com dois híbridos (Pioneer 30F35 e Dow 2B688) nos estádios fenológicos V3, V6 e V9 e em duas épocas de plantio. Alta atividade de controle de D. saccharalis foi obtida para os dois híbridos de milho Bt nos diferentes estádios fenológicos e épocas de plantio. Portanto, verificou-se que a espécie D. saccharalis é altamente suscetível à proteína Cry1F. Contudo, a implementação de estratégias de manejo da resistência é de fundamental importância para preservar a vida útil da tecnologia de milho Bt como importante ferramenta em programas de MIP. / The sugarcane borer Diatraeasaccharalis (Fabricius) is one of the target pests of genetically modified maizeexpressinggenes that code for insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis Berliner (Bt maize) in Brazil. To implement proactive resistance management strategies, we leaded studies (1) to establish baseline susceptibility to Cry1F protein from B. thuringiensis in populations of D. saccharalis collected from major maize production regions in Brazil during 2010/2011 growing season, (2) to leadsusceptibility monitoring in populations of D. saccharalis collected in 2011/2012 growing season, and (3) to assess the biological activity of Bt maize (event TC1507) at different growth stages forD. saccharaliscontrol under laboratory conditions. The baseline susceptibility wascharacterizedwith purified protein Cry1F applied superficially on artificial diet. The estimatesof LC50 of Cry1F ranged from 0.47 to 7.02 ng Cry1F/cm2of artificial diet for the populations evaluated (? 15-fold variation).A diagnostic concentration of 112 ng Cry1F/cm ² was defined and validated for monitoring the susceptibility based on estimation of CL99 of all tested populations. The biological activity of Bt maize (event TC1507) was assessed by using two hybrids (Pioneer 30F35 and Dow 2B688) at growth stages V3, V6 and V9 and two planting seasons. High level of D. saccharaliscontrol was obtained for the twoBt maize hybrids at different growth stages and planting seasons. Therefore, we conclude that D. saccharalis is highly susceptible to Cry1F protein. However, implementation of insect resistance management strategies is essentialin order to preserve the lifetime of Bttechnology as an important tool in IPM programs.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-27T13:57:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2630530 bytes, checksum: 112de5671b9d3e521f0446f6d6d7237e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T13:57:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2630530 bytes, checksum: 112de5671b9d3e521f0446f6d6d7237e (MD5) Previous issue date: 2004-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns aspectos da interação entre o gene de resistência Sw-5 e os tospovírus, foram analisados neste trabalho. A capacidade de Sw-5 conferir resistência em Nicotiana benthamiana foi avaliada em plantas transformadas com uma construção na qual a ORF e a região 3' do gene estavam sob controle do promotor 35S. As plantas transformadas foram resistentes à infecção por tospovírus. A comparação do espectro da resistência destas plantas com o observado para outras solanáceas , indica que as vias de sinalização e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 estão conservadas nesta família, e que o polimorfismo genético nos componentes das vias de transdução de sinais pode resultar em diferentes níveis de resistência. A fim de identificar o gene de avirulência dos tospovírus, os genes N, NSm e NSs , foram expressos isoladamente ou em combinações, por meio do vetor viral PVX, em plantas com Sw-5. A expressão destes genes não foi capaz de desencadear a resposta de hipersensibilidade e tampouco interferiu na infecção da planta por PVX. Portanto, outro componente dos tospovírus deve ser responsável pelo desencadeamento da reação de resistência. Independentemente da presença do gene Sw-5, a expressão do gene NSs por meio do PVX , agravou os sintomas provocados por este vírus em algumas solanáceas, o que pode ter relação com a capacidade desta proteína de suprimir silenciamento gênico. Em plantas com Sw-5, a co-expressão da região 5' deste gene por meio do vetor PVX , favoreceu a infecção sistêmica por tospovírus. Uma vez que o efeito foi observado tanto para expressão senso quanto anti-senso, a redução dos níveis de mRNA de Sw-5 provocada por silenciamento gênico , poderia ser a causa desta interferência na resistência, embora a análise de Northern blot não tenha demonstrado tal redução. Uma seqüência homóloga a Sw-5 contendo uma ORF sem deleções ou interrupções prematuras foi clonada a partir do acesso LA371-20 de Lycopersicon peruvianum. Análises moleculares demonstraram que esta seqüência é originada do loco Sw-5 ou de região próxima a este e que segrega com a resistência a tospovírus. A capacidade deste e de outros três homólogos oriundos de distintos acessos de tomateiro de conferir resistência a tospovírus, foi avaliada em plantas transgênicas de tomateiro e tabaco. As plantas transformadas foram suscetíveis ao vírus. A não-funcionalidade destes homólogos pode ser devido à estrutura das construções utilizadas na transformação. Alternativamente, outros homólogos presentes nestes acessos de tomateiro podem ser os responsáveis pela resistência. / In this work some aspects of the tospovirus - Sw-5 interaction was analyzed. The capacity of the Sw-5 to confer resistance in Nicotiana benthamiana was evaluated in transgenic plants transformed with Sw-5 ORF containing its own 3 ́ UTR region under 35S promoter control. Transgenic plants were resistant to tospovirus infection. Comparisons of the resistance spectrum with other members of the Solanaceae suggest that the signal transduction pathways and resistance responses triggered by Sw-5 are conservated in solanaceae and that the genetic polymorphism in the signal transduction components may result in different resistance levels. The N, NSm and NSs genes isolated or in combination were expressed by PVX vector in plants harboring Sw-5 in order to detect the tospovirus avirulence gene. These genes were not able to trigger the hypersensitive response and to affect PVX infection in Sw-5 