Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de 39 isolados bacterianos para produção de polihidroxialcanoatos contendo monômeros de cadeia média (PHA|MCL). Os isolados foram incapazes de utilizar eficientemente amido, lactose ou sacarose. O desempenho na produção de PHA a partir de glicose ou frutose pelos isolados foi inferior à linhagem de referência (Pseudomonas sp. LFM046). Muitos dos isolados apresentaram bom desempenho na conversão de glicerol em PHAMCL. Pela primeira vez, foram detectadas bactérias capazes de produzir PHAMCL a partir de xilose. Com base no sequenciamento do rDNA 16S, estes isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Pseudomonas. Cultivos em biorreator, resultaram em uma biomassa de aproximadamente 6 g/L, contendo cerca de 11 a 14% de PHA. A superexpressão dos genes responsáveis pelo catabolismo de xilose (xylAB) em Escherichia coli não levou a melhora no consumo de xilose ou produção de PHAMCL. / This work aimed to evaluate the potential of 39 bacterial isolates to produce polyhydroxyalkanoates containing medium-chain monomers (PHAMCL). The isolates were unable to efficiently utilize starch, lactose or sucrose. The performance of the PHA production from glucose or fructose by the isolates was lower than the reference strain (Pseudomonas sp. LFM046). Many isolates showed good performance in the conversion of glycerol into PHAMCL. For the first time, bacterial isolates capable of producing PHAMCL from xylose were detected. Based on the sequencing of 16S rDNA, these isolates were identified as belonging to the genus Pseudomonas. Bioreactor cultures resulted in a biomass of approximately 6 g/L, containing about 11 to 14% PHA. Overexpression of the genes responsible for the catabolism of xylose (xylAB) in Escherichia coli did not led to improved xylose consumption or production of PHAMCL.

Orientador: Telma Teixeira Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T00:32:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anschau_Andreia_D.pdf: 2032545 bytes, checksum: 8d4ec316020e160cada0e585617e1659 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidos estudos visando o estabelecimento de um processo de produção de lipídeos microbianos a partir de fontes renováveis, particularmente xilose, carboidrato derivado do processo de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. Foi utilizada a levedura oleaginosa Lipomyces starkeyi DSM 70296, previamente selecionada no Laboratório de Engenharia Bioquímica, Biorefino e Produtos de Origem Renovável (LEBBPOR). A partir dos resultados preliminares em frascos agitados, partiu-se para estudos de batelada alimentada em biorreator (1,3 a 3L). Foram estudadas diferentes estratégias de alimentação, sendo que em batelada alimentada repetida, foram encontradas as maiores concentrações de células (85,4 g/L) e de lipídeos (41,8 g/L). Posteriormente foram estudados modos de operação em processos contínuos em meio sintético e meio contento o hidrolisado hemicelulósico (H-H). As maiores produtividades de células (0,443 g/g) e de lipídeos (0,236 g/g) foram encontradas em cultivo contínuo a 0,03h-1. Na vazão específica de alimentação de 0,06 h-1 foram obtidas as maiores produtividades de células (0,600 g/L.h) e de lipídeos (0.288 g/L.h). Análises de cromatografia em fase gasosa dos diferentes cultivos feitos revelaram que os principais constituintes deste complexo são os ácidos graxos de cadeia longa, como o ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1) e ácido linoleico. Foi estimado o número de cetano em torno de 61, muito próximo do biodiesel de palma. Também foram feitos estudos de balanço de massa e de energia em cultivo batelada alimentada utilizando somente xilose como fonte de carbono. O valor de calor de combustão (Qc) de 25,7 kJ/g obtido após 142 h de cultivo representa aproximadamente 56% do conteúdo energético do óleo diesel (45,4 kJ/g), indicando o potencial da L. starkeyi para biodiesel. Cultivos contínuos subsequentes foram feitos para a compreensão do processo de acúmulo de lipídeos, utilizando a ferramenta estatística de reconciliação de dados para melhorar os dados experimentais obtidos em quimiostato, reduzindo os erros experimentais para posterior cálculo de análise de fluxos metabólicos (MFA). Nesse sentido, os lipídeos produzidos por L. starkeyi apresentam relevante importância do ponto de vista acadêmico e industrial, podendo ser utilizados como matéria-prima para biodiesel e indústria oleoquímica / Abstract: Studies attempting the establishment of a microbial lipid production process from renewable resources, mainly xylose, were developed. This pentose, obtained from sugar cane bagasse hydrolysis. The oleaginous yeast Lipomyces starkeyi DSM 70296, previously selected at the Laboratory of Biochemical Engineering, Biorefining and Products from Renewable