Embora desfrute de inegável importância econômica, os citros estão sujeitos a muitos problemas sanitários sendo alguns, limitantes para o cultivo como é o caso das doenças causadas por vírus. A morte súbita dos citros é uma doença relacionada à combinação copa/ porta-enxerto e manifesta sintomas na região da enxertia sobre porta-enxertos intolerantes. Embora sua etiologia não tenha sido determinada, há indicações que a causa da MSC esteja relacionada a uma estirpe do vírus da tristeza dos citros (CTV), a um vírus do gênero Marafivirus, ou a uma associação entre eles. Uma vez que a transformação genética têm sido considerada como uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento de citros, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus e estudar a regeneração e obtenção de plantas in vitro de laranja azeda, via organogênese, visando futuros trabalhos de transformação genética. Experimentos para indução da organogênese in vitro foram realizados avaliando-se citocininas (BAP, TDZ e CIN), em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação com ANA, condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 h e escuro por 30 dias), meios de cultivo e explantes (provenientes de plantas germinadas in vitro e de plantas mantidas em estufa). Além disso, avaliou-se o enraizamento dos brotos regenerados. Para a transformação genética, explantes de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' foram inoculados e co-cultivados com a estirpe EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene da replicase do Marafivirus (em seqüência sense e antisense interligadas por um íntron). A construção gênica foi elaborada a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e terminador NOS, contendo ainda o gene de seleção nptII. A transformação foi confirmada por análises de PCR e \'Southern blot\'. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e \'northern blot\'. A adição de BAP, combinada ou não com ANA, e em combinações com CIN ao meio de cultivo, assegurou maior formação de gemas adventícias em segmentos de epicótilo de laranja azeda. Entretanto, TDZ não se mostrou favorável a essa resposta, que também é afetada pela ausência de luz. Os explantes provenientes do cultivo in vitro mostraram-se mais favoráveis à resposta organogênica. O enraizamento das brotações de laranja azeda regeneradas foi obtido no meio MT com metade da concentração de sais, sem ou com auxinas. Foi possível obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e de laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus utilizando-se segmentos internodais como explantes. A análise de \'Southern blot\' confirmou a integração de um a quatro eventos de inserção do transgene no genoma das plantas. A transcrição do gene da replicase do Marafivirus e do gene nptII foi observada por RT-PCR. / In spite of great economic importance, the citrus industry is affected by many phytopathological problems some, limiting its cultivation such as virus-caused diseases. The citrus sudden death disease is related to scion/rootstock combinations and manifests symptoms in the grafting area of intolerant rootstocks. Although its etiology has not been determined, there are indications that the cause of MSC might be related to a strain of the Citrus tristeza virus (CTV), to a virus of the Marafivirus group, or to an association of both viruses. Since the genetic transformation has been considered as an auxiliary tool to programs of citrus improvement, the objectives of this work were to obtain transgenic plants of the Rangpur lime and Valencia sweet orange containing the Marafivirus replicase gene and study the in vitro regeneration of sour orange plants through organogenesis, aiming for future work in genetic transformation. Experiments for induction of in vitro organogenesis were carried out evaluating citocinins (BAP, TDZ and KIN), in different concentrations, separately or in combination with NAA, lighting conditions (photoperiod of 16 hours and darkness for 30 days), cultivation media and explants (coming from in vitro germinated plants and from green house cultivated plants). Besides this, rooting of the regenerated shoots was evaluated. For the genetic transformation, Rangpur lime and Valencia sweet orange explants were inoculated and co-cultivated with the EHA-105 Agrobacterium tumefaciens strain containing the Marafivirus replicase gene (in sense and antisense sequence linked by an intron). The genetic construct used derived from the pCAMBIA 2201 plasmid, driven by the 35S promoter and NOS terminator, containing the selection nptII gene. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and northern blot. The addition of BAP to the culture medium, combined or not with NAA, and in combinations with KIN, assured a greater formation of adventitious buds in sour orange epicotyl segments. However, TDZ was not favorable to this response, that is also affected by the absence of light. Explants coming from in vitro cultivation were more favorable to the organogenic response. Rooting of sour orange regenerated shoots was obtained in MT medium with half the salt concentration, with or without auxin. It was possible to obtain transgenic Rangpur lime and Valencia sweet orange plants containing the Marafivirus replicase gene using internodal segments as explants. The Southern blot analysis confirmed the integration of one to four copies of the transgene in the plant genome. The transcription of the Marafivirus replicase gene and the nptII gene was observed by RT-PCR.