plants, which suggest that another tospovirus component is the elicitor of the resistance response. Independently of the Sw-5 gene, PVX clones harboring NSs gene induced more severe symptoms in some solanaceae plants. Gene silencing may be the cause of this symptoms. In transgenic plants harboring Sw-5 gene, the co-expression of the 5 ́ region of this gene by PVX favored tospovirus infection. As this effect was observed both for 5 ́ sense and anti- sense constructions it is possible that it has been caused by reduction on mRNA levels by gene silencing, although Northern blot analysis did not agree with this hypothesis. An Sw-5 homolog was cloned from LA371-20 accession. This homolog is localized in or near of Sw-5 locus and segregated with tospovirus resistance. The capacity of this and other three homologs originated from others accessions to confer tospovirus resistance was evaluated in tobacco and tomato transgenic plants. All the transformants were susceptible to the virus. Other homologs presents in the different accessions evaluated may be responsible for the resistance, although problems in the structure of the constructions can not be discarded. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-08-31T18:20:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1396565 bytes, checksum: f5f608ca59385986a19db71be9e34631 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-31T18:20:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1396565 bytes, checksum: f5f608ca59385986a19db71be9e34631 (MD5) Previous issue date: 2015-07-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fenologia das plantas e a introdução de novas cultivares podem afetar os fatores de mortalidade das pragas. Entre os genótipos mais utilizados nos cultivos de algodão (Gossypium hirsutum) estão as cultivares transgênicas com toxinas da bactéria Bacillus thuringiensis (culturas Bt) e com resistência ao herbicida glifosato (culturas RR). A partir de 2008 tem aumentado a área de plantio de cultivares com essas duas características (algodão Bt-RR). O pulgão Aphis gossypii (Hemiptera: Aphididae) é uma praga importante da cultura do algodão. Nos programas de manejo integrado de pragas é importante a determinação dos estádios críticos e dos fatores chave de mortalidade das pragas devido a eles regularem o tamanho das populações destes organismos. Entretanto, até o momento não existem estudos de determinação dos estádios críticos e fatores chave de mortalidade para A. gossypii e do impacto do algodão Bt-RR sobre estes fatores. Diante disso, esta tese teve por objetivos: (i) identificar e quantificar os fatores de mortalidade natural de A. gossypii, (ii) determinar os estádios críticos e os fatores chave de mortalidade para A. gossypii e (iii) determinar o impacto das fases fenológicas das plantas e do algodão Bt-RR nos fatores de mortalidade natural de A. gossypii. Para tanto, foi conduzida pesquisa de campo durante dois anos (2013 e 2014) em duas etapas. Na primeira etapa foram identificados e quantificados os fatores de mortalidade natural de A. gossypii em cultivo de algodão não transgênico usando tabelas de vida ecológicas. Na segunda etapa foram quantificados os fatores de mortalidade de A. gossypii em algodão Bt-RR e não transgênico nas fases vegetativa, floração e frutificação. O estádio critico de mortalidade de A. gossypii foi ninfas, sobretudo, de primeiro e quarto ínstar. Os predadores, principalmente os Coleoptera: Coccinellidae, seguido pelas chuvas foram os fatores chave de mortalidades de A. gossypii. O algodão Bt-RR e não transgênico tiveram impacto semelhante sobre os fatores de mortalidade de A. gossypii. Em plantas em frutificação foi menor predação de A. gossypii do que em plantas nas fases vegetativa e floração. Em plantas em fase vegetativa a mortalidade de A. gossypii pelas chuvas foi maior do que em plantas em floração e frutificação. Nos períodos chuvosos foi menor a predação de A. gossypii. / The plant phenology and the introduction of new cultivars may affect the mortality factors of the pests. Among the genotypes used in cotton, crops (Gossypium hirsutum) are the transgenic cultivars with toxins from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt crops) and, with resistance to the herbicide glyphosate (RR crops). From 2008, it has increased the cultivars planted area with these two characteristics (Bt-RR cotton). The cotton aphid Aphis gossypii (Hemiptera: Aphididae) is an important pest of cotton crop. In the integrated pest management programs, it is important to determine the critical stages and key factors of mortality of the pests because they regulate the populations size of these organisms. However, so far no studies that determine the critical stages and key factors of mortality for A. gossypii and the impact of Bt-RR cotton on these factors. Therefore, this thesis aimed to: (i) identify and quantify the natural mortality factors of A. gossypii, (ii) determine the critical stages and mortality key factors for A. gossypii and, (iii) determine the impact of plant phenological stages and Bt-RR cotton on the natural mortality factors of A. gossypii. Thus, were conducted a field research for two years (2013 and 2014) in two steps. In the first step identified and quantified the natural mortality factors of A. gossypii in non-transgenic cotton cultivar using ecological life tables. In the second step were quantified the mortality factors of A. gossypii in Bt-RR cotton and non-transgenic cotton at the vegetative, flowering and fruiting phenological stages. The critical mortality stage of A. gossypii was nymphs, mainly, the first and fourth instars. Predators, especially the Coleoptera: Coccinellidae, followed by rainfall were the key mortality factors of the A. gossypii. The Bt-RR cotton and non-transgenic cotton had a similar impact on the mortality factors of A. gossypii. The plants at fruiting stage the predation of A. gossypii was lower than at vegetative and flowering stages. At the vegetative plants stage the mortality of A. gossypii by rain was higher than at flowering and fruiting plant stages. During rainfall periods, the predation of A. gossypii was lower.

Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) e Pseudoplusia includens (Walker) são importantes insetos-praga no algodoeiro (Gossypium hirsutum L.) devido às injúrias de desfolha e destruição de estruturas reprodutivas no caso de S. frugiperda. Os eventos de algodão Bt que expressam as proteínas Cry1Ac/Cry2Ab2 (Bollgard® II) e Cry1Ac/Cry1F (WideStrike(TM)) de Bacillus thuringiensis Berliner são ferramentas disponíveis para o controle dessas espécies-praga. A fim de subsidiar o Manejo da Resistência de Insetos (MRI) foram conduzidos estudos em laboratório para avaliar a sobrevivência e desenvolvimento de S. frugiperda e P. includens nos eventos de algodão Cry1Ac/Cry2Ab2 e Cry1Ac/Cry1F. Em bioensaios com discos de folhas, a eficácia de controle de neonatas nos dois eventos de algodão Bt foi superior a 80% para S. frugiperda e de 100% para P. includens. Em bioensaios com brácteas com neonatas de S. frugiperda, a eficácia de controle de ambos os eventos de algodão Bt também foi superior a 80%. As lagartas de S. frugiperda sobreviventes em algodão Bt apresentaram severa inibição de desenvolvimento larval em folhas (> 75%) e brácteas (> 44%). Em bioensaios com simulações de alimentação larval, as quais consistiam em grupos de lagartas alimentadas com o algodão Bt aos 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 dias após a inoculação (DAI), S. frugiperda e P. includens demonstraram que a suscetibilidade dessas espécies diminuiu com o avançar do desenvolvimento larval. Para S. frugiperda, em todas as simulações de alimentação com o algodão Cry1Ac/Cry2Ab2 houve lagartas que atingiram as fases de pupa e adulto. Por outro lado, quando expostas ao algodão Cry1Ac/Cry1F, somente algumas das lagartas de 5º e 6º ínstares atingiram as fases de pupa e adulto. Para P. includens, somente lagartas no 6º ínstar atingiram as fases de pupa e adulto quando alimentadas com os dois eventos de algodão Bt. Os parâmetros biológicos de S. frugiperda sobreviventes em algodão Cry1Ac/Cry2Ab2 foram afetados negativamente com aumento da duração da fase larval (? 9 dias), baixa viabilidade larval (1,4%) e de insetos que completaram o ciclo biológico (0,9%), aumento no intervalo entre gerações (? 9 dias) e redução da taxa intrínseca de crescimento populacional (? 83%). Os eventos de algodão Cry1Ac/Cry2Ab2 e Cry1Ac/Cry1F são promissores no controle de S. frugiperda e P. includens. No entanto, a atividade inseticida dos dois eventos de algodão Bt em lagartas de S. frugiperda e P. includens diminui com o desenvolvimento larval e essa constatação deve ser considerada em programas de MRI, especialmente na disposição espacial do refúgio. / Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) and Pseudoplusia includens (Walker) are important insect pests in cotton (Gossypium hirsutum L.) due to damage on leaves and reproductive structures in the case of S. frugiperda. The events of Bt cotton expressing proteins Cry1Ac/Cry2Ab2 (Bollgard® II) and Cry1Ac/Cry1F (WideStrike(TM)) from Bacillus thuringiensis Berliner are tools available to control these pest species. To develop an Insect Resistance Management (IRM), we performed laboratory studies to evaluate the survival and development of S. frugiperda and P. includens. In fresh leaf discs bioassays, the control efficacy of neonates in both Bt cotton events was greater than 80% mortality for S. frugiperda and 100% for P. includens. In fresh bracts bioassays to neonates of S. frugiperda, the control efficacy of both Bt cotton events was over 80%. The surviving larvae of S. frugiperda in Bt cotton showed severe growth inhibition (weight and instar) in leaves (> 75%) and bracts (> 44%). In simulations feed bioassays with larvae, which consisted of groups of larvae fed on Bt cotton at 0, 3, 6, 9, 12, 15 and 18 days after inoculation (DAI), S. frugiperda and P. includens showed that the susceptibility of species decreases with advancing larval development. For S. frugiperda, in all feed simulations with cotton Cry1Ac/Cry2Ab2 had caterpillars that reached pupae and adult stages. Moreover, when exposed to cotton Cry1Ac/Cry1F, only some caterpillars of 5th and 6th instars reached pupae and adult stages. For P. includens, only some caterpillars of 6th instar reached pupae and adult stages when fed with two events of Bt cotton. The biological parameters of S. frugiperda fed on cotton Cry1Ac/Cry2Ab2 were negatively affected with increasing duration of the larval stage (? 9 days), reduced larval viability (1,4%) and insects that completed the life cycle (0,9%), increased the generation time (? 9 days) and decreased the intrinsic rate of increase (? 83%). The events of cotton Cry1Ac/Cry2Ab2 and Cry1Ac/Cry1F are promising for the control of S. frugiperda and P. includens. However, the insecticidal activity of both events of Bt cotton in larvae of S. frugiperda and P. includens decreases through larval development and this finding should be considered in programs of MRI, especially in the spatial arrangement of the refuge.