Sources (LEBBPOR), was used throughout this thesis. After preliminary studies in shake flasks, we started fed-batch studies in fermentor (1.3 to 3L). Among the strategies studied, the highest cell mass and lipid concentrations reached up to 85.4 and 41.8 g/L, respectively, when repeated fed?batch strategy was applied. Subsequently, continuous processes were studied in synthetic medium and media containing hemicellulosic hydrolysate (H-H). The highest overall cell mass (0.443 g/g) and lipid yields (0.236 g/g) were achieved at dilution rate of 0.03 h-1. At dilution rate of 0.06 h-1, were obtained the highest productivities of cell mass (0.600 g/L.h) and lipids (0.288 g/L.h). Gas chromatography of esterified lipids revealed that the major constituents of this complex are long-chain fatty acids, such as palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), and linoleic acid (C18:2) with an estimated cetane (around 61) very close to the palm biodiesel. Also have been studies of mass and energy balances from fed-batch cultivation using xylose as sole carbon source. The combustion heat (Qc) value 25.7 (kJ/g) obtained after 142 h of fed-batch cultivation, represents approximately 56% of the energy content of diesel oil (45.4 kJ/g), indicating the potential of L. starkeyi for biodiesel. Continuous cultures were made subsequently to understanding the process of lipid accumulation using a statistical tool for data reconciliation was used to improve the experimental data obtained in chemostat culture reducing the experimental errors for subsequent calculation of metabolic flux analysis (MFA). In this sense, lipids produced by L. starkeyi have relevant importance of academic and industrial point of view, as feedstock for biodiesel and oleochemical industry applications / Doutorado / Processos em Tecnologia Química / Doutora em Engenharia Quimica

Orientadores: Gustavo Henrique Goldman, Juliana Velasco de Castro Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T09:59:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Utsunomia_Camila_M.pdf: 2245062 bytes, checksum: 1803b81f54da154433e6d40c34e2b884 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção de etanol a partir de resíduos agrícolas, denominada Etanol de Segunda Geração ou Etanol Lignocelulósico, surge como uma alternativa para aumentar a produção de etanol sem necessariamente expandir as áreas destinadas ao cultivo da matéria-prima. A conversão da biomassa em etanol não é economicamente favorável a não ser que a hemicelulose seja utilizada juntamente com a celulose. Entretanto, a levedura Saccharomyces cerevisiae é incapaz de fermentar pentoses, açúcares liberados pela hidrólise da hemicelulose, principalmente xilose. Uma alternativa para que S. cerevisiae produza etanol utilizando pentoses seria modificá-la geneticamente através do uso de genes provenientes de micro-organismos que naturalmente realizam esta conversão. Com o intuito de encontrar novas leveduras assimiladoras de xilose, prospectamos o trato intestinal de larvas de seis insetos parasitas da cana-de-açúcar e dornas de fermentação alcoólica, identificando 49 isolados, dentre eles as leveduras Rhodotorula mucilaginosa UC11 e Ogataea polymorpha FT212L. Neste trabalho, foi feito o isolamento e a caracterização dos genes xyl1 e xyl2, que codificam respectivamente à xilose redutase (XR) e à xilitol desidrogenase (XDH) dessas duas leveduras, assim como a clonagem e a superexpressão de tais genes na cepa industrial de S. cerevisiae Pedra-2 (PE-2). Rhodotorula mucilaginosa UC11 e O. polymorpha FT212L foram avaliadas quanto a habilidade de crescerem em xilose, a expressão dos genes xyl1 e xyl2 e a medição das atividades das enzimas XR e XDH. E pela primeira vez XR e XDH de ambas as leveduras foram expressas heterologamente em S. cerevisiae PE-2 gerando as cepas PE-2 Rm, PE-2 Op 1 e PE-2 Op 2, que foram testadas quanto a capacidade de utilizar xilose para crescimento. Adicionalmente, neste trabalho também foi construída pela primeira vez uma cepa S. cerevisiae PE-2 contendo os genes de Scheffersomyces stipitis, uma vez que esta é uma das melhores leveduras conhecidas capazes de utilizar xilose. Para isso a cepa PE-2 foi modificada geneticamente com o plasmídio pRH 274, contendo os genes superexpressos de xyl1 e xyl2 de S. stipitis e o gene xks1 de S. cerevisiae, que codifica à xilulose quinase (XK), gerando a cepa denominada PE-2 274. Esta levedura recombinante foi caracterizada através de ensaios de curva de crescimento, medição das atividades de XR e XDH e capacidade de co-fermentar xilose e glicose a etanol em biorreator. A cepa PE-2 274 mostrou ser uma cepa de grande potencial para a produção de etanol a partir de meio contendo xilose e glicose, podendo ser a base para a geração de uma cepa competitiva em ambiente industrial visando à produção