A família PUF é um conjunto de proteínas que se ligam a mRNA regulando sua estabilidade e tradução em processos chave do desenvolvimento. Entre as 25 proteínas de Arabidopsis contendo as repetições PUF, três delas, APUM-I, APUM-2 e APUM-3, apresentam ~90% de identidade e colocalizam temporal e espacialmente nos meristemas apical e axilares de caule, zona de elongação da raiz e no periciclo durante a formação de calos e de raízes laterais, além de estames e polens. Ensaios de RT-PCR mostraram que a relação de expressão entre eles é a mesma em todos os órgãos analisados. Além disso, plantas nocautes apum-1- e apum-2- não apresentam fenótipo alterado, sugerindo redundância funcional. Plantas com a expressão dessas proteínas afetadas por RNA antisense apresentaram folhas cloróticas e reduzidas, raízes mais curtas e menos ramificadas e baixa fertilidade, fenótipo semelhante ao de plantas que superexpressam KRP-2, um inibidor de CDK. O transcrito KRP-2 apresenta um elemento de ligação AraPum no 3\'-UTR sugerindo ser um possível alvo para APUM. Em adição, plantas antisense têm aumento de transcritos KRP-2 em relação a selvagens. Assim, foi proposto que essas proteínas agem coordenando a formação de folhas e raízes pela influência na tradução de KRP-2. A função ancestral das proteínas PUF de manter o ciclo celular em detrimento da diferenciação, parece ser conservada em plantas. / The PUF family is a group of conserved proteins that bind to rnRNAs regulating its stability and translation in key developrnental processes. Among the twenty five Arabidopsis proteins with PUF repeats, we found that three highly similar members, APUM-I, APUM-2 and APUM-3 (~90% identity) and co-localize spatially and temporally in the shoot apical and axillaries meristems, root elongation zone and pericycle during callus and lateral root formation, as well as stamens and pollens. RTPCR assays showed that these proteins have similar expression profiles in ali organs analyzed. Moreover, plant apum-1 and apum-2 knockouts have no detectably altered phenotype, suggesting a functional redundancy between them. Plants in which APUM-I, APUM-2 and APUM-3 expression were reduced through antisense RNA, showed chlorotic and reduced leaves, shorter and less ramificated roots and low fertility. This phenotype is similar to that of plants over-expressing the KRP-2 gene, a CDK inhibitor. An AraPum binding element at 3\'-UTR of the KRP-2 transcript suggests that it may be a possible target for APUM. In addition, in comparison to wild-type plants, antisense plants have increased KRP-2 transcripts levels. We proposed that APUM proteins act by coordinating leaf and root formation by way of influencing KRP-2 transiation. The ancestral function of PUF proteins in the maintenance of the cell cycle, to detriment of differentiation, seems to be conserved in plants.

Os custos adaptativos associados à resistência de insetos a inseticidas podem ser explorados mediante a integração com outras estratégias de controle de pragas em programas de Manejo Integrado de Pragas (MIP). No presente estudo, objetivou-se verificar custos adaptativos associados à resistência de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) ao inseticida piretroide lambda-cyhalothrin e suas implicações na utilização do hospedeiro pelo parasitoide larval Campoletis aff. flavicincta (Hymenoptera: Ichneumonidae) e as interações com milho geneticamente modificado (MON810) que expressa a proteína Cry1Ab de Bacillus thuringiensis Berliner (milho Bt) e na resposta imunológica ao parasitismo por Campoletis aff. flavicincta. Foram verificados presença de custos adaptativos associados à resistência de S. frugiperda a lambda-cyhalothrin, dado o prolongamento no desenvolvimento larval e duração pupal, redução do peso de pupas fêmeas e longevidade das fêmeas, razão sexual, taxa líquida de reprodução (Ro), taxa intrínseca de aumento (rm) e taxa finita de aumento () de insetos resistentes ao inseticida. Não foi verificada diferença na aceitação de lagartas de S. frugiperda suscetível e resistente a lambda-cyhalothrin por Campoletis aff. flavicincta. Entretanto, o parasitismo de lagartas resistentes foi maior que de suscetíveis em estudos de gaiolas com milho Bt e não-Bt. Posteriormente, foram conduzidos estudos para avaliar, por PCR em tempo real, a expressão diferencial de genes associados ao metabolismo (proteína rica em metionina), resposta imunológica (calreticulina, lisozima, colágeno IV-2, hemócito protease-3, serina protease, imunolectina, receptor scavenger classe C) e detoxificação de xenobióticos (glutationa-S-transferase 145 e as