A soja geneticamente modificada MON 87701 × MON 89788, Glycine max (L.) Merrill, que expressa genes que codificam a proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner e a proteína 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase de Agrobacterium sp., foi liberada para uso comercial no Brasil em 2010. Para subsidiar um programa de Manejo da Resistência de Insetos (MRI) foi realizada a avaliação de risco de evolução de resistência a Cry1Ac para as pragas-alvo primárias, Anticarsia gemmatalis Hübner e Pseudoplusia includens (Walker), a praga-alvo secundária Heliothis virescens (Fabricius) e as pragas nãoalvo Spodoptera cosmioides (Walker), Spodoptera eridania (Stoll) e Spodoptera frugiperda (J. E. Smith). Em bioensaios com a proteína Cry1Ac purificada incorporada em dieta artificial, verificou-se que Cry1Ac foi extremamente ativa para A. gemmatalis [CL50 (IC 95%) = 0,23 (0,15 - 0,34) g Cry1Ac/mL de dieta], P. includens [CL50 (IC 95%) = 3,72 (2,65 - 4,86) g Cry1Ac/mL de dieta] e H. virescens [CL50 (IC 95%) = 0,026 (0,021 - 0,033) g de Cry1Ac/mL de dieta]. Em contraste, na máxima concentração testada de 100 g Cry1Ac/mL de dieta, S. cosmioides e S. eridania apresentaram mortalidade < 13%, e S. frugiperda de » 50%. Em bioensaios com tecido liofilizado de soja MON 87701 × MON 89788, diluído 25 vezes em dieta artificial, houve 100% de mortalidade para A. gemmatalis e H. virescens e até 96% para P. includens. Entretanto, as lagartas sobreviventes de P. includens apresentaram enfezamento larval > 95%. Em bioensaios com discos de folha em laboratório (para A. gemmatalis, P. includens e H. virescens), vagens (para H. virescens) e elevada infestação em condições de casa de vegetação e de infestação natural em campo (para A. gemmatalis e P. includens) foram obtidas alta eficácia da soja MON 87701 × MON 89788 no controle das pragas-alvo primárias e secundária. Por outro lado, a soja MON 87701 × MON 89788 apresentou baixa eficácia para S. cosmioides e S. eridania (mortalidade < 7%) e atividade intermediária para S. frugiperda (32 a 47% mortalidade). A soja MON 87701 × MON 89788 não afetou os parâmetros biológicos de S. cosmoides e S. eridania. Para S. frugiperda houve prolongamento da fase larval (» 5 dias), menor viabilidade larval e total, aumento no intervalo entre gerações (» 8 dias) e redução na taxa intrínseca de crescimento (» 41%). No contexto do MRI, a soja MON 87701 × MON 89788 expressa a proteína Cry1Ac em níveis que constituem alta dose para A. gemmatalis e H. virescens, e muito próximo a alta dose para P. includens. Por outro lado, para as espécies de Spodoptera, a soja MON 87701 × MON 89788 é um evento de baixa dose, pois permite que indivíduos suscetíveis completem o ciclo biológico. Em termos de MIP, a soja MON 87701 × MON 89788 apresenta um elevado nível de controle de A. gemmatalis, P. includens e H. virescens. No entanto, a soja MON 87701 × MON 89788 não ocasiona controle efetivo de espécies de Spodoptera. As informações obtidas no presente trabalho contribuirão para subsidiar programas de MRI e preservar a durabilidade dessa tecnologia para o MIP-Soja no Brasil. / Genetically modified MON 87701 × MON 89788 soybean, Glycine max (L.) Merrill, expressing genes that code for the Cry1Ac protein of Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner and the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase protein of Agrobacterium sp., has been registered for commercial use in Brazil in 2010. To develop a program of Insect Resistance Management (IRM) for this event, we conducted resistance risk assessment to the primary target pests, Anticarsia gemmatalis Hübner and Pseudoplusia includens (Walker), the secondary target pest Heliothis virescens (Fabricius) and the non-target pests Spodoptera cosmioides (Walker), Spodoptera eridania (Stoll) and Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) to the Cry1Ac protein. In bioassays with purified Cry1Ac protein incorporated into artificial diet, Cry1Ac was highly active for A. gemmatalis [LC50 (95% FL) = 0.23 (0.15 - 0.34) g Cry1Ac/mL of diet], P. includens [LC50 (95% FL) = 3.72 (2.65 - 4.86) g Cry1Ac/mL of diet] and H. virescens [LC50 (95% FL) = 0.026 (0.021 - 0.033) g Cry1Ac/mL of diet]. In contrast, even at the highest concentration tested of 100 g Cry1Ac/mL of diet, the mortality observed to S. cosmioides and S. eridania was < 13% and to S. frugiperda was » 50%. In bioassays with freeze-dried MON 87701 × MON 89788 soybean tissue, diluted 25 times in artificial diet, there was 100% mortality to A. gemmatalis and H.virescens and up to 96% for P. includens. However, the surviving P. includens larvae showed > 95% larval stunting. In bioassays with leaf discs in the laboratory to (A. gemmatalis, P. includens and H. virescens), pods (H. virescens), high pest infestation studies under greenhouse conditions and in natural infestation in the field (to A. gemmatalis and to P. includens) showed a very high level of efficacy against these primary and secondary target pests. On the other hand, soybean MON 87701 × MON 89788 showed low efficacy to S. cosmioides and S.eridania (mortality < 7%), and intermediate activity to S. frugiperda (32 to 47% of mortality). MON 87701 × MON 89788 soybean did not affect the biological parameters of S. cosmoides and S. eridania. For S. frugiperda, the larval stage was prolonged (» 5 days), with reduction on larval and total viability, increase in generation time (» 8 days) and reduction in the intrinsic rate of increase (» 41%). In the context of IRM, MON 87701 × MON 89788 soybean expresses the Cry1Ac protein at levels that are high-dose for A. gemmatalis and H. virescens, and near to the highdose for P. includens. On the other hand, for the Spodoptera species, MON 87701 × MON 89788 soybean is a low-dose event, because it allows susceptible individuals to complete larval developement. In terms of IPM, MON 87701 × MON 89788 soybean provided a high level of control of A. gemmatalis, P. includens and H. virescens. However, MON 87701 × MON 89788 soybean was not effective to control Spodoptera species. The information obtained in this research will contribute to develop IRM programs and to preserve the durability of this technology for soybean IPM in Brazil.