do etanol de segunda geração / Abstract: The ethanol production from agricultural residues, called Second Generation Ethanol or Lignocellulosic Ethanol, arises as an alternative to increase the ethanol production without necessarily expanding the areas for raw material cultivation. The biomass conversion to ethanol is not economically feasible unless hemicellulose is used in addition to cellulose. However, the yeast Saccharomyces cerevisiae is unable to ferment pentoses, released sugars from hemicellulose hydrolysis, mainly xylose. An alternative to S. cerevisiae produces ethanol from pentose is the genetic engineering with genes from microorganisms which naturally perform this conversion. In order to find new yeasts capable to use xylose, we prospected the gut of sugarcane parasitic insects larvae and alcoholic fermentation tanks, identifying 49 isolates, among them the yeasts Rhodotorula mucilaginosa UC11 e Ogataea polymorpha FT212L. In this work were made the isolation and characterization of xyl1 and xyl2 genes, which encode xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH), respectively, from these two yeasts, and the cloning and overexpression of these genes in the industrial S. cerevisiae strain Pedra-2 (PE-2). Rhodotorula mucilaginosa UC11 and O. polymorpha FT212L were evaluated over the ability to grow on xylose, xyl1 and xyl2 expression analysis and XR and XDH activity. And for the first time XR and XDH from both yeasts were heterologous expressed in S. cerevisiae PE-2 generating PE-2 Rm, PE-2 Op 1 and PE-2 Op 2 strains, which were tested by the capability to grow on xylose. Additionally, in this work was constructed also for the first time a S. cerevisiae PE-2 strain with genes from Scheffersomyces stipitis, since this is one of the best known yeasts capable of utilizing xylose. For this, PE-2 was engineered with pRH 274 plasmid, containing xyl1 and xyl2 from S. stipitis and xks1 from S. cerevisiae, which encodes xylulokinase (XK), generating the PE-2 274 strain. This recombinant strain was characterized through xylose growing assays, XR and XDH activity and xylose/glucose co-fermentation to ethanol in bioreactor. PE-2 274 showed a high potential to produce ethanol from xylose and glucose, and could be the basis for the generation of industrially competitive yeast aiming the second generation ethanol production / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Ana Carolina Deckmann / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coradini_AlessandroLuisVenega_M.pdf: 2904811 bytes, checksum: 79be0b1291d380e8c86253645ed455d8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A crise energética mundial aliada aos problemas ambientais tem despertado grande preocupação mundial, aumentando assim a busca por combustíveis mais "limpos" que possam substituir os já existentes. Dentre estes substitutos podemos destacar os chamados biocombustíveis, como o etanol e o biodiesel. No caso da produção de biodiesel, diversas fontes de lipídios são consideradas, incluindo óleos vegetais, gorduras animais e óleos reciclados. O uso de microrganismos oleaginosos foi apresentado como uma fonte alternativa de óleos e gorduras de baixo custo (Meng et al., 2009). O óleo produzido por microrganismos pode ter como substrato qualquer fonte de carbono, incluindo bagaços e resíduos agrícolas em geral, evitando tanto a competição por áreas de plantio como agregando valor a dejetos de outros setores agrícolas. A esta abordagem dá-se o nome de "biocombustíveis de segunda geração". Neste contexto, as leveduras surgem como fortes candidatas à produção de biodiesel, uma vez que diversas ferramentas de cultivo e manipulação já foram implantadas especialmente para o uso de leveduras em processos industriais e biotecnológicos. Entretanto, nem todas as espécies de leveduras são adequadas para a produção de óleo, uma vez que a capacidade de acumular grandes quantidades de lipídeos varia significativamente entre as espécies. As leveduras do gênero Saccharomyces, por exemplo, apresentam de 8-15 de lipídeos totais em relação à massa seca. Outras, como as espécies Rhodotorula graminis, Rhodotorula gracilis e Lipomyces starkeyi, apresentam cerca de 30%, 60% e 65% de lipídeos totais, respectivamente. Entretanto, o emprego de microrganismos selvagens (i.e., não domesticados) limita o controle dos parâmetros que afetam o processo produtivo, uma vez que as bioconversões de interesse dependem de ajustes metabólicos desconhecidos, e a falta de conhecimento genético destes microrganismos dificulta a aplicação de técnicas de manipulação genética. Assim, o presente estudo teve como objetivo "domesticar" a linhagem DSM70826 da levedura Lipomyces starkeyi tornando-a de fácil manipulação genética e tornando-a uma plataforma para posterior introdução de características que possam melhorar