monoxigenases P450 Cyp9A31 e Cyp333B2) expressos em diferentes tecidos (tecido adiposo, hemócitos e/ou mesêntero), na ausência e presença de parasitismo de lagartas das duas linhagens de S. frugiperda por Campoletis aff. flavicincta. No geral, a expressão gênica em lagartas suscetíveis foi superior àquela de lagartas resistentes a lambda-cyhalothrin, independente do período de desenvolvimento, do tecido avaliado e da presença ou não do parasitismo por Campoletis aff. flavicincta. E por fim, foram conduzidos estudos para avaliar o efeito da resistência de S. frugiperda a lambda-cyhalothrin nas respostas imunológica celular (contagem total de hemócitos) e humoral (atividade das fenoloxidases, lisozimática e antimicrobiana e concentração de óxido nítrico) de lagartas, tanto na ausência como na presença do parasitismo por Campoletis aff. flavicincta. A resistência de S. frugiperda a lambda-cyhalothrin induziu somente a pequenas alterações no sistema imunológico do hospedeiro (aumento do número total de hemócitos, redução da atividade antimicrobiana e aumento da atividade lisozimática), as quais não interferem a ponto de resultar em custos adaptativos que leve à maior exploração de lagartas resistentes na presença do parasitismo por Campoletis aff. flavicincta. Portanto, o manejo de S. frugiperda mediante o emprego da tecnologia de milho Bt e do controle biológico via parasitoide Campoletis aff. flavicincta pode favorecer o restabelecimento da suscetibilidade de S. frugiperda a lambda-cyhalothrin. / Fitness costs of insect resistance to insecticides can be exploited by integrating other pest control strategies in Integrated Pest Management (IPM) programs. The objective of this research was to evaluate the existence of fitness costs associated with the resistance of Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) to the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and their implications for host use by the larval parasitoid Campoletis aff. flavicincta (Hymenoptera: Ichneumonidae) and interactions with the genetically modified maize (MON810) that expresses Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis Berliner (Bt maize) and in the immune response to parasitization by Campoletis aff. flavicincta. Fitness costs associated to resistance of S. frugiperda to lambda-cyhalothrin were detected by the delay in larval and pupal development, reduction in the pupal weight and longevity of females, sex ratio, net reproductive rate (Ro), intrinsic rate of natural increase (rm) and the finite rate of increase (). No differences were detected in host acceptance and survival of Campoletis aff. flavicincta in susceptible and lambda-cyhalothrin-resistant larvae of S. frugiperda. However, larval parasitization was higher on the resistant than on the susceptible strain of S. frugiperda in cage studies with Bt and non-Bt maize plants. Then, studies were conducted by using Real time-PCR to evaluate the differential expression of genes associated with metabolism (methionine-rich protein), immune response (calreticulin, lysozyme, collagen IV-2, protease-3 hemocyte, serine protease, immunolectin, scavenger receptor class C) and xenobiotic detoxification (glutathione-S-transferase 145 and P450 monooxygenases Cyp9A31 and Cyp333B2) expressed in different tissues (fat body, hemocytes and/or midgut), in the absence and presence of larval parasitization of both strains of S. frugiperda by Campoletis aff. flavicincta. Overall, gene expression in susceptible larvae was higher than that of lambdacyhalothrin- resistant larvae, regardless of the period of development, tissue evaluated and presence or not of parasitization by Campoletis aff. flavicincta. Finally, studies were conducted to evaluate the effect of the resistance of S. frugiperda to lambda-cyhalothrin on cellular (total hemocyte count) and humoral (phenoloxidases, lysozyme and antimicrobial activities and nitric oxide concentration) immune responses in the absence or presence of parasitization by Campoletis aff. flavicincta. The resistance of S. frugiperda to lambdacyhalothrin conferred only minor changes in the host immune system (increased total hemocyte count, reduced antimicrobial activity and increased lysozyme activity), which may not interfere with fitness costs leading to higher exploitation of resistant larvae in the presence of parasitization by Campoletis aff. flavicincta. Therefore, the management of S. frugiperda by using the Bt maize technology and the biological control via parasitoid Campoletis aff. flavicincta can favor the resetting to susceptibility of S. frugiperda to lambda-cyhalothrin.

