Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2015-06-02T04:08:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333884.pdf: 2929048 bytes, checksum: 0d0c1e8dd241198b20d2515f906d45f5 (MD5) Previous issue date: 2015 / Produzidos a partir de fontes renováveis e utilizados para o transporte automotivo, os biocombustíveis tornam-se cada dia mais importantes no balanço energético mundial devido à necessidade de reduzir a dependência da utilização de petróleo, de origem fóssil. No Brasil, a maior parte da produção de bioetanol é obtida diretamente a partir da cana-de-açúcar, porém, na pouco aproveitada biomassa lignocelulósica residual (como bagaço e palha) encontra-se a xilose, o segundo açúcar mais abundante na natureza. A conversão bem sucedida da hemicelulose em etanol combustível com alto rendimento é o fator decisivo para a viabilidade econômica do processo. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo altamente efetivo na produção de etanol a partir de hexoses, com elevada produtividade de etanol, alta tolerância a esse produto, e tolerância às condições industriais de produção de álcool combustível, mas incapaz de utilizar açúcares como a xilose. Linhagens recombinantes de S. cerevisiae podem constituir uma alternativa interessante para a fermentação da xilose. Assim, no presente trabalho, foram usadas linhagens de S. cerevisiae recombinantes capazes de metabolizar xilose, transformadas com o plasmídeo integrativo pAUR-XKXDHXR, o qual permite a sobre-expressão dos genes das enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulose cinase. Em primeira abordagem, foi realizado um experimento de engenharia evolutiva com uma linhagem contendo apenas o gene do transportador de glicose HXT2 sobre-expresso, permitindo a obtenção de uma linhagem mutante no gene STB5, que codifica um regulador da via das pentoses-fosfato. Esta linhagem mutante foi capaz de crescer em xilose tão bem quanto em glicose. Em segunda abordagem, usando engenharia genômica, foi deletada uma cópia do gene FPS1, o qual codifica um facilitador de glicerol, em uma linhagem industrial selecionada para eficiente fermentação de caldo de cana-de-açúcar, obtendo-se uma linhagem que fermenta a xilose mais eficientemente. Nossos resultados revelam que as estratégias empregadas são promissórias para incrementar consideravelmente a produção de etanol a partir de linhagens de S. cerevisiae recombinantes.<br> / Abstract: Biofuels produced from renewable sources and used for automotive transport are becoming increasingly more important in the global energy mix, looks for decrease world's oil dependency comes from fossil sources use. Most of the Brazilian ethanol production is obtained directly from sugar cane, however, it don't take advantage of the residual lignocellulosic biomass coming from this process (such as bagasse and straw) which is rich in xylose, the second most abundant sugar in nature. The successful conversion of hemicellulose (compound of lignocellulose) into ethanol fuel with high yields is the decisive factor for economic feasibility of its use. Saccharomyces cerevisiae is a highly effective microorganism for ethanol production from hexoses, which poses high ethanol productivity and high tolerance to it, and tolerance to industrial conditions in alcohol fuel production, but is not able to use sugars such as xylose. Recombinant strains of S. cerevisiae may constitute an interesting alternative to xylose fermentation. In this research work was used two strains of recombinant S. cerevisiae, capables of metabolize xylose, transformed with the integrative plasmid pAUR-XKXDHXR which permits overexpression of enzyme genes xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulose kinase. In first approach, an evolutive engineering experiment was carried out with a strain that only had a transporter gene of glucose HXT2 overexpressed, turned out to be in a mutant strain in the STB5 gene that encodes for a regulator pentose-phosphate pathway, mutant lineage capable of grow in xylose efficiently as in glucose. In second approach, using genetic engineering, was deleted a copy of FPS1 gene which encodes a glycerol facilitator in a selected industrial strain for efficient fermentation of sugar cane broth, coming out a strain that ferments xylose more efficiently. Our results reveal as promissory the strategies used for important increase of ethanol production from recombinant lineages of S. cerevisiae.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348746.pdf: 2398591 bytes, checksum: ee1248fe883b7567941bdb7d90ef2176 (MD5) Previous issue date: 2017 / A produção de etanol de segunda geração depende muito da fermentação da xilose, o segundo açúcar mais abundante nos hidrolisados lignocelulósicos, pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Mas essa levedura é incapaz de fermentar essa pentose, uma vez que não dispõe de enzimas e transportadores eficientes para a sua metabolização. Assim, é importante identificar enzimas e transportadores de xilose de diferentes organismos para a expressão em células de S. cerevisiae. Contudo, pesquisadores têm demonstrado que essa levedura requer modificações genéticas adicionais para uma efetiva fermentação de xilose; entre elas, a sobre-expressão do gene XKS1 (que codifica a xilulocinase) e a deleção do gene PHO13 (que codifica uma fosfatase alcalina) melhoram a fermentação de xilose em linhagens recombinantes. Assim sendo, o presente trabalho se propôs a desenvolver linhagens de S. cerevisiae recombinantes por meio da sobre-expressão do gene XKS1 e/ou deleção do gene PHO13, com o intuito de que essas linhagens possam ser utilizadas como plataformas para a análise de enzimas e transportadores heterólogos envolvidos no metabolismo da xilose. Primeiramente, foi