o seu desempenho quanto ao acúmulo de lipídeos para produção de biodiesel. Uma vez que foi realizado o sequenciamento do genoma desta levedura durante trabalho anterior conduzido em nosso laboratório, também objetivamos utilizar este banco de dados para identificar e estudar alguns genes considerados relevantes aos processos fermentativos de xilose e também ao acúmulo de lipídeos, auxiliando a elucidar as principais rotas metabólicas envolvidas nestes processos / Abstract: The global energy crisis combined with environmental problems has aroused great worldwide concern, increasing the search for "cleaner" fuels that can replace existing ones. Among these substitutes the so-called biofuels, such as ethanol and biodiesel can be highlighted. In the case of biodiesel, different fat sources are considered, including vegetable oils, animal fats and recycled oils. The use of oleaginous microorganisms was presented as an alternative source of low cost oils and fat (Meng et al., 2009). The oil produced by microorganisms can use any substrate as carbon source, including bagasse and agricultural waste in general, avoiding the competition for growing areas and adding value to waste of other agricultural sectors. This approach is called "second generation biofuels". In this context, yeasts appear as strong candidates for biodiesel production, since many manipulation and cultivation tools have been implemented especially for the use of yeast in industrial and biotechnological processes. However, not all species of yeasts are suitable for the production of oil, since the ability to accumulate large amounts of lipids varies significantly between species. Yeasts of the genus Saccharomyces, for example, show 8-15% of total lipids in the dry mass. Others, such as the species Rhodotorula graminis, Rhodotorula gracilis and Lipomyces starkeyi, have about 30 %, 60% and 65% of total lipids, respectively. However, the use of wild microorganisms (i.e., non-domesticated) limits the control parameters that affect the production process, since bioconversions of interest depend of unknown metabolic adjustments, and lack of genetic knowledge of these microorganisms hinders the application of genetic manipulation techniques. Therefore, the present study aimed to "domesticate" the yeast strain Lipomyces starkeyi DSM70826 making it easy genetic manipulation and making it a platform for subsequent introduction of features that can improve your performance on lipid accumulation for production of biodiesel. Since the genome sequencing of this yeast was performed during previous work conducted in our laboratory, we also aim to use this database to identify and study some genes considered relevant to xylose fermentation processes and also to lipid accumulation, helping to elucidate the main metabolic pathways involved in these processes / Mestrado / Engenharia de Processos / Mestre em Engenharia Química

O presente trabalho teve como objetivo avaliar como algumas condições de pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com H2SO4 diluído influenciam a distribuição granulométrica do bagaço de cana, a composição química dos sólidos pré-tratados e hidrolisados hemicelulósicos, além da digestibilidade enzimática dos sólidos pré-tratados. Para isso, previamente, uma amostra de bagaço de cana-de-açúcar in natura foi caracterizada quanto suas composições percentuais; a distribuição granulométrica de suas fibras também foi avaliada antes e após o pré-tratamento. O pré-tratamento do bagaço com H2SO4 diluído foi realizado em reator piloto, aquecido por vapor direto, com capacidade de 100 L, onde o teor inicial de sólidos foi fixado em 15% (p/p). A temperatura (131,91-168,09 °C), tempo de residência (11,90-48,09 min) e concentração ácida (0,19 - 3,81 p/p) variaram de acordo com um planejamento fatorial 23. Após o pré-tratamento, os bagaços pré-tratados e hidrolisados hemicelulósicos foram caracterizados quanto suas composições químicas. A composição química dos bagaços in natura e pré-tratados, assim como a composição química dos hidrolisados, foi determinada por gravimetria, espectrofotometria e cromatografia líquida de alta eficiência. De acordo com a condição de pré-tratamento, os teores de celulose, hemicelulose e lignina nos bagaços pré-tratados diferiram substancialmente sendo que a maior variação foi observada para hemicelulose (0,14-17,62 %). Os três fatores avaliados no pré-tratamento influenciaram a composição química do bagaço pré-tratado, sendo que a variável com maior poder de influência no teor de celulose, hemicelulose e lignina dos sólidos foi a concentração ácida, seguida da temperatura e tempo de reação. Xilose foi o açúcar predominante nos hidrolisados hemicelulósicos variando de 1,43 a 21,05 g/L, de acordo com o planejamento. A concentração de furfural variou entre 0,08 e 4,68 