O trabalho é proposto visando melhorar o consumo de xilose na bactéria Burkholderia sacchari utilizando o acúmulo de PHB como modelo de produção Foi desenvolvido um processo de evolução por meio da aplicação de feast and famine e Cultivos sequenciais em fase exponencial. Foi obtida uma linhagem mutante com uma velocidade especifica de crescimento de 0,24 h -1. Foi feita uma análise de fluxos metabólicos da qual foi possível concluir que o metabolismo da xilose acontecia em sua maioria pela VP junto com a ED. Foi feito um ensaio de acumulo com carbono marcado utilizando uma solução de xilose, de 20:80 de xilose marcada 13C em todos os carbonos e xilose não marcado, para determinar quais seriam as possíveis vias metabólicas no uso da xilose por parte de B. sacharia LFM 101 e da linhagem evoluída BSEV11. Foi determinado que houve embaralhamento de carbonos, fato que só acontece quando o metabolismo da xilose e feito pela VP junto com a via ED, assim foi possível conferir a via ED como principal via para o metabolismo da xilose em B. sacchari LFM 101. / To evaluate the possibilities of improving the productivity of PHA production from xylose, evolutionary engineering techniques were applied to B. sacchari to select cells with maximum specific growth rates (max) higher than the wild type. Metabolic flux analysis was also performed to evaluate the fluxes through central pathways and the possibility of further improvements by modifying fluxes rates. The evolved strain reached a max of 0.24 ± 0.01 h-1 at the end of the evolutionary process. Strains were submitted to bioreactor experiments. A metabolic network of the strain was usedn to determine the possible distribution of metabolic fluxes. A total of 19 elementary modes were obtained. It was concluded that the metabolism of xylose occurred mostly by VP along with the ED. The ED pathway has the major activity going on in a cyclic way. It was also performed a 13C labeled xylose assay, in which it was possibly to confirm the obtained results from the metabolic flux analyses.

A importância atribuída aos biocombustíveis aumentou de forma drástica nos últimos anos, pois além de reduzir a dependência de petróleo e os gastos com energia fóssil, o uso de fontes de energia renováveis resulta também em uma diminuição significativa das emissões de gases tóxicos para a atmosfera. A biomassa de origem vegetal é uma das mais baratas e abundantes matérias-primas renováveis para o desenvolvimento sustentável e é uma fonte promissora para a produção de biocombustíveis. O bioetanol produzido a partir das frações lignocelulósicas, conhecido como etanol de segunda geração, tem um potencial de mercado promissor como biocombustível. No entanto, a tecnologia do processo ainda está em escala de demonstração. Há grande necessidade de melhorias no processo de produção a fim de reduzir o custo de produção. Caso houvesse a utilização total dos açúcares presentes na biomassa vegetal, existiria uma maior rentabilidade e competitividade, tornando esse processo mais viável. Os polissacarídeos constituintes do material lignocelulósico, como hemicelulose e celulose, por uma reação de hidrólise podem ser transformados em açúcares simples, tais como xilose e glicose, que podem ser utilizados como substrato em processos fermentativos. Algumas linhagens de leveduras não pertencentes ao gênero Saccharomyces possuem a capacidade de bioconversão das pentoses (xilose e arabinose), constituintes da fração hemicelulósica, em etanol. Neste contexto, o presente estudo objetivou isolar leveduras de madeira em fase de decomposição para avaliação das mesmas quanto à capacidade de bioconversão da xilose, principal constituinte da fração hemicelulósica, em etanol. Foram obtidas 83 colônias de leveduras do isolamento, sendo que todas foram inoculadas em meio de xilose como fonte de carbono. Somente onze isolados não apresentaram capacidade de produção de etanol a partir de xilose, os isolados que exibiram essa capacidade apresentaram uma variação de 0,60 até 6,58 g L-1 de etanol. Além dos isolados, quinze linhagens pertencentes a espécies de leveduras já conhecidas como fermentadoras de xilose foram avaliadas quanto à produção de etanol. As linhagens pertencentes às espécies Spathaspora passalidarum (HMD1.3) e Candida shehatae (HM52.2) foram as maiores produtoras de etanol e não apresentaram diferenças significativas entre elas. Dentre todos os isolados obtidos, os isolados I38 e I54 não diferiram entre si, e foram os maiores produtores de etanol. O isolado I38 apresentou resultados significativamente maiores do que as linhagens padrão Spathaspora arborariae HM19.1A e Sheffersomyces stipitis NRRLY7124, enquanto o isolado I54 não diferiu da linhagem padrão HM19.1A, mas foi superior à linhagem NRRLY7124. / The importance given to biofuels drastically increased in the last years, because besides reducing oil dependence and spending on fossil energy, the use of renewable energy sources also results in a significant reduction of toxic gas emissions to the atmosphere. Plant biomass is one of the cheapest and most abundant renewable feedstock for sustainable development and is a promising source for biofuel production. Bioethanol produced from lignocellulosic