construída a linhagem ASY-1, com a finalidade de servir como plataforma para testes de enzimas heterólogas, já que esta linhagem foi obtida a partir da sobre-expressão do gene XKS1 na linhagem wild-type CEN.PK2-1C. A seguir, foi construida a linhagem ASY-2, a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem ASY-1. As linhagens CEN.PK2-1C, ASY-1 e ASY-2 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Nossos resultados mostram que a sobre-expressão do gene XKS1 foi necessária para haver consumo de xilose em crescimentos aeróbios e para a produção de etanol a partir dessa pentose em fermentações microaeróbias, indicando que essa sobre-expressão é crucial para o metabolismo da xilose em S. cerevisiae. A deleção do gene PHO13 permitiu um consumo mais rápido e maior da xilose, tanto em crescimentos aeróbios quanto em fermentações microaeróbias, além de ter aumentado a produção de xilitol e alterado a produção de glicerol em todos os ensaios. Ainda, os efeitos vantajosos causados pela deleção do gene PHO13 no consumo de xilose e na produção de etanol se mostraram mais evidentes em meios contendo alta concentração (100 g.L-1) de xilose. Paralelamente, contruímos também a linhagem ASY-3, com a finalidade de servir como plataforma para testes de transportadores heterólogos, sendo que esta linhagem foi construída a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem DLG-K1, uma linhagem hxt-null (hxt1-hxt7 e gal2) que possui os genes necessários à metabolização de xilose sobre-expressos mas incapaz de transportar monossacarídeos. As linhagens DLG-K1 e ASY-3 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam os transportadores Sut4 e Xut1 provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Scheffersomyces stipitis, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Em ensaios de crescimento aeróbios, nossos resultados mostraram que a deleção do gene PHO13 permitiu consumo mais rápido e maior da xilose, além de maior produção de etanol. No entanto, em fermentações microaeróbias, não houve diferença no consumo de xilose entre as linhagens contendo ou não o gene PHO13 e expressando os transportadores heterólogos. A deleção do gene PHO13 também alterou a produção de glicerol pelas cepas em todos os ensaios fermentativos realizados utilizando transportadores heterólogos. Portanto, as linhagens recombinantes desenvolvidas constituem importantes ferramentas para a clonagem e identificação de novos genes envolvidos no transporte e fermentação de xilose por S. cerevisiae. / Abstract : Second-generation ethanol production depends greatly on the xylose fermentation, the second most abundant sugar in the lignocellulosic hydrolysates, by the yeast Saccharomyces cerevisiae. But this yeast is incapable of fermenting this pentose, since it does not have efficient enzymes and transporters for its metabolization. Therefore, it is important to identify xylose enzymes and transporters of different organisms for the expression in S. cerevisiae cells. However, researchers have shown that this yeast requires additional genetic modifications for an effective xylose fermentation; among them, XKS1 gene (which encodes xylulokinase) overexpression and PHO13 gene (encoding alkaline phosphatase) deletion to improve xylose fermentation in recombinant strains. Thus, the present work aimed to develop recombinant S. cerevisiae strains by XKS1 gene overexpression and/or PHO13 gene deletion, so that these strains could be used as platforms for the analysis of enzymes and transporters involved in xylose metabolism. Firstly, the ASY-1 lineage was constructed to serve as a platform for heterologous enzyme tests, since this lineage was obtained from the XKS1 gene overexpression in the wild-type strain CEN.PK2-1C. The ASY-2 yeast was then constructed by PHO13 gene deletion in the ASY-1 strain. The CEN.PK2-1C, ASY-1 and ASY-2 strains were transformed with plasmids containing genes for xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum yeasts, respectively, and the fermentative performance of transformants was evaluated. Our results show that XKS1 gene overexpression was required for xylose consumption in aerobic growths and for ethanol production from this pentose in microaerobic fermentations, indicating that this overexpression is crucial for xylose metabolism in S. cerevisiae. PHO13 gene deletion allowed a faster and greater xylose consumption, both in aerobic growth and microaerobic fermentations, in addition to increasing the production of xylitol and altering the production of glycerol in all the assays. Furthermore, the advantageous effects caused by PHO13 gene deletion on xylose consumption and ethanol production were more evident in media containing high xylose concentrations (100 g.L-1). At the same time, we also built the ASY-3 lineage, in order to serve as a platform for heterologous transporter tests. This strain was constructed by the PHO13 gene deletion in the DLG-K1 strain, a hxt-null yeast (hxt1-hxt7 and gal2) which has the genes necessary for xylose metabolization overexpressed, but incapable of transporting monosaccharides. The DLG-K1 and ASY-3 yeast were transformed with plasmids containing genes encoding the Sut4 and Xut1 transporters from Spathaspora arborariae and Scheffersomyces stipitis yeasts, respectively, and the fermentative performance of the transformants was evaluated. In aerobic growth assays, our results showed that PHO13 gene deletion allowed for faster and greater xylose consumption, in addition to higher ethanol production. However, in microaerobic fermentations, there was no difference in xylose consumption between strains containing or not the PHO13 gene and expressing the heterologous transporters. PHO13 gene deletion also altered glycerol production by the strains in all fermentative assays performed using heterologous transporters. Thus, the developed recombinant strains are an important tool for cloning and identification of new genes involved in xylose transport and fermentation by S. cerevisiae.