g/L. Condições severas de pré-tratamento acarretaram na maior remoção de hemicelulose dos bagaços pré-tratados, porém nestas mesmas condições foram encontradas baixas concentrações de xilose e altas concentrações de furfural nos hidrolisados. A concentração de xilose no hidrolisado se mostrou dependente da temperatura e da concentração ácida. A variável com maior influência na formação de furfural foi a temperatura, seguida pela concentração ácida e tempo. A digestibilidade enzimática dos bagaços obtidos de acordo com planejamento experimental em 24 h variou de 25,35 a 63,76%, conforme a composição química dos sólidos. A temperatura de pré-tratamento foi o fator que exerceu maior influência na conversão da celulose dos sólidos. Com o intuito de avaliar o efeito da lavagem dos sólidos na digestibilidade enzimática da celulose, bagaços pré-tratados obtidos nas condições mais branda e severa de pré-tratamento, lavados e não-lavados, foram submetidos à sacarificação enzimática. A sacarificação de bagaços não-lavados foi prejudicada pela presença de inibidores nos hidrolisados hemicelulósicos, variando entre 0- 23,9%, em 72h. As condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar que maximizam a concentração de xilose no hidrolisado hemicelulósico e a sacarificação enzimática do bagaço pré-tratado são diferentes. O pré-tratamento com H2SO4 diluído acarretou na diminuição do tamanho das partículas do bagaço de cana. / This study aimed to evaluate how certain pretreatment conditions of sugarcane bagasse with dilute H2SO4 influence the size distribution of sugarcane bagasse, the chemical composition of solids pretreated and hemicellulosic hydrolysate, as well the enzymatic digestibility of pretreated solids. For that, previously, a sample of in natura sugarcane bagasse was characterized in terms of chemical composition; the size distribution of fibers was also evaluated before and after the pretreatment. The experiments of pretreatment of bagasse with dilute H2SO4 were conducted in a pilot reactor, heated by direct steam, with a capacity of 100 L, where the initial solids content was fixed at 15% (w / w). The temperature (131.91 to 168.09 ° C), residence time (11.90 to 48.09 min) and acid concentration (0.19 to 3.81 w / w) varied according to a factorial design 2³ . After pretreatment, the pretreated bagasse and hemicellulosic hydrolysates were characterized in terms of their chemical compositions. The chemical composition of in natura and pretreated bagasse , as well the chemical composition of the hydrolysates, was determined by gravimetry, spectrophotometry and high-efficiency liquid chromatography. According to the condition of pretreatment, cellulose, hemicellulose and lignin content in pretreated bagasse differed substantially, and the major variation was observed for hemicellulose content (0.14 to 17.62%).The three factors evaluated in the pretreatment influenced the chemical composition of pretreated bagasse, and the variable with greatest influence on the content of cellulose, hemicellulose and lignin concentration of solids was acid concentration, followed by temperature and reaction time.. Xylose was the predominant sugar in hemicellulose hydrolysates ranging from 1.43 to 21.05 g / L, according to the experimental design. Furfural concentration varied between 0.08 and 4.68 g / L. Severe conditions of pretreatment resulted in greater removal of hemicellulose from pretreated bagasse, but under these conditions were found low concentrations of xylose and high concentrations of furfural in the hydrolysates. The concentration of xylose in the hemicellulosic hydrolyzate were dependet of temperature and acid concentration. The variable with greatest influence on the formation of furfural was temperature, followed by acid concentration and time. The enzymatic digestibility of the pretreated solids, obtained according to experimental design, in 24 h, ranged from 25.35 to 63.76% depending on the chemical composition of solids. The temperature of the pretreatment was the factor that showed greater influence on the conversion of cellulose solids. In order to evaluate the effect of washing the solids in the enzymatic digestibility of cellulose, pretreated bagasses obtained in milder and severe conditions of pretreatment, non-washed and washed solids, were submitted to enzymatic saccharification. Saccharification of non-washed solids was impaired by the presence of inhibitors in hemicellulosic hydrolysates, ranging from 0 to 23.9% in 72h. The pretreatment conditions of sugarcane bagasse that maximize the concentration of xylose in the hemicellulosic hydrolyzate and enzymatic saccharification of pretreated bagasse are different. Pretreatment with dilute H2SO4 resulted in the decrease of particle size of bagasse.

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.