fractions, known as second generation ethanol, have a promising market potential as a biofuel. However, the process technology is still in demonstration scale. There is a great need for improvements in the production process in order to reduce the production cost. If there was a total utilization of sugars in plant biomass, there would be greater profitability and competitiveness, making this process more feasible. The polysaccharides components of lignocellulosic material, such as cellulose and hemicellulose, by hydrolysis reaction can be transformed into simple sugars such as xylose and glucose, which can be used as substrate for fermentation. Some yeast strains not belonging to the genus Saccharomyces have the ability of bioconversion of pentoses (xylose and arabinose), components of the hemicellulose fraction, to ethanol. In this context, the aim of the present study was the isolation of yeasts from decaying wood, to assess their ability in bioconversion of xylose, the main constituent of the hemicellulosic fraction, to ethanol. Eighty-three colonies were obtained from the yeasts isolation, which all were inoculated in media containing xylose as carbon source. Only eleven strains did not showed the ability of ethanol production from xylose, the strains that exhibited this ability varied between 0.60 to 6.58 g L-1 of ethanol. In addition to the isolated strains, fifteen strains belonging to yeast species already known as xylose fermenters were assessed for ethanol production. The strains belonging to the species Spathaspora passalidarum (HMD1.3) and Candida shehatae (HM52.2) were the largest producers of ethanol and showed no significant differences between them. Among all obtained strains from isolation, I38 and I54 did not differed from each other, and were the largest producers of ethanol. The I38 strain showed results significantly higher than the standard strains Spathaspora arborariae HM19.1A and Sheffersomyces stipitis NRRLY7124, while the I54 strain did not differed from the standard strain HM19.1A, but was higher than the strain NRRLY7124.

A levedura Saccharomyces cerevisiae, amplamente utilizada na conversão de glicose e frutose a etanol, não é capaz de fermentar a xilose presente na biomassa lignocelulósica de resíduos agroindustriais. Apesar da introdução da via metabólica dessa pentose em linhagens de S. cerevisiae, a fermentação da xilose simultaneamente com outros açúcares ainda é pouco eficiente. A proposta deste trabalho foi aumentar a eficiência do consumo da xilose por linhagens de S. cerevisiae introduzindo genes de transportadores exógenos identificados em leveduras selvagens que naturalmente fermentam pentoses. A via do metabolismo da xilose foi integrada no genoma de uma linhagem industrial brasileira de S. cerevisiae usada na produção de etanol. A partir desta, linhagens isogênicas foram criadas e mostraram ser mais eficientes no metabolismo da xilose em meio sintético e capazes de co-fermentar glicose e xilose na presença de altas concentrações de inibidores resultantes da hidrólise da biomassa lignocelulósica. Os tranportadores identificados foram testados nas linhagens industriais geneticamente modificadas criadas neste estudo e em linhagens laboratoriais. Não foi possível confirmar a eficiência dos transportadores nas linhagens, embora os resultados mostraram diferenças nas curvas de crescimento das linhagens industriais expressando os transportadores. Este trabalho foi o início de um estudo dos fatores envolvidos no metabolismo da xilose e servirá como base para que futuros trabalhos sejam realizados na obtenção de uma linhagem mais eficiente para produção de etanol de segunda geração. / The yeast Saccharomyces cerevisiae, which efficiently ferments glucose and fructose to ethanol, is unable to ferment xylose present in lignocellulosic biomass of agroindustrial residues. Although the introduction of xylose metabolic pathways in S. cerevisiae strains has been described in the literature, the simultaneous fermentation of xylose and glucose in these modified strains is still very inefficient. The aim of this study was to increase the xylose consumption efficiency of S. cerevisiae by introduction of exogenous genes identified in wild yeast that naturally ferment pentose. The xylose metabolism pathway was integrated into the genome of a Brazilian industrial strain of S. cerevisiae used for the production of ethanol, which was then used to obtain isogenic modified strains. The isogenic strains showed to be more effective in xylose metabolism in synthetic medium and able to co-ferment glucose and xylose in the presence of high concentrations of inhibitors resulting hydrolysis of lignocellulosic biomass. The transporters identified were inserted into genetically modified industrial strains of S. cerevisiae created in this study and also in laboratory strains. It was not possible to confirm the transporters efficiency in laboratory strains but the results showed differences in the growth curves of the industrial strains expressing the transporters. This work was the beginning of a study of the factors involved in xylose metabolism and it will help to prepare future work to obtain an efficient strain for lignocellulosic ethanol production.