No Brasil a citricultura está entre as culturas de maior importância. A produtividade dessa cultura no país ainda é considerada baixa e esse fato se deve, em parte, a diversas pragas e doenças. Dentre as doenças, tem-se a tristeza, causada pelo Citrus tristeza virus (CTV). Esse patógeno também pode estar relacionado com outra importante doença da cultura, a morte súbita dos citros (MSC). Com isso, o CTV ganhou ainda maior expressão. Uma alternativa para controlar viroses de plantas é a obtenção de plantas transgênicas resistentes a esses patógenos. Este trabalho objetivou caracterizar com análise molecular e avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja Valência (Citrus sinensis L. Osbeck), contendo fragmentos do genoma do CTV, em três construções gênicas diferentes. A transgenia das plantas foi confirmada por análises de Southern blot. A transcrição do transgene foi avaliada por RT-PCR. O material foi inoculado com duas borbulhas infectadas pelo isolado Pêra- IAC, enxertadas no porta-enxerto abaixo do ponto de enxertia da copa transgênica, e pelo vetor Toxoptera citricida infectado. Após quatro semanas da inoculação, para avaliar a resistência ao vírus, brotações da copa transgênica foram submetidas ao teste de ELISA sanduíche indireto com anticorpo monoclonal contra a proteína da capa protéica do CTV. Os resultados indicaram variação na resistência à translocação do vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos uma das três repetições avaliadas, quando inoculadas por enxertia. Quando inoculadas pelo vetor algumas plantas apresentaram todos os seus clones com baixos valores de absorbância, indicando uma possível resistência ao patógeno. / In Brazil, citrus is one of the most important cultures. The productivity of this culture in the country is still considered low and this fact is due to several pests and diseases that affect the crop. Among the diseases there is the tristeza, caused by Citrus tristeza virus (CTV). This pathogen can also be related with another important disease, the citrus sudden death. Therefore, CTV acquired much more significance. This work aimed to characterize with molecular analysis and to evaluate the resistance to CTV of transgenic Valência plants (Citrus sinensis L. Osbeck), containing genomic fragments of CTV, in three different transgenic constructs. The plants were confirmed as transgenic by Southern blot. The transcription of the transgene was evaluated by RT-PCR. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud inoculation with two infected bubbles, and by the infected vector Toxoptera citricida. After four weeks of inoculation, the evaluation of viral replication in the transgenic seious was done by ELISA indirect sandwich with monoclonal antibody against the CTV coat protein. The results indicated variation of the resistance to the translocation of the virus between the different transgenic constructs used and between clones of the same plant. All the inoculated plants indicated the presence of the virus in, at least, one of the three evaluated clones, when inoculated by grafting. When inoculated by the vector some plants had all their clones with low values of virus, indicating a possible resistance to the pathogen.

O melhoramento genético das plantas cítricas, pelos métodos tradicionais, é dificultado por uma série de características da biologia de reprodução da espécie. Assim a utilização de técnicas modernas de biotecnologia, como a cultura de tecidos, a manipulação genética e a biologia molecular, têm se mostrado atrativas para o melhoramento genético da cultura. O objetivo deste trabalho é avaliar a transformação genética em variedades de laranja doce (Citrus sinensis) usando o gene xylA como gene de seleção. O trabalho foi realizado com a estirpe EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pNOV1457, com o gene xylA. Os isolados da bactéria foram mantidos em meio de cultura YEP suplementado com os antibióticos (ácido nalidíxico, canamicina e estreptomicina). Segmentos de epicótilo foram incubados, por um período de 20 minutos, com a suspensão bacteriana. Após a inoculação, os segmentos foram secos em papel toalha estéril, e incubados em placa de petri (100 x 15 mm) contendo o meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1), em ausência de luz, à temperatura de 24 C, por um período de 3 dias, com acetoseringona e sem acetoseringona durante o cocultivo. Após o co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração, constituído do meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xilose (15 mg.L-1). A transformação genética foi confirmada pela detecção do gene xylA nas plantas regeneradas por PCR. A extração do DNA foi feita pelo método de Dellaporta et al. (1983) e as reações de PCR foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizandose "primers" específicos para detecção do gene xylA. Analisando os dados obtidos verificou-se que foram obtidas plantas transgênicas, utilizando-se o sistema xylA/xilose, de 3 variedades de laranja doce Hamlin, Valência e Natal, com uma eficiência de transformação genética variando de 1 - 3%, em função do experimento e da variedade. A atividade da enzima xilose isomerase foi confirmada pelo teste clorofenol vermelho. Esse trabalho concluiu que é possível a