O etanol de segunda geracao e produzido a partir da hidrolise da biomassa vegetal, liberando os acucares presentes em sua estrutura com sua subsequente fermentacao. Entretanto, um dos desafios em sua producao e a baixa diversidade de microrganismos capazes de fermentar eficientemente a D-xilose, principal acucar no hidrolisado hemicelulosico. Este trabalho avaliou o potencial fermentativo de novas linhagens das leveduras Candida shehatae e Spathaspora arborariae para a producao de etanol a partir de hidrolisado hemicelulosico de bagaco de cana-de-acucar. Foram avaliadas quatro linhagens de C. shehatae em meio YPX (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 50 g/L de D-xilose) e, posteriormente, em hidrolisado hemicelulosico. A levedura C. shehatae CG8-8BY apresentou o melhor desempenho fermentativo em hidrolisado. Apos esta etapa, avaliou-se o efeito da suplementacao do meio na fermentacao de D-xilose por C. shehatae CG8-8BY e S. arborariae UFMG-HM19.1A. O extrato de farelo de arroz na concentracao de 20 g/L demonstrou ser uma fonte de nitrogenio eficiente e de baixo de custo para a suplementacao de hidrolisado hemicelulosico. Por ultimo, foi estudado o efeito da temperatura, agitacao e pH na fermentacao de hidrolisado hemicelulosico por meio de planejamento fatorial completo 23, com tres repeticoes no ponto central, para as duas leveduras. Todos os experimentos foram conduzidos em incubadora de bancada. De acordo com os resultados, o pH e o parametro mais relevante para a producao de etanol pelas linhagens estudadas, seguido da temperatura. Os melhores resultados foram obtidos nas condicoes de 30°C, 150 rpm e pH 5,0, referentes ao ponto central, para as duas linhagens avaliadas. Nestas condicoes, a linhagem C. shehatae CG8-8BY produziu 11,58 g/L de etanol, com fator de rendimento em etanol de 0,26 g/g, produtividade volumetrica de 0,16 g/L.h, eficiencia de fermentacao de 50,36% e consumo de D-xilose de 99,83%. A linhagem S. arborariae UFMG-HM19.1A produziu 11,6 g/L de etanol, com fator de rendimento em etanol de 0,26 g/g, produtividade volumetrica de 0,15 g/L.h, eficiencia de fermentacao de 51,1% e consumo de D-xilose de 88%. Os resultados demonstram que as leveduras estudadas apresentam potencial para producao de etanol de segunda geracao. A importancia do uso de linhagens microbianas eficazes e o aprimoramento dos metodos contribuem para um melhor desenvolvimento desta tecnologia em larga escala. / Second generation ethanol is produced from vegetal biomass, releasing sugars present into its structure with its subsequent fermentation. However, one of the challenges in its production it the low diversity of microorganisms able to ferment efficiently D-xylose, the main sugar in hemicellulosic hydrolysate. This study evaluated the fermentative potential of new yeasts strains Candida shehatae and Spathaspora arborariae UFMG-HM 19.1A to ethanol production from sugarcane hemicellulosic hydrolysate. Four strains of C. shehatae were evaluated in YPX medium (10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 50 g/L D-xylose) and, subsequently, in hemicellulosic hydrolysate. C. shehatae CG8-8BY presented the best fermentative performance in hydrolysate. Then, the effect of medium supplementation in Dxylose fermentation by C. shehatae CG8-8BY e S. arborariae UFMG-HM19.1A were evaluated. Rice bran extract in a concentration of 20 g/L was presented as an efficient and inexpensive nitrogen source for hemicellulosic hydrolysate supplementation. Lastly, it were evaluated the effects of temperature, agitation and pH on hemicellulosic hydrolysate fermentation, studied by full factorial design 23, with three replications at the central point, to both yeasts. All experiments were carried out in rotatory shaker. According to results, pH is the most important parameter to ethanol production by strains studied, followed by temperature. The best results were obtained at 30 °C, 150 rpm and pH 5.0, concerning the central point, for two yeasts evaluated. Accordingly, C. shehatae CG8-8BY strain produced 11.58 g/L of ethanol, with ethanol yield equal 0.26 g/g, productivity equal 0.16 g/L.h, fermentation efficiency equal 50.36% and xylose consumption equal 99.83%. S. arborariae UFMG-HM19.1A strain produced 11.6 g/L of ethanol, with ethanol yield equal 0.26 g/g, productivity equal 0.15 g/L.h, fermentation efficiency equal 51.1% and D-xylose consumption equal 88%. Present data showed that yeasts studied have potential to second generation ethanol production. The importance of use of new effective strains and increasing of methods contributes for a better development of this technology in large scale.