A broca-da-cana Diatraeasaccharalis(Fabricius) é uma das pragas-alvo do milho geneticamente modificado que expressagene(s) que codifica(m) proteína(s) de BacillusthuringiensisBerliner(milho Bt) no Brasil. Para estabelecer estratégias proativas de manejo de resistência, os objetivos do presente trabalho foram (1)estabelecer linhas-básicas de suscetibilidade à proteína Cry1F de B. thuringiensisem populações de D. saccharalis coletadas nas principais regiões produtoras de milho no Brasil na safra de 2010/2011, (2) realizar monitoramentoda suscetibilidade de populações de D. saccharalis na safra 2011/2012 e (3) avaliar a atividade biológica do milho Bt (evento TC1507) em diferentes estádios fenológicos no controle de D. saccharalis em condições laboratoriais. Para a caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade foram realizados bioensaios com a proteína purificada Cry1F aplicada superficialmente em dieta artificial.As CL50 de Cry1F estimadas variaram de 0,47 a 7,02 ng de Cry1F/ cm2 dieta artificial para as populações avaliadas (variação de ?15 vezes). Foi definida e validada a concentração diagnóstica de 112 ng de Cry1F/cm²,baseada na estimativa da CL99 das populações testadas para o monitoramento da suscetibilidade. A avaliação da atividade biológica de milho Bt (evento TC1507) foi realizada com dois híbridos (Pioneer 30F35 e Dow 2B688) nos estádios fenológicos V3, V6 e V9 e em duas épocas de plantio. Alta atividade de controle de D. saccharalis foi obtida para os dois híbridos de milho Bt nos diferentes estádios fenológicos e épocas de plantio. Portanto, verificou-se que a espécie D. saccharalis é altamente suscetível à proteína Cry1F. Contudo, a implementação de estratégias de manejo da resistência é de fundamental importância para preservar a vida útil da tecnologia de milho Bt como importante ferramenta em programas de MIP. / The sugarcane borer Diatraeasaccharalis (Fabricius) is one of the target pests of genetically modified maizeexpressinggenes that code for insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis Berliner (Bt maize) in Brazil. To implement proactive resistance management strategies, we leaded studies (1) to establish baseline susceptibility to Cry1F protein from B. thuringiensis in populations of D. saccharalis collected from major maize production regions in Brazil during 2010/2011 growing season, (2) to leadsusceptibility monitoring in populations of D. saccharalis collected in 2011/2012 growing season, and (3) to assess the biological activity of Bt maize (event TC1507) at different growth stages forD. saccharaliscontrol under laboratory conditions. The baseline susceptibility wascharacterizedwith purified protein Cry1F applied superficially on artificial diet. The estimatesof LC50 of Cry1F ranged from 0.47 to 7.02 ng Cry1F/cm2of artificial diet for the populations evaluated (? 15-fold variation).A diagnostic concentration of 112 ng Cry1F/cm ² was defined and validated for monitoring the susceptibility based on estimation of CL99 of all tested populations. The biological activity of Bt maize (event TC1507) was assessed by using two hybrids (Pioneer 30F35 and Dow 2B688) at growth stages V3, V6 and V9 and two planting seasons. High level of D. saccharaliscontrol was obtained for the twoBt maize hybrids at different growth stages and planting seasons. Therefore, we conclude that D. saccharalis is highly susceptible to Cry1F protein. However, implementation of insect resistance management strategies is essentialin order to preserve the lifetime of Bttechnology as an important tool in IPM programs.