regeneração de plantas transgênicas de variedades de laranja doce utilizando-se o sistema de seleção positiva xylA/xilose. / The genetic improvement of the citric plants, by traditional methods, is made difficult by a series species biology reproduction characteristics. The use of modern biotechnology techniques, as tissue culture, the genetic manipulation and molecular biology, have shown attractive for the culture genetic improvement. The objective of this work was to evaluate the genetic transformation in varieties of sweet orange (Citrus sinensis) using the gene xylA as selection gene. The work was carried out with the EHA 101 Agrobacterium tumefaciens, containing the plasmid pNOV1457, whith the gene xylA. The bacterium was culture in YEP media supplemented with antibiotics (nalidixic acid, kanamicyn e streptomycin). Epicotyl segments were incubated, for 20 min, with the bacterial suspension. After inoculation, the segments were dry in a sterile paper, and incubated in a petri dish (100 x 15mm) containing the medium EME + BAP (1 mg.L-1), in dark, at the temperature of 24 °C, for a period of 3 days, with and without acetoseryngone during the co-culture period. After the co-culture, the explants were transferred to culture medium of selection and regeneration, consisting of medium EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xylose (15 mg.L-1). The genetic transformation was confirmed by the gene detection by PCR. The DNA extraction was done by Dellaporta et al. (1983). PCR reactions were done in a thermal cycler PTC-100 (MJ Research) using specific "primers" for gene xylA detection. The enzyme xilose isomerase activity was confirmed by the red clorofenol test. It is possible to regenerate sweet orange transgenic plants using the positive select system based on xylA gene, of 3 sweer orange varieties Hamlin, Valencia and Natal, with a genetic transformation efficiency of 1-3%.

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças mais ameaçadoras para citricultura mundial e, até o momento, não foi encontrada resistência na base genética do gênero Citrus. A doença é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp., endêmica de floema. Portanto, na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB é desejável avaliar construções gênicas em que o gene de interesse se expresse preferencialmente na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no floema. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens, de citrange Carrizo [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cultivares Hamlin, Valência e Pêra, contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), para verificar se esses promotores regulam a expressão do gene repórter na região do floema. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro e como agente de seleção de regeneração de plantas transgênicas foi utilizado o gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina. Dos brotos regenerados foi coletada uma amostra de material para a realização do ensaio histoquímico com X-GLUC. Os brotos que formaram coloração azulada confirmaram a integração do transgene, sendo esses enxertados em porta enxertos previamente germinados e estiolados in vitro. A partir do número de explantes introduzidos, número explantes responsivos, número de brotos regenerados e número de brotos regenerados GUS positivos calculou-se a eficiência de transformação genética dos experimentos. Para a confirmação da transformação genética de laranja Hamlin foram realizadas análises de PCR e Southern blot de três plantas GUS positivas aclimatizadas. Também foram feitos cortes histológicos manuais para melhor visualização da reação histoquímica de GUS das plantas de laranja Hamlin Southern blot positivas. Todos os experimentos de transformação regeneraram pelo menos um broto GUS positivo. As plantas de laranja Hamlin analisadas por PCR e Southern blot analisadas foram confirmadas como transformadas com uma inserção do transgene. Plantas nas quais foram realizados cortes histológicos indicaram expressão diferencial das construções gênicas no floema. / Huanglongbing (HLB) is one of the most threatening diseases to worldwide citriculture and till the present moment, no resistance has been found in citrus genetic basis. This disease has Candidatus Liberibacter spp. as the pathogenic agent, an endemic phloem bacterium. Therefore, in the search for a transgenic plant resistant to HLB, it is desirable to evaluate constructions in which the gene of interest is expressed, preferentially, in tissues where the bacteria grow, i.e., in the phloem. Therefore, this work aimed to obtain transgenic plants of Carrizo citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck], and of Hamlin, Valencia, and Pera sweet oranges [Citrus sinensis (L.) Osbeck], via Agrobacterium tumefaciens, containing uidA (GUS) gene, controlled by the promoters Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), in order to check if these promoters drive the reporter gene expression in the phloem. For the transformation, in vitro germinated seedlings epicotil segments were used. The gene nptII, which confers resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selective system. From the regenerated shoots, a tissue sample was collected to perform the X-GLUC