Resíduos lignocelulósicos são substratos proeminentes para a produção sustentável de polihidroxialcanoatos (PHAs) e etanol. A xilose é um dos principais componentes da lignocelulose, mas o aproveitamento eficiente desse açúcar ainda representa uma barreira técnica. O objetivo desse trabalho foi obter linhagens bacterianas mais eficientes no consumo desse açúcar. Foi introduzido maior número de cópias dos genes do catabolismo (xylAB) e transporte (xylFGH) de xilose, nas linhagens Escherichia coli KO11, produtora de etanol, e Burkholderia sacchari LFM 101, produtora de poli-3-hidroxibutirato (PHB). Os recombinantes foram avaliados quanto ao consumo de xilose e produção na presença e ausência de glicose. Para B. sacchari LFM 101 essa estratégia não incrementou o consumo desse açúcar. Para E. coli KO11 xylAB reduziu o tempo de consumo de xilose e aumentou a produção final de etanol em 30%, mas esse efeito foi prejudicado pela repressão catabólica; enquanto xylFGH foi deletério ao reduzir para quase zero o crescimento e produção de etanol por essa linhagem. / Lignocellulosic residues are remarkable substrates for the sustainable production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) and ethanol. Xylose is one of the most important lignocelullose component but its efficient utilization still represents a technical barrier. The aim of this work was to obtain bacterial strains more efficient in the xylose consumption. Multiple copies of the catabolism (xylAB) and transport (xylFGH) genes of xylose were introduced in the ethanol producer Escherichia coli KO11 strain and the poly-3-hydroxybutyrate (PHB) producer Burkholderia sacchari LFM 101. The recombinants strains were evaluated for their production and xylose consumption in the presence and absence of glucose. This strategy did not increase xylose consumption in B. sacchari strains. The xylAB gene improved xylose consumption and increased the ethanol production about 30% in E. coli KO11, but this effect was impaired by catabolite repression; while xylFGH gene was deleterious to reduce the growth and ethanol production by this strain.

O etanol de segunda geracao e produzido a partir da hidrolise da biomassa vegetal, liberando os acucares presentes em sua estrutura com sua subsequente fermentacao. Entretanto, um dos desafios em sua producao e a baixa diversidade de microrganismos capazes de fermentar eficientemente a D-xilose, principal acucar no hidrolisado hemicelulosico. Este trabalho avaliou o potencial fermentativo de novas linhagens das leveduras Candida shehatae e Spathaspora arborariae para a producao de etanol a partir de hidrolisado hemicelulosico de bagaco de cana-de-acucar. Foram avaliadas quatro linhagens de C. shehatae em meio YPX (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 50 g/L de D-xilose) e, posteriormente, em hidrolisado hemicelulosico. A levedura C. shehatae CG8-8BY apresentou o melhor desempenho fermentativo em hidrolisado. Apos esta etapa, avaliou-se o efeito da suplementacao do meio na fermentacao de D-xilose por C. shehatae CG8-8BY e S. arborariae UFMG-HM19.1A. O extrato de farelo de arroz na concentracao de 20 g/L demonstrou ser uma fonte de nitrogenio eficiente e de baixo de custo para a suplementacao de hidrolisado hemicelulosico. Por ultimo, foi estudado o efeito da temperatura, agitacao e pH na fermentacao de hidrolisado hemicelulosico por meio de planejamento fatorial completo 23, com tres repeticoes no ponto central, para as duas leveduras. Todos os experimentos foram conduzidos em incubadora de bancada. De acordo com os resultados, o pH e o parametro mais relevante para a producao de etanol pelas linhagens estudadas, seguido da temperatura. Os melhores resultados foram obtidos nas condicoes de 30°C, 150 rpm e pH 5,0, referentes ao ponto central, para as duas linhagens avaliadas. Nestas condicoes, a linhagem C. shehatae CG8-8BY produziu 11,58 g/L de etanol, com fator de rendimento em etanol de 0,26 g/g, produtividade volumetrica de 0,16 g/L.h, eficiencia de fermentacao de 50,36% e consumo de D-xilose de 99,83%. A linhagem S. arborariae UFMG-HM19.1A produziu 11,6 g/L de etanol, com fator de rendimento em etanol de 0,26 g/g, produtividade volumetrica de 0,15 g/L.h, eficiencia de fermentacao de 51,1% e consumo de D-xilose de 88%. Os resultados demonstram que as leveduras estudadas apresentam potencial para producao de etanol de segunda geracao. A importancia do uso de linhagens microbianas eficazes e o aprimoramento dos metodos contribuem para um melhor desenvolvimento desta tecnologia em larga escala. / Second generation ethanol is produced from vegetal biomass, releasing sugars present into its structure with its subsequent fermentation. However, one of the challenges in its production it the low diversity of microorganisms able to ferment efficiently D-xylose, the main sugar in hemicellulosic hydrolysate. This study evaluated the fermentative potential of new yeasts strains Candida shehatae and