O presente estudo objetivou identificar as interações do Algodão Bt que expressa Cry1Ac (Bollgard®), com o predador Podisus nigrispinus Dallas (Hemiptera: Pentatomidae), no manejo da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) a lambda-cyhalothrin em duas condições: ausência e presença do inseticida imidacloprid. Foram utilizadas lagartas de S. frugiperda provenientes das seguintes condições: linhagens resistentes (1) e suscetíveis (2) a lambda-cyhalothrin alimentadas de folhas de algodoeiro Bollgard® (DP 404 BG); e linhagens resistentes (3) e suscetíveis (4) a lambda-cyhalothrin alimentadas de folhas de algodoeiro não transgênico (cultivar DP4049). Os resultados dessa pesquisa revelaram que na ausência de imidacloprid, independente do tratamento, o comportamento de predação foi melhor representado pelo tipo III de resposta funcional, pois a taxa de ataque aumentou linearmente em todas as condições estudadas (a= bN). Houve diferenças entre o tempo de manipulação (Th) de fêmeas do predador que receberam lagartas suscetíveis a lambda-cyhalothrin, previamente alimentadas de algodão não transgênico, em relação aos demais tratamentos. Na densidade de 16 lagartas/predador, o número de lagartas predadas por fêmeas de P. nigrispinus foi significativamente superior em lagartas resistentes a lambda-cyhalothrin, alimentadas de algodão Bt ou não Bt, em relação às lagartas suscetíveis alimentadas de algodão não Bt. Além do mais, se constatou que quando foram ofertadas 16 lagartas de S. frugiperda ao predador, o número de indivíduos predados foi significativamente inferior em lagartas suscetíveis a lambda-cyhalothrin que foram alimentadas de algodão não Bt, em relação as que receberam lagartas previamente alimentadas de algodão Bt. Na presença de imidacloprid, constatou-se que o comportamento de predação de P. nigrispinus foi afetado pelo neonicotinóide imidacloprid, sendo a curva assintótica do tipo II, a que melhor descreveu os dados da sua resposta funcional. Na presença de imadacloprid, o tempo de manipulação (Th) de fêmeas do predador não diferiu entre os tratamentos estudados. Todavia, a taxa de ataque foi representada por um decréscimo em função do aumento da densidade de lagartas ofertadas. Independente do tratamento (linhagem de S. frugiperda ou cultivar de algodão), o número de lagartas de S. frugiperda predadas por fêmeas de P. nigrispinus quando na exposição ao imidacloprid, foi significativamente inferior, especialmente na densidade de 16 lagartas/predador. Diante destes resultados, a pesquisa reforça que o custo adaptativo associado à resistência a lambda-cyhalothrin, assim como a cultivar de algodão Bt afetaram a taxa de predação de lagartas de S. frugiperda por fêmeas de P. nigrispinus, somente na maior densidade testada (16 lagartas/predador). O comportamento de predação de lagartas de S. frugiperda por fêmeas de P. nigrispinus foi negativamente afetado pelo inseticida imidacloprid. / This study aimed to identify the interactions of Bt cotton expressing Cry1Ac (Bollgard®), with the predator Podisus nigrispinus Dallas (Hemiptera: Pentatomidae), in resistance management of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) to lambda-cyhalothrin in two conditions: absence and presence of the insecticide imidacloprid. Larvae of S. frugiperda were used from the following conditions: resistant (1) and susceptible (2) strains to lambda-cyhalothrin fed Bollgard® cotton leaves (DP 404 BG); and resistant (3) and susceptible (4) strains to lambda-cyhalothrin fed non-transgenic cotton leaves (cultivar DP4049). The results of this study revealed that in the absence of imidacloprid, independent of treatment, the behavior of predation was best represented by the type III of functional response, because the attack rate increased linearly in all conditions studied (a = bN). There were differences between the handling time (Th) of females of the predator who received larvae of S. frugiperda susceptible to insecticides previously fed non-transgenic cotton in relation to other treatments. The density of 16 larvae/predator, the number of larvae preyed by female of P. nigrispinus was significantly higher in larvae of S. frugiperda resistant to lambda-cyhalothrin, fed on Bt cotton or non-Bt compared to susceptible larvae fed non Bt cotton. Moreover, when we offered 16 larvae of S. frugiperda to the predator, the number of larvae predate were significantly lower in larvae susceptible to lambda-cyhalothrin that were fed non-Bt cotton, compared to larvae that were previously fed on transgenic cotton. In the presence of imidacloprid, the predatory behavior of P. nigrispinus was affected by the neonicotinoid imidacloprid, and the asymptotic curve type II was the one that best described the data of the functional response. In the presence of imadacloprid, handling time (Th) of females of the predator did not differ among treatments. However, the attack rate was represented by a decrease due to the increase of the density of larvae offered. Regardless of the treatment (strain of S. frugiperda or cultivar of cotton), the predation larvae of S. frugiperda by females of P. nigrispinus when exposed to imidacloprid was significantly lower, especially at density of 16 larvae/predator. Given these results, the research reinforces the fitness cost associated to lambda-cyhalothrin resistance as well as Bt cotton affected the rate of predation on larvae of S. frugiperda by females of P. nigrispinus, only at the highest density tested (16 larvae/predator). The behavior of predation on larvae of S. frugiperda by females of P. nigrispinus was affected by insecticide imidacloprid.