histochemical analysis. The regenerated shoots colored in blue were considered transgenic, and these were grafted on in vitro grown rootstocks. The transformation efficiency of each experiment was calculated based on the number of introduced explants, responsive explants, number of regenerated shoots, and number of GUS positive regenerated shoots. In order to confirm the genetic transformation of Hamlin sweet orange, PCR and Southern blot analyses of three positive GUS acclimatized plants were performed. Anatomic slices for better visualization of blue color formed by GUS reaction were also made. All transformation experiments regenerated at least one GUS positive shoot. Plants of Hamlin sweet orange analyzed by PCR and Southern blot are transformed and have one transgene insertion. Anatomical analyses indicated preferential expression of the transgenes in the phloem.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

O Brasil é o maior produtor de laranja doce do mundo. O histórico da citricultura brasileira é marcado por uma sucessão de doenças causadas por diferentes agentes etiológicos. Entre as principais doenças que afetam a cultura, têm levado a maiores prejuízos, as bacterianas, com destaque para o cancro cítrico causado por Xanthomonas citri subsp. citri e o Huanglongbing associado a três espécies de \"Candidatus Liberibacter\". Devido à ausência de cultivares de laranja doce resistentes a estas doenças, a transformação genética é uma alternativa promissora para obtenção de plantas resistentes. Uma das estratégias no uso da transgenia para conferir ação contra bactérias é a inserção de genes que codificam peptídeos antimicrobianos como o D4E1, um peptídeo sintético, que tem apresentado eficiência no controle de doenças fúngicas e bacterianas de várias culturas, in vivo e in vitro. Este trabalho foi realizado com o objetivo de obter plantas transgênicas de laranja doce das cultivares \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\', via Agrobacterium tumefaciens, expressando o gene D4E1, dirigido pelos promotores CaMV35S (Cauliflower mosaic virus 35S promoter) de expressão constitutiva ou pelo AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2) com expressão preferencial no floema, visando obter plantas resistentes a doenças bacterianas. Foram obtidas 13 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 10 da cultivar \'Pêra\' e 8 da cultivar \'Valência\', contendo a construção gênica CaMV35S/D4E1 e 19 plantas transgênicas da cultivar \'Hamlin\', 6 da cultivar \'Pêra\' e 15 da cultivar \'Valência\' contendo a construção gênica AtPP2/D4E1. As plantas transgênicas apresentaram um a três eventos de inserção do T-DNA no genoma. Os níveis de expressão do transgene dirigido pelo promotor de expressão preferencial no floema foi menor comparado ao das plantas contendo o transgene dirigido pelo promotor de expressão constitutiva. Os resultados da expressão do transgene permitem selecionar plantas com maior expressão de cada uma das construções gênicas, para que, futuramente, estas sejam multiplicadas e avaliadas quanto à resistência ao cancro cítrico e ao HLB. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. The history of the Brazilian citrus industry is marked by a series of diseases caused by different etiologic agents. Among the diseases affecting the culture, those caused by bacteria are the ones that have caused more significant losses, especially the citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri, and huanglongbing (HLB) associated with three \"Candidatus Liberibacter\" bacteria species. Due to the absence of genetic resistance to these diseases in commercial sweet orange cultivars, the genetic transformation is a promising alternative to produce resistant plants. One of the strategies to produce transgenic resistant plants to bacteria is the use of genes that code for antimicrobial peptides, such as D4E1, a antimicrobial synthetic peptide, which has shown efficient results controlling diseases caused by bacteria and fungi in several crops, through in vitro and in vivo experiments. The aim of this study was to produce \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valencia\' sweet orange transgenic plants, via Agrobacterium tumefaciens, expressing the D4E1 gene driven by the constitutive promoter Cauliflower mosaic virus (CaMV35S) or Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), a promoter preferentially expressed in the phloem. It was possible to regenerate 13 \'Hamlin\' transgenic lines, 10 \'Pêra\' transgenic lines and 8 \'Valencia\' transgenic lines bearing the gene construct CaMV35S/D4E1, whereas 19 \'Hamlin\' transgenic lines, 6 \'Pêra\' transgenic lines and 15 \'Valencia\' transgenic lines bearing the AtPP2/D4E1 gene construct were regenerated. The transgenic plants had one to three T-DNA insertion events in the genome. The transgene expression levels in transgenic plants for D4E1 gene driven by the phloem preferential promoter were lower than the transgenic expression levels of the transgene driven by the constitutive promoter. Transgene expression levels results may allow the selection of those plants with higher expression levels of each genetic construct for future multiplication and evaluation for citrus canker and HLB resistance.