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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / O aumento na demanda por energias sustentáveis impulsiona o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas para a produção de biocombustíveis. Neste contexto, o aproveitamento eficiente da biomassa lignocelulósica como matéria prima é fundamental para a produção de etanol de segunda geração. A levedura Saccharomyces cerevisiae, organismo mais utilizado na produção industrial de bioetanol, é incapaz de utilizar pentoses, como a xilose, que é o segundo açúcar mais abundante em algumas biomassas. Neste trabalho, plasmídeos epissomais foram construídos para expressão de genes codificadores para xilose isomerase (XI) de Piromyces sp. e xiluloquinase (XK) de S. cerevisiae. As linhagens laboratoriais de S. cerevisiae CEN.PK 113.14A Δtrp1-289 (L2) e CEN.PK 113.3C Δtrp1-289, Δura-52 (L7) foram transformadas com os plasmídeos gerados. Desta forma, foram construídas linhagens recombinantes de S. cerevisiae expressando XI isoladamente (L2XI) ou em conjunto com XK (L7XIXK). Uma terceira linhagem, L7XIΦ, expressando XI e com o segundo plasmídeo vazio foi construída como controle. A linhagem L7XIXK apresentou melhores taxas fermentativas que as demais linhagens, confirmando o efeito positivo da expressão de XK. As linhagens L2XI, L7XIΦ e L7XIXK obtidas foram submetidas a um processo de condicionamento em meio seletivo contendo xilose como única fonte de carbono. Ao final do condicionamento, quando comparadas com as originais, apresentaram menor fase lag de crescimento e maior taxa de crescimento, maior consumo de xilose (entre 1,8 e 18,5 vezes) e rendimento de etanol (47% para L7XIXK), concomitante à diminuição do rendimento de xilitol (entre 87,6% e 91,8%). A linhagem L2XI, investigada anaerobicamente, também apresentou aumento no consumo específico de xilose (49,8%), rendimento de etanol (19%) e redução no rendimento de xilitol (75%). As linhagens condicionadas foram submetidas então a um processo de cura para remoção dos plasmídeos. Uma das linhagens obtidas, LC7, derivada de L7XIXK perdeu a capacidade de crescer em meio mínimo, indicando a perda dos plasmídeos. Entretanto o gene para XI ainda foi identificado na levedura. A retransformação desta levedura curada com os plasmídeos originais demonstrou que as melhorias da levedura condicionada podem estar associadas a mutações fora do plasmídeo. Esta linhagem curada tem grande potencial para desenvolvimento de uma linhagem de seleção para novas enzimas da via do catabolismo de xilose. / The increasing demand for sustainable energy drives the development of biotechnological strategies for the production of biofuels. In this context, efficient utilization of lignocellulosic biomass as feedstock is essential for the production of second generation biofuels. The yeast S. cerevisiae, main organism utilized in the industrial production of bioethanol, is unable to use pentoses, such as xylose, which is the second most abundant sugar in some biomasses. In this work, multi-copy plasmids were constructed for the expression of genes coding xylose isomerase (XI) from Piromyces sp. and xylulokinase (XK) from S. cerevisiae. The laboratory strains of S. cerevisiae CEN.PK 113.14A Δtrp1-289 (L2) and CEN.PK 113.3C Δtrp1-289, Δura-52 (L7) were transformed with the generated plasmids. Thus, recombinant strains of S. cerevisiae expressing solely XI (L2XI), or combined with XK (L7XIXK) were obtained. A third strain, L7XIΦ, expressing XI and with an empty second plasmid, was constructed as control. The L7XIXK strain presented better fermentative rates than the other strains, confirming the positive effect of XK expression. The obtained strains L2XI, L7XIΦ and L7XIXK underwent a conditioning process in selective medium with xylose as sole carbon source. At the end of the process, when compared to the original strains, conditioned strains presented shorter lag growth phase, and increased growth rate, increased xylose consumption (1,8 to 18,5 fold) and ethanol yield (47% for L7XIXK), along with reduction in xylitol production (between 87,6 and 91,8%). The strain L2XI was investigated under anaerobic conditions and also has presented improved xylose specific consumption (49,8%), ethanol yield (19%) and xylitol reduction (75%). The conditioned strains underwent a curing process, in order to remove the plasmids. One of the obtained strains, LC7, which derived from L7XIXK, has lost its ability to grow on minimal medium, a result consistent with the loss of plasmids. However the XI gene was still identified in the yeast. The retransformation of this curated yeast with the originally constructed plasmids showed that the improvements observed in conditioned strains may be associated with mutations outside of the plasmids. The curated strain has a great potential for the development of a screening strain for new enzymes of the xylose catabolic pathway.