No Brasil, doenças causadas pelo Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) reduzem a produção e a qualidade dos frutos de abobrinha-de-moita (Cucurbita pepo) e melancia (Citrullus lanatus), assim como em outras cucurbitáceas. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de abobrinha-de-moita e melancia resistentes ao PRSV-W e ao ZYMV. Um sistema eficiente de regeneração in vitro é necessário para a obtenção de plantas transgênicas. O sistema de organogênese in vitro de abobrinha-de-moita foi desenvolvido utilizando como explantes a região basal do cotilédone e um segmento do hipocótilo obtidos a partir de sementes germinadas in vitro. Os explantes foram cultivados em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com diferentes concentrações de BAP (benzilaminopurina). A indução de gemas adventícias foi mais eficiente nas concentrações de 1,0 e 1,25 mg/L de BAP. Este protocolo foi usado para regenerar plantas em experimentos de transformação genética de abobrinha-de-moita cv. Caserta e melancia cv. Crimson Sweet, via Agrobacterium tumefaciens. O vetor binário pCAMBIA2201, contendo fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e do PRSV-W, numa construção gênica do tipo hairpin e o gene de seleção nptII, sob controle do promotor 35S, foi usado nos experimentos de transformação genética. Após 2 dias de co-cultivo, em meio de cultura MS, suplementado com BAP (1 mg/L), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção, suplementado com BAP (1 mg/L), timentin (400 mg/L) e canamicina (100 mg/L) e cultivados por 3 a 4 semanas, sob fotoperíodo de 16 horas de luz. Plantas regeneradas foram analisadas por PCR, usando primers específicos para detecção dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do PRSV-W e ZYMV. Foram utilizados 1050 explantes de abobrinha-de-moita e de 973 explantes de melancia, resultando em 36 e 59 plantas PCR positivas, respectivamente. A eficiência de transformação foi de 3,4% para abobrinha-de-moita e 6,1% para melancia. Plantas PCR positivas foram aclimatizadas, gradualmente, em sala de luz e transferidas para casa-de-vegetação. Pela análise de Southern blot foi confirmada a integração dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e PRSV-W em 3 plantas de abobrinha-de-moita. Depois de desenvolvidas, flores femininas foram polinizadas manualmente e sementes foram coletadas de frutos maduros. Plantas R1 de abobrinha-de-moita e melancia foram inoculadas com o PRSV-W e o ZYMV por meio de Myzus nicotianae virulíferos. Não foram identificadas, até o momento, plantas resistentes aos patógenos em estudo / Diseases caused by the potyviruses Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) significantly reduce the yield and fruit quality of zucchini squash (Cucurbita pepo), watermelon (Citrullus lanatus), as well as other cucurbit crops in Brazil. The purpose of this work was to obtain zucchini squash and watermelon transgenic plants resistant to PRSV-W and ZYMV. An efficient in vitro regeneration system which can be associated with the protocol is necessary to obtain transgenic plants. In vitro organogenesis system was successfully developed using comprised of distal region of hypocotyl and the base of cotyledon of a germinated seed. The explants were cultured in MS medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962), supplemented with different concentraction of BAP (benzylaminopurine). The induction of adventitious buds was more efficient at concentrations of 1.0 and 1.25 mg.L-1 BAP. This protocol was used to regenerate plants from genetic transformation experiments with zucchini squash cv. Caserta and watermelon cv. Crimson Sweet via Agrobacterium tumefaciens. For transformation, the binary vector pCAMBIA 2201, containing sequences of the coat protein coding regions of ZYMV and PRSV-W in a hairpin construct and the nptII gene, driven by 35S promoter was used. After 2 days of co-culture in MS medium supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), explants were transferred to the MS selection culture medium, supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), timentin (400 mg.L-1) and kanamycin (100 mg.L-1), and incubated for 3 to 4 weeks at 27 oC, under 16 h photoperiod. Regenerated plants were analyzed by PCR, using specific pairs of primers for the detection of the coat protein gene segments of PRSV-W and ZYMV. A total of 1,050 zucchini squash and 973 watermelon explants were used in the transformation experiments, resulting in 36 and 59 PCR positive plants, respectively. The genetic transformation efficiency was 3.4% for zucchini squash and 6.1% for watermelon. The PCR positive plants were slowly acclimatized in the culture room and transferred to the greenhouse for further growth. Southern blot analysis confirmed the genome integration of the the ZYMV and PRSV-W coat protein gene fragments in three zucchini squash plants which survived the acclimatization step. Later in development, female flowers were were manually pollinated and seeds were collected from mature fruits. R1 transgenic zucchini squash and watermelon plants were inoculated with PRSV-W and ZYMV by means of viruliferous Myzus nicotianae. Resistant plants were not yet observed among the R1 plants available

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T01:42:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_M.pdf: 2208429 bytes, checksum: 860e813410e0f18d21e22d51ca77e727 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os trabalhos realizados utilizando plantas transgênicas como biorreatores para produção de proteínas recombinantes indicam que a cano Ia, o milho e a soja são candidatos de grande potencial. Apesar da semente de soja e suas proteínas serem sistemas bem estudados, não existem estudos sistemáticos e comparativos sobre da utilização da soja como um biorreator, no tocante à extração e purificação de proteínas recombinantes. Até hoje, segundo a literatura consultada, só existe uma tentativa de usar soja como biorreator (Russel et al., 2005), mas por causa da baixa expressão da proteína recombinante (hormônio de crescimento humano), este estudo aparentemente não teve continuidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar, sob o ponto de vista de recuperação (extração) e purificação, sementes de soja como biorreatores para produção de proteínas recombinantes, usando b-glucuronidase recombinante (rGUS) como proteína modelo / Abstract: The work done on the field of using trasgenic plants as bioreactors indicates the soybean, canola and corn as a plants of choice. Although the extraction and purification of soybean seed proteins is well studied and the plant