Muitas plantas apresentam crescimento indeterminado e são capazes de produzir novos órgãos e tecidos ao longo de todo seu ciclo de vida. Essa capacidade é devida parcialmente à expressão altamente regulada de genes específicos, tais como os genes SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPLs). SPLs codificam fatores de transcrição específicos de plantas que desempenham papéis importantes em diferentes aspectos do desenvolvimento, tais como mudança de fase juvenil-adulto, definição da arquitetura da planta e amadurecimento do fruto. A maioria dos genes SPLs são pós-transcricionalmente regulados pelo microRNA (miRNA) miR156. Apesar de alguns aspectos regulados pelas SPLs serem bem estudados, suas funções moleculares durante o desenvolvimento do fruto são pouco compreendidas. Neste trabalho, nós geramos 22 eventos transgênicos de Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) superexpressando o precursor AtMIR156b. Plantas transgênicas exibiram morfologia foliar e floral anormal além de alteração na arquitetura vegetal. Interessantemente, a maioria dos eventos apresentou frutos de crescimento indeterminado, os quais não apresentam sementes sendo caracterizados pelo crescimento de frutos secundários além da presença de estruturas vegetativas e meristemas florais ectópicos. Fazendo uso da técnica de RT-qPCR, nós encontramos uma robusta correlação entre expressão do miR156 e o fenótipo dos frutos, sugerindo que esta rota regula o desenvolvimento e determinação do fruto de tomateiro. O mutante de tomateiro Mouse ears (Me) apresenta um fraco nível de indeterminação no fruto, sendo que os níveis do transcrito miR156 maduro são maiores no fruto mutante quando comparado aos controles MT, mas significativamente menores que nos frutos transgênicos. Oito SPLs de tomateiro foram silenciadas em diferentes níveis em frutos de diferentes eventos transgênicos e no mutante Me. O fator de transcrição do tipo MADS-box MACROCALYX (MC), o qual é ortólogo ao gene APETALA1 (AP1) de arabidopsis (alvo direto in vivo da proteína SPL3), afeta a determinação da inflorescência e o desenvolvimento das sépalas. A expressão de MC foi severamente reduzida nos frutos dos eventos transgênicos, mas não no mutante Me. Este dado sugere que a desregulação da expressão de MC deve ser responsável pelo forte fenótipo de indeterminação do fruto observados nos eventos transgênicos. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem uma nova função para a via genética mir156/SPL na regulação do desenvolvimento e determinação de frutos carnosos, provavelmente através da regulação da expressão de MC. / Many plants have indeterminate growth and are capable of producing new organs and tissues throughout their life. This capability is partially due to the highly regulated expression of specific genes such as SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPL) genes. SPLs encode plant-specific transcription factors that play important roles in development, such as phase transition, plant architecture, and fruit ripening. Most SPL genes are post-transcriptionally regulated by the microRNA (miRNA) miR156. Although some developmental aspects regulated by SPLs have been well studied, their molecular roles during fruit development are poorly understood. In this work, we generated 22 transgenic events of Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) overexpressing AtMIR156b precursor. Transgenic plants exhibit abnormal leaf and flower morphology and altered vegetative architecture. Interestingly, most events display navel-like fruits that are seedless and characterized by the growth of secondary fruits and present leaf-like structures as well as ectopic flowering meristems. By using RT-qPCR, we found a robust correlation between miR156/SPL expression and the fruit phenotype, suggesting that this pathway regulates tomato fruit development and determinacy. The tomato mutant Mouse ears (Me) displays a weak level of fruit indeterminacy. Levels of mature miR156 transcripts are higher in fruits from the mutant as comparing to MT fruits, but significantly lower than in transgenic fruits. Eight tomato SPLs were downregulated at variable levels in fruits from distinct transgenic events and Me plants. The MADS-type of transcription factor Macrocalyx (MC) gene is an orthologue of Arabidopsis AP1 (a direct in vivo target of SPL3) and affects tomato inflorescence determinacy and sepal development. MC was severely downregulated in fruits from transgenics but not in fruits from Me mutant. This data suggests that the MC misregulation may lead to the strong fruit indeterminacy phenotype observed in the transgenic events. Taken together, our data suggest a new function for miR156/SPL pathway in regulating fruit development and determinacy likely through the regulation of MC expression.