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-21Bitstream added on 2014-06-13T20:44:15Z : No. of bitstreams: 1 schuch_v_dr_jabo.pdf: 940291 bytes, checksum: b12a082987505c45883c2a6c161d5861 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho foi realizada a prospecção de novos genes de interesse biotecnológico em bibliotecas metagenômicas e em linhagens de Burkholderia através da técnica de reação em cadeia da polimerase. Nas bibliotecas metagenômicas, foi possível identificar genes que codificam álcool desidrogenase, oxirredutase, acil-CoA desidrogenase, luciferase, transportadores de membrana, thiolase, aminoglicosídeo fosfotransferase, desidrogenase de cadeia curta, proteínas repressoras TetR, enoil-CoA hidratase/isomerase, entre outras. Nas treze linhagens de Burkholderia testadas, seis apresentaram amplificação positiva para o gene de xilose isomerase. Estes genes foram completamente sequenciados e as sequências foram utilizadas em análises computacionais, que permitiram estabelecer a identidade entre as sequências e a dedução da função das proteínas baseado em similaridades. Foi realizada a medida do índice de adaptação de códons, com a finalidade de se encontrar um hospedeiro onde a expressão seja maximizada, baseando-se na presença de códons preferenciais e raros. Está análise mostrou que os genes encontrados possuem boas possibilidades de expressão em Escherichia coli, mas que podem apresentar uma taxa de expressão ineficiente em Saccharomyces cerevisiae. Foi realizado um teste de complementação gênica utilizando um dos genes descobertos e uma linhagem de Escherichia coli que possui o gene de xilose isomerase nocauteado. Os transformantes foram capazes de crescer em meio cuja única fonte de carbono era o açúcar xilose, mostrando que o gene é funcional. Estes genes serão utilizados futuramente em ensaios de expressão para caracterização da enzima / In this work was carried out prospection for new genes of biotechnological interest in metagenomic libraries and strains of Burkholderia through the technique of polymerase chain reaction. In metagenomics libraries, we could identify genes encoding alcohol dehydrogenase, oxidoreductase, acyl-CoA dehydrogenase, luciferase, membrane transporters, thiolase, aminoglycoside phosphotransferase, short-chain dehydrogenase, TetR repressor protein, enoyl-CoA hydratase/isomerase, among others. Of the 13 strains of Burkholderia tested, 6 showed positive amplification for the xylose isomerase gene. The genes were completely sequenced and the sequences were used in computational analysis, which allowed to establish the identity between the sequences and deducing protein function based on similarities. We evaluated the codon adaptation index, with the aim of finding a host in which the expression is maximized, based on the presence of preferred codons and rare. This analysis showed that the genes found have good possibilities of expression in Escherichia coli, but that may have an inefficient rate of expression in Saccharomyces cerevisiae. We conducted a genetic complementation test using one of the discovered genes and one strain of Escherichia coli that has the xylose isomerase gene knocked out. Transformants were able to grow in a medium whose sole source of carbon was the sugar xylose, showing that the gene is functional. These genes will be used in expression assays for characterization of new enzymes

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-04-15T13:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337882.pdf: 2441331 bytes, checksum: ce3356aff8c74def3834a04f62b8f3bf (MD5) Previous issue date: 2015 / Na produção de etanol de segunda geração o transporte dos açúcares para o interior da levedura Saccharomyces cerevisiae constitui um passo limitante, principalmente no caso da pentose xilose, o segundo açúcar mais abundante na biomassa lignocelulósica. Para caracterizar o efeito de diferentes transportadores na fermentação de xilose, neste trabalho foi utilizada uma linhagem hxt-null de S. cerevisiae (hxt1-hxt7? e gal2?), mas capaz de metabolizar xilose devido à sobre-expressão dos genes XYL1, XYL2 e XKS1 que codificam as enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulocinase, respectivamente. Essa linhagem hxt-null foi utilizada para expressar transportadores de S. cerevisiae e de leveduras fermentadoras de xilose Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum. Os resultados indicam que nenhuma das permeases de S. cerevisiae analisadas (Hxt1, Hxt2, Hxt5 e Hxt7) possui propriedades adequadas para captação de xilose, quando esta é a única fonte de carbono ou em misturas de xilose/glicose. Uma biblioteca genômica de S. stipitis foi inserida na linhagem hxt-null, resultando na clonagem de três permeases que realizam o transporte de xilose: o já conhecido transportador Xut1 e duas novas permeases (Hxt2.6 e Qup2) que ainda não tinham sido caracterizadas nessa levedura. No entanto, nenhuma dessas proteínas mostrou-se específica para xilose, pois também captam hexoses presentes no meio. O genoma sequenciado das leveduras S. arborariae e S. passalidarum foi analisado na busca por genes com homologia à transportadores de xilose, e três genes selecionados foram clonados e expressos na linhagem hxt-null. Desses, apenas a permease Sut1 de S. passalidarum realizou transporte de xilose (além de outras hexoses) e, quando o gene HXT4 de S. arborariae era expresso, não houve consumo ou fermentação de nenhum dos açúcares testados. Outra permease dessa levedura (Get1) apresentou uma característica peculiar, ocorrendo a captação de xilose apenas quando maltose ou outras fontes de carbono estavam presentes. Os resultados indicam que a caracterização de novos transportadores de açúcares presentes no genoma de leveduras fermentadoras de xilose é necessária para desenvolver novas estratégias para otimizar a fermentação de hidrolisados lignocelulósicos por linhagens de S. cerevisiae recombinantes.