Spathaspora arborariae UFMG-HM 19.1A to ethanol production from sugarcane hemicellulosic hydrolysate. Four strains of C. shehatae were evaluated in YPX medium (10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 50 g/L D-xylose) and, subsequently, in hemicellulosic hydrolysate. C. shehatae CG8-8BY presented the best fermentative performance in hydrolysate. Then, the effect of medium supplementation in Dxylose fermentation by C. shehatae CG8-8BY e S. arborariae UFMG-HM19.1A were evaluated. Rice bran extract in a concentration of 20 g/L was presented as an efficient and inexpensive nitrogen source for hemicellulosic hydrolysate supplementation. Lastly, it were evaluated the effects of temperature, agitation and pH on hemicellulosic hydrolysate fermentation, studied by full factorial design 23, with three replications at the central point, to both yeasts. All experiments were carried out in rotatory shaker. According to results, pH is the most important parameter to ethanol production by strains studied, followed by temperature. The best results were obtained at 30 °C, 150 rpm and pH 5.0, concerning the central point, for two yeasts evaluated. Accordingly, C. shehatae CG8-8BY strain produced 11.58 g/L of ethanol, with ethanol yield equal 0.26 g/g, productivity equal 0.16 g/L.h, fermentation efficiency equal 50.36% and xylose consumption equal 99.83%. S. arborariae UFMG-HM19.1A strain produced 11.6 g/L of ethanol, with ethanol yield equal 0.26 g/g, productivity equal 0.15 g/L.h, fermentation efficiency equal 51.1% and D-xylose consumption equal 88%. Present data showed that yeasts studied have potential to second generation ethanol production. The importance of use of new effective strains and increasing of methods contributes for a better development of this technology in large scale.

A levedura Saccharomyces cerevisiae, amplamente utilizada na conversão de glicose e frutose a etanol, não é capaz de fermentar a xilose presente na biomassa lignocelulósica de resíduos agroindustriais. Apesar da introdução da via metabólica dessa pentose em linhagens de S. cerevisiae, a fermentação da xilose simultaneamente com outros açúcares ainda é pouco eficiente. A proposta deste trabalho foi aumentar a eficiência do consumo da xilose por linhagens de S. cerevisiae introduzindo genes de transportadores exógenos identificados em leveduras selvagens que naturalmente fermentam pentoses. A via do metabolismo da xilose foi integrada no genoma de uma linhagem industrial brasileira de S. cerevisiae usada na produção de etanol. A partir desta, linhagens isogênicas foram criadas e mostraram ser mais eficientes no metabolismo da xilose em meio sintético e capazes de co-fermentar glicose e xilose na presença de altas concentrações de inibidores resultantes da hidrólise da biomassa lignocelulósica. Os tranportadores identificados foram testados nas linhagens industriais geneticamente modificadas criadas neste estudo e em linhagens laboratoriais. Não foi possível confirmar a eficiência dos transportadores nas linhagens, embora os resultados mostraram diferenças nas curvas de crescimento das linhagens industriais expressando os transportadores. Este trabalho foi o início de um estudo dos fatores envolvidos no metabolismo da xilose e servirá como base para que futuros trabalhos sejam realizados na obtenção de uma linhagem mais eficiente para produção de etanol de segunda geração. / The yeast Saccharomyces cerevisiae, which efficiently ferments glucose and fructose to ethanol, is unable to ferment xylose present in lignocellulosic biomass of agroindustrial residues. Although the introduction of xylose metabolic pathways in S. cerevisiae strains has been described in the literature, the simultaneous fermentation of xylose and glucose in these modified strains is still very inefficient. The aim of this study was to increase the xylose consumption efficiency of S. cerevisiae by introduction of exogenous genes identified in wild yeast that naturally ferment pentose. The xylose metabolism pathway was integrated into the genome of a Brazilian industrial strain of S. cerevisiae used for the production of ethanol, which was then used to obtain isogenic modified strains. The isogenic strains showed to be more effective in xylose metabolism in synthetic medium and able to co-ferment glucose and xylose in the presence of high concentrations of inhibitors resulting hydrolysis of lignocellulosic biomass. The transporters identified were inserted into genetically modified industrial strains of S. cerevisiae created in this study and also in laboratory strains. It was not possible to confirm the transporters efficiency in laboratory strains but the results showed differences in the growth curves of the industrial strains expressing the transporters. This work was the beginning of a study of the factors involved in xylose metabolism and it will help to prepare future work to obtain an efficient strain for lignocellulosic ethanol production.