A obtenção de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica de grande valor, contribuindo nos programas de melhoramento. Plantas transgênicas contendo genes de peptídeos antibacterianos são uma boa alternativa nos programas visando resistência às bactérias. A cecropina é um peptídeo isolado de inseto que apresenta ação antibacteriana contra diversas bactérias, entre elas, a Xylella fastidiosa causadora da clorose variegada dos citros (CVC). Com isso, este trabalho teve dois objetivos: 1) obter plantas transgênicas dos cultivares copa de laranja 'Hamlin' e laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 dirigido pelos promotores do gene da fenilalanina amônia-liase (PAL) clonado de citros (CsPP) e de Arabidopsis thaliana (AtPP), que conferem expressão gênica nos vasos do xilema. Obter plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' com o gene GUS dirigido pelo promotor AtPP. 2) avaliar plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39 inoculadas com Xylella fastidiosa. As transformações genéticas foram realizadas através do co-cultivo de explantes, coletados de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais), com Agrobacterium tumefaciens. Para isso, utilizou-se a estirpe EHA-105 de A. tumefaciens contendo os vetores binários CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 ou AtPP-GUS/2201. A seleção das gemas transformadas foi feita em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina, e para confirmação da transformação foram realizados teste histoquímico GUS e análises moleculares de PCR e 'Southern blot'. As gemas regeneradas foram microenxertadas em citrange 'Carrizo' ou laranja 'Hamlin' não transgênicos. Foi possível a obtenção de gemas transformadas para todos os cultivares, porém a regeneração de plantas ocorreu para laranja 'Hamlin' transformada com os vetores CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 e AtPP-GUS/2201. Para a avaliação da resistência de plantas transgênicas a Xylella fastidiosa foram selecionadas nove plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39, sendo que em quatros plantas o gene está sendo dirigido pelo promotor CsPP e nas outras cinco plantas pelo promotor CaMV 35S. Essas plantas foram multiplicadas por borbulhia e inoculadas mecanicamente com Xylella fastidiosa. Foram realizados isolamentos primários e quantificações bacterianas aos quatro e dez meses após a inoculação da bactéria para verificar a eficiência da inoculação e movimentação sistêmica da bactéria. Avaliações sintomáticas foliares também foram feitas aos oito meses após a inoculação. Os resultados dos isolamentos aos quatro meses mostraram que a inoculação da bactéria foi eficiente, já que houve crescimento bacteriano na maioria das placas com meio de cultura. A movimentação sistêmica da bactéria pôde ser detectada no isolamento aos dez meses. Das nove plantas avaliadas, uma planta transgênica apresentou crescimento populacional menor do que a da planta controle, indicando uma resistência ao patógeno. Nas avaliações sintomáticas foliares, as plantas transgênicas não diferiram do controle. / The production of genetically modified plants has become an important biotechnological tool, contributing with breeding programs. Transgenic plants expressing antibacterial peptides genes are a good alternative for breeding programs aiming to obtain bacterial resistance. Cecropin is a peptide isolated from an insect, which presents antibacterial effect against several bacteria including the citrus variegated chlorosis in which the causal agent is Xylella fastidiosa. This work had two objectives: 1) genetically transform 'Hamlin' and 'Pêra' sweet oranges scions with the cecropin MB39 gene under the control of the phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, cloned from citrus (CsPP) and from Arabidopsis thaliana (AtPP). This promoter confers gene expression within the xylem vessels. Obtain transgenic plants of 'Hamlin' and 'Valência' sweet oranges with the GUS gene under the control of the AtPP promoter. 2) Evaluate the resistance to Xylella fastidiosa of 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene. Co-culture of explants with Agrobacterium tumefaciens was used to genetically transform in vitro plants (epicotyl segments) and greenhouse plants (internodal segments). A. tumefaciens strain EHA-105 containing the CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 or AtPP-GUS/2201 binary vectors were used for transformation. Culture medium containing the antibiotic kanamycin was used for selection of transformed buds. Confirmation of transgenesis was carried out by GUS assays, PCR and Southern blot analysis. Regenerated buds were in vitro grafted on non-transgenic 'Carrizo' citrange or 'Hamlin' sweet orange rootstocks. Transformed buds were obtained for all cultivars, however plant regeneration was only obtained for 'Hamlin' sweet orange transformed with vectors CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 and AtPP-GUS/2201. Nine 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene were selected for the Xylella fastidiosa resistance experiment. Four transgenic lines were controlled by the CsPP promoter and the other five lines were controlled by the CaMV 35S promoter. These transgenic lines were graft propagated and mechanically inoculated with Xylella fastidiosa. Primary isolations and bacterial quantifications were conducted on the fourth and tenth month after inoculation in order to detect inoculation efficiency and bacterial systemic movement. Leaf symptom evaluations were executed eight months after inoculations. The bacterial isolation results from the fourth month indicated that inoculations were successful, since bacterial growth could be detected in the majority of culture mediums. Systemic movement of bacteria within the plants was detected after ten months. From the nine transgenic lines tested, one presented reduced pathogen growth when compared to controls indicating resistance. Transgenic lines did not differ from controls regarding leaf symptoms.