<br> / Abstract : The internalization of sugars in Saccharomyces cerevisiae during second generation ethanol production is a limiting step, primarily because of xylose, the second most abundant sugar in lignocellulosic biomass. To typify the influence of different transporter in the xylose fermentation, in this work it was used a hxt-null S. cerevisiae strain, deleted in its main hexoses permeases (hxt1-hxt7? e gal2?), but capable of metabolize xylose, due to the overexpression of genes XYL1, XYL2 and XKS1, that code of the enzymes xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulokinase. This hxt-null strain was used to express transporters from the genome of S. cerevisiae and from xylose-fermenting yeasts Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum. The results show that none of the S. cerevisiae permeases analyzed (Hxt1, Hxt2, Hxt5 and Hxt7) had properties suitable for xylose fermentation or xylose/glucose mixtures. In order to obtain new transporters, a genomic library from S. stipitis was transformed into the hxt-null strain, which resulted in cloning three permeases that allowed growth and fermentation of xylose: the already known Xut1, and two new permeases (Hxt2.6 and Qup2) that were not characterized before in this yeast. However, none of these proteins was specific for xylose, since they also allowed efficient fermentation of hexoses in the hxt-null strain. Regarding S. arborariae and S. passalidarum, both yeasts had their genome sequenced and were used to search genes homologues to xylose transporters. Three gene selected were cloned and expressed in the hxt-null S. cerevisiae strain. Of these permeases coded, only Sut1 from S. passalidarum restored xylose (and hexoses) fermentation, and when HXT4 from S. arborariae was expressed, there were no uptake or fermentation of any sugar tested. Another permease from this yeast (Get1) had a peculiar characteristic: it consumed xylose only in co-fermentation, with maltose or other carbon source. The results indicate that the characterization of new sugar transporters present in the genome of xilose-fermenting yeasts is needed to develop new strategies to optimize lignocellulosic hydrolisates fermentations by recombinants S. cerevisiae strains.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-25T03:08:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342428.pdf: 1782210 bytes, checksum: 64aa57f0c82b2db9772adaba6c071f94 (MD5) Previous issue date: 2016 / O álcool combustível tem adquirido importância nos últimos anos devido ao futuro esgotamento das reservas de combustíveis fósseis, bem como o impacto ambiental pela emissão de poluentes que estes combustíveis fósseis apresentam. Uma atrativa fonte de matéria prima para a obtenção de etanol é a biomassa lignocelulósica, composta de lignina, celulose e hemicelulose, sendo que estes dois últimos polímeros podem ser utilizados nos processos fermentativos para a produção de álcool combustível. Embora a levedura industrial Saccharomyces cerevisiae fermente eficientemente hexoses, esta levedura é incapaz de fermentar pentoses como a xilose, o principal açúcar presente nos hidrolisados de hemicelulose. A enzima xilose redutase (XR) é o primeiro passo no metabolismo da xilose, uma enzima NAD(P)H-dependente que reduz xilose a xilitol, mas o desbalanço causado pela xilitol desidrogenase dependente de NAD+ (a segunda enzima do metabolismo da xilose) pode levar ao acúmulo de xilitol. Então, a seleção de XRs com alta atividade enzimática e afinidade pelos dois cofatores é importante para o aumento da produtividade de etanol a partir da xilose. No presente trabalho foram clonados genes que codificam para possíveis XRs de duas leveduras do gênero Spathaspora (S. passalidarum e S. arborariae), e também foi clonada uma xilitol desidrogenase de S. passalidarum, ambas leveduras naturalmente fermentadoras de xilose. Estes genes foram expressos em uma linhagem de S. cerevisiae para avaliar a funcionalidade das enzimas. Nossos resultados mostraram que um gene anotado no genoma de S. arborariae (também presente em S. passalidarum) como XR, não exibiram atividade com este açúcar, e provavelmente trata-se de aldo-ceto redutases com especificidades desconhecidas. Outro gene foi amplificado de S. arborariae e S. passalidarum, e quando expressos em S. cerevisiae, o gene de S. arborariae apresentou atividade XR com ambos os cofatores (NADH e NADPH), enquanto que o gene obtido de S. passalidarum só exibiu atividade de XR dependente de NADPH. A atividade da xilitol desidrogenase clonada de S. passalidarum, quando expressa em S. cerevisiae, mostrou uma enzima completamente dependente de NAD+. Linhagens de S. cerevisiae recombinantes, expressando as diferentes enzimas do metabolismo da xilose clonadas no presente trabalho, foram capazes de crescer e consumir xilose, porém com baixa produção de etanol, e significativa produção de xilitol. Isto provavelmente se deve a baixa atividade da enzima xilitol desidrogenase nas linhagens recombinantes. De fato, mesmo nas fermentações de xilose em batelada, as células recombinantes produziram mais xilitol do que etanol. Finalmente, durante co-fermentações de xilose/glicose, as leveduras recombinantes produziram mais xilitol e acetato do que etanol a partir da xilose, indicando que provavelmente o desbalanço de cofatores ainda esta determinando o destino dos carbonos provenientes da xilose. Portanto, nossos resultados indicam a presença de diferentes xiloses redutases no genoma das leveduras Spathaspora, que poderão contribuir para otimizar a produção de etanol de segunda geração.