is relatively easy to transform, there is practically no study done with transgenic soybean seeds expressing recombinant proteins in terms of downstream processing. To our knowledge, soybean was used to produce human growth hormone (Russel et al., 2005), but the study of purification was not done due to the low expression level of that recombinant protein. The objective of this work to evaluate the soybean seeds, in terms of recuperation (extraction) and purification, as a bioreactor for production of recombinant proteins using b-glucuronidase (rGUS) as a model protein / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Os efeitos do algodoeiro geneticamente modificado Bollgard®, que expressa a toxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis (Bt), em artrópodes não-alvo, foram avaliados através de estudos conduzidos em laboratório e em campo. Avaliações da abundância de artrópodes em algodoeiro Bollgard® (Delta Pine 90) e em sua isolinha (Acala 90) foram conduzidas durante três anos agrícolas consecutivos, sendo o primeiro estudo conduzido em Leme-SP (2005/2006) e os dois anos seguintes em Piracicaba-SP (2006/2007 e 2007/2008). Foram realizadas amostragens dos organismos da superfície do solo, através de armadilhas do tipo pitfall (14 coletas), e de artrópodes da mesofauna dos cinco centímetros superficiais do solo coletados com cilíndros metálicos e extraídos em equipamento do tipo Berlese-Tullgren modificado (16 coletas) e de organismos da parte aérea presentes nas folhas (17 amostragens de folhas apicais e 12 de folhas medianas). Foram processados 27.420 organismos das armadilhas do tipo pitfall e 297.696 extraídos por Berlese-Tullgren modificado. Os principais grupos de organismos coletados nos dois tipos de armadilhas foram Acari (Oribatida, Mesostigmata, Prostigmata, Astigmata e outros), Collembola e Formicidae. Chilopoda, Diplura e outros artrópodes (Aranae e larvas de insetos) também foram comuns nas extrações por Berlese-Tullgren modificado, enquanto Coleoptera (Nitidulidae, Carabidae, Staphylinidae, Mycetophagidae e outros) foram abundantes em pitfall. Embora em algumas amostragens tenham sido observadas diferenças significativas na abundância de alguns grupos de organismos edáficos, entre as parcelas com algodoeiro Bt e parcelas com a isolinha, estas diferenças não foram constantes em datas de amostragem de um mesmo ano e/ou não foram detectadas em diferentes anos agrícolas. A dinâmica de quatro espécies de oribatídeos foi monitorada durante os três anos agrícolas e revelou uma maior prevalência de Scheloribates praeincisus, seguido de Galumna glabra, Protoribates sp. e P. praeoccupatus, sendo que a proporção destas últimas três espécies variou em função do ano de coleta. As densidades populacionais de mosca-branca (Aleyrodidae) e de tripes (Thysanoptera) foram semelhantes entre as áreas com algodoeiro Bt e com sua isolinha. A densidade populacional de pulgões (Aphidoidea) foi maior no algodoeiro Bt do que na isolinha somente em cinco das 29 coletas. A abundância de ácaros predadores fitoseídeos foi menor no algodoeiro Bt do que na isolinha em três coletas enquanto a abundância de ácaros fitófagos da família Tetranychidae foi maior no algodoeiro Bt em seis coletas. Uma espécie de Tetranychidae, Mononychellus planki, e outra de Phytoseiidade, Neoseiulus californicus, foram selecionadas para análise comparativa da biologia destes em algodoeiro Bt e na sua isolinha. Não foram detectadas diferenças na duração da fase imatura de M. planki e na biologia de N. californicus no algodoeiro Bt em relação à isolinha. Em geral, não há evidências de que a abundância de artrópodes nos três anos agrícolas tenha sido alterada pelo cultivo do algodoeiro geneticamente modificado Bollgard®. / The effects of the genetically modified cotton (Bollgard®) expressing Bacillus thuringiensis (Bt) Cry1Ac toxin on non-target arthropods was evaluated under laboratory and field studies. Evaluations of arthropod abundance on Bollgard® cotton (Delta Pine 90) and on its isoline (Acala 90) were carried out during three consecutive field seasons. The first study was conducted in Leme-SP (2005/2006) and the following two field seasons were conducted in Piracicaba-SP (2006/2007 and 2007/2008). Soil surface organisms were collected using pitfall traps (14 samples). Mesofauna arthropods from the 5-cm soil surface were collected with metallic cylinders and extracted with modified Berlese-Tullgren equipment (16 samples). From the aerial portion of the plant, arthropods were sampled from leaves (17 samples from apical leaves and 12 samples from median leaves). From the pitfall traps and from the modified Berlese-Tullgren 27,420 and 297,696 organisms, respectively, were collected. The main arthropod groups collected in both types of traps were Acari (Oribatida, Mesostigmata, Prostigmata, Astigmata among others), Collembola and Formicidae. Chilopoda, Diplura and other arthropods (Aranae and insect larvae), were also common in extractions of the modified Berlese-Tullgren, while the pitfall traps revealed also abundance of Coleoptera (Nitidulidae, Carabidae, Staphylinidae, Mycetophagidae and others). Although, among some samples, we had observed significant differences in abundance of some soil organisms between Bt-cotton and isoline plots, these differences were not constant among sample dates from the same year and/or were not detected among different field seasons. Population dynamics of four oribatidae species was monitored during all field seasons and revealed major prevalence of Scheloribates praeincisus, followed by Galumna glabra, Protoribates sp. and P. praeoccupatus. However, the proportion of these last three species varied among field seasons. Population density of whiteflies (Aleyrodidae) and thrips (Thysanoptera) were not different between Bt-cotton and isoline plots. In five out of 29 sample dates, population density of aphids (Aphidoidea) was lower on Bt-cotton than on its isoline. Abundance of Phitoseiidae predatory mites was smaller on Bt cotton than on its isoline in three samples, while the abundance of Tetranychidae phytophagous mites was higher on Bt cotton in six samples. The biology of one species of Tetranychidae, Mononychellus planki, and one species of Phytoseiidade, Neoseiulus californicus, was investigated on Bt cotton and on its isoline. We did not detect any significant differences in duration of immature phase of M. planki and on the biology of N. californicus between cotton genotypes. In general, throughout three field seasons, there was no evidence that the abundance of arthropods has been altered by genetically modified Bollgard® cotton.