A levedura Saccharomyces cerevisiae, amplamente utilizada na conversão de glicose e frutose a etanol, não é capaz de fermentar a xilose presente na biomassa lignocelulósica de resíduos agroindustriais. Apesar da introdução da via metabólica dessa pentose em linhagens de S. cerevisiae, a fermentação da xilose simultaneamente com outros açúcares ainda é pouco eficiente. A proposta deste trabalho foi aumentar a eficiência do consumo da xilose por linhagens de S. cerevisiae introduzindo genes de transportadores exógenos identificados em leveduras selvagens que naturalmente fermentam pentoses. A via do metabolismo da xilose foi integrada no genoma de uma linhagem industrial brasileira de S. cerevisiae usada na produção de etanol. A partir desta, linhagens isogênicas foram criadas e mostraram ser mais eficientes no metabolismo da xilose em meio sintético e capazes de co-fermentar glicose e xilose na presença de altas concentrações de inibidores resultantes da hidrólise da biomassa lignocelulósica. Os tranportadores identificados foram testados nas linhagens industriais geneticamente modificadas criadas neste estudo e em linhagens laboratoriais. Não foi possível confirmar a eficiência dos transportadores nas linhagens, embora os resultados mostraram diferenças nas curvas de crescimento das linhagens industriais expressando os transportadores. Este trabalho foi o início de um estudo dos fatores envolvidos no metabolismo da xilose e servirá como base para que futuros trabalhos sejam realizados na obtenção de uma linhagem mais eficiente para produção de etanol de segunda geração. / The yeast Saccharomyces cerevisiae, which efficiently ferments glucose and fructose to ethanol, is unable to ferment xylose present in lignocellulosic biomass of agroindustrial residues. Although the introduction of xylose metabolic pathways in S. cerevisiae strains has been described in the literature, the simultaneous fermentation of xylose and glucose in these modified strains is still very inefficient. The aim of this study was to increase the xylose consumption efficiency of S. cerevisiae by introduction of exogenous genes identified in wild yeast that naturally ferment pentose. The xylose metabolism pathway was integrated into the genome of a Brazilian industrial strain of S. cerevisiae used for the production of ethanol, which was then used to obtain isogenic modified strains. The isogenic strains showed to be more effective in xylose metabolism in synthetic medium and able to co-ferment glucose and xylose in the presence of high concentrations of inhibitors resulting hydrolysis of lignocellulosic biomass. The transporters identified were inserted into genetically modified industrial strains of S. cerevisiae created in this study and also in laboratory strains. It was not possible to confirm the transporters efficiency in laboratory strains but the results showed differences in the growth curves of the industrial strains expressing the transporters. This work was the beginning of a study of the factors involved in xylose metabolism and it will help to prepare future work to obtain an efficient strain for lignocellulosic ethanol production.