<br> / Abstract : The production of fuel álcohol has become importante in recente years due to the future depletion of fóssil fuels stocks and the environmental impact of pollutant emissions. An attractive source of raw material for etanol production is the lignocellulosic biomass, composed of lignina, celulose and hemicellulose. The sugar cane bagasse is an interesting source of celulose and hemicelulose, that can be used in the fermentative process for fuel alcohol production. Although the industrial yeast Saccharomyces cerevisiae efficiently ferments hexoses, this yeast is unable to ferment pentoses such as xylose present in hemicellulose hydrolysates. The enzyme xylose reductase (XR) is the first step in xylose metabolism, a NAD(P)H-dependent enzyme that reduces xylose to xylitol, but cofactor imbalance with the NAD+-dependent xylitol dehydrogenase (the second enzyme in xylose metabolism) can lead to xylitol accumulation. Thus, screening for XR with high catalytic efficiency and dual cofactor affinity is important for increasing the ethanol productivity from xylose. This work, we have cloned xylose reductases from strains of Spathaspora (S. passalidarum and S. arborariae) and cloned xylitol dehydrogenase from Spathaspora passalidarum, which are natural xylose fermenting yeast. These genes were expressed in the S. cerevisiae strain CENPK2-1C to avaliate the enzymes functionality. Our results showed that a gene annotated in the S. arborariae genome (present in S. passalidarum) as xylose reductase does not have activity with this sugar, and probably is a putative aldo-keto reductase of unknown specificity. Another gene was amplified from S. arborariae and S. passalidarum, and when these genes were expressed in S. cerevisiae a xylose reductase enzymatic activity with both NADH and NADPH were observed with the S. arborariae gene, but in the case of the S. passalidarum gene we obtained a NADPH-dependent xylose reductase activity. The activity of xylitol dehydrogenase expressed in S. cerevisiae was completely NAD+-dependent. S. cerevisiae recombinants, enconding the different enzymes of xylose metabolismo, was able to grow on xylose with a xylose comsumption, low yield of ethanol and significative xylitol production. It presumably due the low expression of xylitol dehydrogenase and incresing XR/XDH ration activity. Indeed, in xylose batch fermentation the recombinant cells were able to produce more xylitol than ethanol and xylose/glucose batch fermentation, the recombinant cells produce more xylitol and acetate than ethanol from xylose, that probably indicating the cofactor unbalance determining the carbons from xylose fate. Thus, our results indicate the presence of several different xylose reductases in the genome of Spathaspora yeast could be a contribution to optimize the second-generation ethanol.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-24T19:07:39Z No. of bitstreams: 1 2018_HenriqueCésarTeixeiraVeras.pdf: 6454993 bytes, checksum: f2e75e0b6ae77a86767b5929dc2cfd76 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-29T20:55:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_HenriqueCésarTeixeiraVeras.pdf: 6454993 bytes, checksum: f2e75e0b6ae77a86767b5929dc2cfd76 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-29T20:55:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_HenriqueCésarTeixeiraVeras.pdf: 6454993 bytes, checksum: f2e75e0b6ae77a86767b5929dc2cfd76 (MD5) Previous issue date: 2018-08-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A demanda mundial por combustível continua crescendo. Entre as fontes alternativas de energia a produção de etanol tem lugar de destaque. No entanto, está produção ainda pode aumentar com o aproveitamento da xilose proveniente da biomassa lignocelulósica. Vários estudos estão sendo realizados para identificar os mecanismos moleculares envolvidos no metabolismo de xilose. Neste estudo é proposto a integração dados fisiológicas e moleculares para caracterizar o fluxo metabólico de leveduras. Foi avaliado a capacidade fermentativa entre diferentes leveduras naturalmente consumidoras de xilose: Scheffersomyces stipitis, Spathaspora passalidarum, Spathaspora arborariae e Candida tenuis. Para entender o metabolismo dessas leveduras foi construído um modelo de fluxo metabólico utilizando as taxas de produção para restringir o modelo e calcular a distribuição interna de carbono. Pela primeira vez, é estimado o fluxo metabólico nas leveduras Spathaspora. O modelo de fluxo metabólico de xilose até a formação de etanol foi inicialmente validado a partir do teste de correlação entre fluxos calculados e medidos. O modelo de fluxo metabólico foi útil para aumentar a acurácia de dados de metaboloma. 74% das taxas de fluxos calculados e medidos apresentaram semelhanças acima de 90%. O modelo caracterizou a S. stipitis e S. passalidarum como tendo as melhores propriedades naturais para fermentar xilose e produzir etanol. / Global demand for fuel continues to grow. Among the alternative sources of energy, the production of ethanol has a prominent place. However, this production can yet increase with the use of xylose from the lignocellulosic biomass. Several studies are being carried out to identify the molecular mechanisms involved in the metabolism of xylose. In this study it is proposed the integration of physiological and molecular data to characterize the metabolic flux of yeasts. It was assessed the fermentative capacity among different yeasts naturally consuming xylose: Scheffersomyces stipitis, Spathaspora passalidarum, Spathaspora arborariae and Candida tenuis. To understand the metabolism of these yeasts a metabolic flux model was constructed using the production rates to constrain the model and to calculate the internal carbon distribution. For the first time, is estimated the metabolic flux into Spathaspora yeasts. The metabolic flux model was initially validated from a correlation test between calculated and measured fluxes. The metabolic flux model was useful to increase accuracy of metabolome data. 74% of calculated and measured fluxes rate shown similarity above 90%. The model characterized S. stipitis and S. passalidarum as having the best natural properties for fermenting xylose and producing ethanol.