Submitted by Maria Medeiros (maria.dilva1@ufcg.edu.br) on 2018-10-05T17:08:43Z No. of bitstreams: 1 FLÁVIA CRISTINA DOS SANTOS LIMA - TESE (PPGEP) 2013.pdf: 7673702 bytes, checksum: df6fc75de6798e4e29b04c58f5bd63f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-05T17:08:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FLÁVIA CRISTINA DOS SANTOS LIMA - TESE (PPGEP) 2013.pdf: 7673702 bytes, checksum: df6fc75de6798e4e29b04c58f5bd63f6 (MD5) Previous issue date: 2013-06-14 / Com este trabalho objetivou-se estudar e definir as melhores condições para produção de xilitol utilizando o licor da pré-hidrólise ácida do bagaço do pedúnculo do caju. O bagaço do pedúnculo do caju obtido foi lavado, secado a 55 ºC, moído e peneirado (48 mesh); só então foi caracterizado e submetido a pré-hidrólise ácida utilizando-se H2SO4 a 3%, razão 1:6, por 1 hora. A caracterização da composição lignocelulósica revelou a presença de 18,31 ± 0,071% de celulose, hemicelulose 27,18 ± 0,01% e lignina 23,91 ± 0,02% e, após a pré-hidrólise ácida, 31,50 ± 0,02, 19,30 ± 0,09 e 32,21 ± 0,57% de celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente. Após a realização da pré-hidrólise o licor foi submetido ao processo de remoção por lignina residual para eliminação dos compostos tóxicos ao metabolismo microbiano, de acordo com o planejamento experimental fatorial 23 com três repetições no ponto central; as melhores condições de remoção foram pH e tempo de contato em 4 e 20 min, respectivamente, e massa de lignina residual 0,65 g, obtendo-se uma remoção de 15% de xilose, 20% de glicose, 100% de hidroximetilfurfural e 100% de furfural. Um planejamento fatorial 24 com três repetições no ponto central foi utilizado para verificar a influência das concentrações de sulfato de amônio, cloreto de cálcio, farelo de arroz e do pH meio de fermentação sobre a concentração final de xilitol, produtividade volumétrica em xilitol, eficiência e o fator de conversão de xilose em xilitol. Os ensaios fermentativos foram realizados utilizando-se a levedura Candida guilliermondii CCT 3544, em frascos de erlenmeyer com 50 mL do meio, agitados a 200 rpm, 28 °C de 0 a 96 h. De acordo com os resultados a concentração de cloreto de cálcio e o pH influenciaram significativamente a bioconversão de xilose em xilitol. A análise geral dos resultados levou à conclusão de que 1 g/L de sulfato de amônio, 0,5 g/L de cloreto de cálcio, 5 g/L de farelo de arroz e o pH 4, representam a composição do meio mais adequada para a produção de xilitol no licor pré-hidrolisado do bagaço do pedúnculo de caju. Após a obtenção das melhores condições de cultivo e adsorção foi realizado um ensaio fermentativo em intervalos de tempo 0, 12, 24, 36 e 48 h em frascos de erlenmeyer com capacidade de 250 mL, ampliação de escala em 3 vezes, contendo 150 mL do meio in natura, concentrado e concentrado/tratado, com concentração inicial de células 107 células/mL. De acordo com os resultados, o licor tratado/concentrado representa o meio mais adequado para fermentação com maior concentração celular, 56,4 x 106 células/mL, em 36 h, e produção de xilitol de 3000,14 mg/L, resultando em uma produtividade de 0,063 g/L h com rendimento de bioconversão de 74,47% e eficiência de 81,21%, ao final de 48 h. / This work aimed to study and define the best conditions for xylitol production using liquor acid prehydrolysis of cashew bagasse. The cashew bagasse obtained was washed, dried at 55 ° C, milled and sieved (48 mesh); only then it was characterized and subjected to acid prehydrolysis using H2SO4 at 3%, 1:6 ratio, for 1 hour. The characterization of the lignocellulosic revealed the presence of 18.31 ± 0.071% of cellulose, hemicellulose 27.18 ± 0.01% and lignin 23.91 ± 0.02% and after acid prehydrolysis 31.50 ± 0.02, 19.30 ± 0.09 and 32.21 ± 0.57% cellulose, hemicellulose and lignin, respectively. Upon completion of the prehydrolysis, the liquor was subjected to the removal process by residual lignin for disposal of toxic compounds to microbial metabolism, according to the 23 experimental factorial planning with three replications at the central point, and the best conditions of removal, pH and contact time at 4 and 20 min, respectively and mass of 0.65 g residual lignin, obtaining a removal of 15% of xylose, 20% glucose, 