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-13T19:30:08Z No. of bitstreams: 1 Tese - Luciana Cassa Araujo Barbosa.pdf: 12165602 bytes, checksum: 1f24636f21c802a50b8554825e94f7aa (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-15T18:25:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Luciana Cassa Araujo Barbosa.pdf: 12165602 bytes, checksum: 1f24636f21c802a50b8554825e94f7aa (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-15T18:29:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Luciana Cassa Araujo Barbosa.pdf: 12165602 bytes, checksum: 1f24636f21c802a50b8554825e94f7aa (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-15T18:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Luciana Cassa Araujo Barbosa.pdf: 12165602 bytes, checksum: 1f24636f21c802a50b8554825e94f7aa (MD5) Previous issue date: 2012-03-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The agro-industrial waste is renewable sources of carbon and energy and can be used for the production of food, feed, chemical compounds, and fuels liquids. The Brazil generates various agro-industrial waste, including the bagasse sugarcane It is the most abundant. This lignocellulosic biomass is rich in carbohydrates metabolizable an economically viable, provided there is adequate hydrolysis material. The deranged hydrolysis the fibers of the three majority polymers of plant biomass (Cellulose, hemicellulose and lignin), making them more accessible to hydrolytic enzymes microbial. This process, in addition to releasing the monomers and small saccharides fermentable, generates inhibitors of microbial growth and fermentation of the material hydrolyzate. The monomers generated by the hydrolysis of hemicellulose fraction are not composed solely of glucose such as starch and cellulosic substrates. They contain, among others wide concentration of pentoses which are not metabolized by all microorganisms. Aiming to get yeast with attributes needed to use the biomass, emphasizing the hemicellulose fraction, investigated the following rich sources of natural hydrolysates: faeces and saliva of ruminants (cattle), as well as digestive tubes immature insects that feed on wood. The culture media used for isolation and cultivation (solid and liquid) were made with hydrolyzed hemicellulose bagasse from sugarcane, obtained by acid hydrolysis. Microorganisms isolates were selected based on their characteristics of use pentose xylose (majority in hemicellulose) and arabinose, aimed at better use of lignocellulosic biomass. 237 were isolated colonies of unicellular microorganisms, through selective. Of these, 231 colonies were subjected to sugar assimilation tests, among which 125 were able to grow using hydrolyzed hemicellulose, xylose or arabinose as carbon source. They stood out, as growth in size, 57 colonies were selected and had the ITS1 - 5.8S rDNA sequenced. After selection for biomass accumulation in a sequenced yeast was chosen and investigated, by response surface methods for optimizing the production of biomass Microbial from hemicellulose hydrolyzate. The sequenced strains formed 05 different groups in the phylogenetic tree and had high similarity with Meyerozyma caribbica, Meyerozyma guilliermondi, micotoxinivorans Trichosporon, Trichosporon loubieri, Pichia kudriavzevii, Candida ethanolic lignohabitants and Candida. A strain with 99% similarity to Meyerozyma caribbica, isolated from bovine feces, accumulated 14,21g / L biomass in 72h in simple batch cultivation type (using instrumented fermenter), being able to tolerate up to 90% hemicellulose hydrolyzate in dry biomass accumulation around 12,43g / L, (Qx = 0.44g / L-1 h-1) after 27 hours cultivation experiments with conical bottles. This yeast produced 14,8g / L xylitol (Qxilt = 0.55 g / L-1h-1) 27 hours of cultivation. / Os resíduos agroindustriais são fontes renováveis de carbono e energia e podem ser utilizados para produção de alimentos, forragens, compostos químicos, além de combustíveis líquidos. O Brasil gera diversos resíduos agroindustriais, entre eles, o bagaço de cana-deaçúcar é o mais abundante. Esta biomassa lignocelulósica é rica em carboidratos metabolizáveis de forma economicamente viável, desde que haja hidrólise adequada do material. A hidrólise desarranja as fibras dos três polímeros majoritários da biomassa vegetal (celulose, hemicelulose e lignina), tornando-as mais acessíveis às enzimas hidrolíticas microbianas. Este processo, além de liberar os monômeros e pequenos sacarídeos fermentáveis, gera inibidores do crescimento microbiano e da fermentação do material hidrolisado. Os monômeros gerados pela hidrólise da fração hemicelulósica não são compostos apenas de glicose, como os substratos amiláceos e celulósicos. Eles contêm, entre outros, vasta concentração de pentoses que não são metabolizadas por todos os microrganismos. Objetivando obter leveduras com atributos necessários ao aproveitamento da biomassa, com ênfase na fração hemicelulósica, investigaram-se as seguintes fontes ricas em hidrolisados naturais: fezes e salivas de ruminantes (bovinos), como também tubos digestivos de insetos imaturos que se alimentam de madeira. Os meios de cultura utilizados para isolamento e cultivo (sólidos e líquidos) foram confeccionados com hidrolisado hemicelulósico do bagaço da cana-de-açúcar, obtido por hidrólise ácida. Os microrganismos isolados foram selecionados com base em suas características de utilização das pentoses xilose (majoritária na hemicelulose) e arabinose, visando o melhor aproveitamento da biomassa lignocelulósica. Foram isoladas 237 colônias de microrganismos unicelulares, em meio seletivo. Destas, 231 colônias foram submetidas aos ensaios de assimilação de açúcares, entre as quais 125 foram capazes de crescer utilizando hidrolisado hemicelulósico, xilose ou arabinose como fonte de carbono. Destacaram-se, quanto ao crescimento em tamanho, 57 colônias que foram selecionadas e tiveram a região ITS1 – 5.8S rDNA sequenciada. Após seleção para acúmulo em biomassa, uma levedura sequenciada foi escolhida e investigada, através de métodos de superfície de resposta para otimização da produção de biomassa microbiana a partir do hidrolisado hemicelulósico. As cepas sequenciadas formaram 05 grupos distintos na árvore filogenética e tiveram alta similaridade com Meyerozyma caribbica, Meyerozyma guilliermondi, Trichosporon micotoxinivorans, Trichosporon loubieri, Pichia kudriavzevii, Candida lignohabitants e Candida etanolica. Uma cepa com 99% de similaridade com Meyerozyma caribbica, isolada a partir de fezes de bovinos, acumulou 14,21g/L de biomassa em 72h, em cultivo tipo batelada simples (utilizando fermentador instrumentado), sendo capaz de tolerar até 90% de hidrolisado hemicelulósico com acúmulo de biomassa seca em torno de 12,43g/L, (Qx = 0,44g/L-1h-1), após 27 horas de cultivo, em experimentos com frascos cônicos. Esta levedura produziu 14,8g/L de xilitol (Qxilt=0,55 g/L-1h-1) em 27 horas de cultivo.

Fazemos parte de um cenário mundial em que o esgotamento das fontes de energias fósseis atrelado à poluição gerada por esse uso, preocupam os diferentes setores do comércio, da indústria, do governo e das instituições em defesa do meio ambiente. Nesse sentido, a busca por novas fontes energéticas renováveis tem dirigido diversas pesquisas, além de drenar bilhões de dólares em investimentos. Uma das linhas de pesquisa mais importantes é a da produção do etanol de segunda geração (2G), um etanol produzido a partir dos resíduos gerados na produção do etanol de primeira geração. No caso do Brasil, esses resíduos compreendem principalmente a palha e o bagaço de cana-de-açúcar; essa biomassa é formada majoritariamente por celulose (&#8764;45%), hemicelulose (&#8764;25%) e lignina (&#8764;20), e sua hidrólise envolve pré-tratamentos adequados e uso de enzimas que agem especificamente em seus alvos. Dessa forma, a produtividade de etanol aumenta, sem necessariamente ampliar áreas de cultivo. Essa vertente é muito promissora, porém os custos ainda são relativamente altos e a aplicabilidade depende bastante de adaptações do setor industrial e aprimoramentos na produção em si (atividade específica das enzimas e sua ação sinérgica). O objetivo principal deste projeto é reconhecer e mapear as bases moleculares que comandam a atividade da enzima xilose isomerase (XI), que converte xilose (presença majoritária na hemicelulose) em xilulose, possibilitando a utilização desta por Saccharomyces cerevisiae (já que a xilose não é fermentescível), para obtenção do etanol de segunda geração como produto final. Para isso, foi realizada uma busca extensiva de genes de diversos microrganismos, que codifiquem para XI, e que essas ainda não possuam estruturas resolvidas publicadas. A maioria das ORFs (Open Reading Frame, do inglês), ou regiões codificadoras, foram amplificadas, clonadas em vetores específicos e transformadas em bactérias Escherichia coli Rosetta (DE3). Parte dessas cepas transformadas resultaram na produção da XI de interesse. Com isso, foi possível obter cristais e iniciar a resolução de estruturas cristalográficas. Esses resultados foram cruzados e correlacionados com os de atividade enzimática, cinética química e estabilidade térmica, fornecendo boa perspectiva para o entendimento das bases moleculares que regem a atividade xilose isomerásica. / We are part of a world scenario in which the depletion of fossil energy sources linked to the pollution generated by this use, concern the different sectors of commerce, industry, government and institutions in defense of the environment. In this regard, the search for new renewable energy sources has headed many researches, besides generating billions of dollars in investments. One of the most important research lines is the production of second generation ethanol (2G), an ethanol produced from the waste generated in the production of the first generation one. In the case of Brazil, these residues mainly include sugar cane straw and bagasse. This biomass is mostly composed of cellulose (&#8764;45%), hemicellulose (&#8764;25%) and lignin (&#8764;20), and its hydrolysis involves adequate pre-treatments and the use of enzymes that specifically act on their targets. In this way, ethanol productivity increases without necessarily expanding growing areas. This aspect is very promising, but the costs are still relatively high and the applicability badly depends on adaptations of the industrial sector and improvements in the production itself (specific activity of the enzymes and their synergistic action with others). The main goal of this project is to recognize and map the molecular bases that control the activity of the enzyme xylose isomerase (XI), which converts xylose (the mostly present carbohydrate in hemicellulose) into xylulose, allowing its use by Saccharomyces cerevisiae (since xylose is not fermentable), to obtain the second generation ethanol as final product. To reach this, an extensive search of genes of several microorganisms, that code for XI, and still do not have solved high resolution structures published are carried out. Most ORFs (Open Reading Frames) were amplified, cloned into specific vectors and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) bacteria. Some of these transformed strains leaded to the production of XI of interest. Furthermore, it was possible to obtain protein crystals and to start trying to solve crystallographic structures. These results were cross - checked and correlated with those of enzymatic activity, chemical kinetics and thermal stability, providing a good perspective for understanding the molecular bases which govern isomerase activity.