100% hydroxymethylfurfural and 100% furfural. A 24 factorial planning with three replications at the central point was used to verify the influence of the concentrations of ammonium sulfate, calcium chloride, rice bran and pH the fermentation medium about the final concentration of xylitol, xylitol volumetric productivity, efficiency and the conversion factor of xylose to xylitol. The fermentation trials were carried out using the Candida guilliermondii CCT 3544 yeast in erlenmeyer flasks with 50mL of the medium, agitated at 200 rpm, 28 °C from 0 to 96 h. According to the results the concentration of calcium chloride and pH has significantly influenced the bioconversion of xylose to xylitol. The general analysis of the results led to the conclusion that 1 g/L of ammonium sulfate, 0.5 g L calcium chloride, 5 g/L of rice bran and pH 4 represent the most suitable composition of the medium for xylitol production in prehydrolyzed liquor of the cashew apple bagasse. After obtaining the best conditions of cultivation and adsorption was carried out a trial fermentation in time intervals 0, 12, 24, 36 and 48 h in erlenmeyer flasks with a capacity of 250 mL, scale application - 3 times, containing 150 mL of the medium in natura, concentrated and concentrate/treated with initial cell concentration of 107 cells/mL. According to the results the treated/concentrated liquor represents the most suitable way for fermentation, with a higher cell concentration, 56.4 x 106 cells/ mL in 36 h and xylitol production of 3000.14 mg/L, resulting in a productivity of 0.063 g/L h with a bioconversion yield of 74.47% and 81.21% efficiency at the end of 48 hours.

Submitted by Clebson Anjos (clebson.leandro54@gmail.com) on 2016-03-04T21:55:14Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1992438 bytes, checksum: 7619ce6c21cea2362c1d633c136de464 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-04T21:55:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1992438 bytes, checksum: 7619ce6c21cea2362c1d633c136de464 (MD5) Previous issue date: 2015-03-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Due to the amount of waste generated by industries and commitments to the environment, there has been a growing interest in the use of alternative energy sources for the generation of bio-products with added value, such as ethanol and xylitol. In this context, cashew peduncle has been considered a promising alternative to meet this demand in a more sustainable manner. Thus, the aim of this study was to assess the expansion of the experimental scale of biotechnological xylitol production using liquor from the acid treatment of cashew peduncle bagasse as substrate and Candida guilliermondii CCT 3544 yeast as fermentation agent. Cashew peduncle bagasse was washed, dried at 55°C, ground, sieved (48 mesh), characterized and submitted to acid hydrolysis. Then, a 23 + 3 factorial experimental design with central points was performed in order to verify the effect of variables temperature, bagasse / dilute acid ratio and acid concentration on the release of pentose and hexose from hydrolyzed liquors. After hydrolysis, the liquor was submitted to concentration process and the fermentation medium was prepared in 400 ml Erlenmeyer flasks in Bioreactor (1600 ml), stirred at 200 rpm, 28°C from 0 to 120 h using C. guilliermondii CCT 3544 yeast. The characterization of the lignocellulosic composition revealed the presence of 21.45 ± 0.31% cellulose, 10.96 ± 0.31% hemicellulose and 35.39 ± 0.97% lignin, respectively. It was found that the liquor from the acid treatment should operate under temperature conditions at level 1 (160 ° C) and acid concentration, bagasse / dilute acid ratio at level -1 (1%, 1: 6). The overall analysis of results led to the conclusion that C. guilliermondii CCT-3544 was able to grow in medium with hydrolyzate, and its maximum concentration of cell growth was 3.5 g L-1 in both cases. However, the fermented concentrate obtained maximum production at 48 h of fermentation, but the fermented hydrolyzate in bioreactor produced ethanol and xylitol, with maximum xylitol production at 6 h and maximum ethanol production at 48 h of fermentation. / Em virtude da quantidade de resíduos gerados pelas indústrias e dos compromissos assumidos com o meio ambiente, tem-se verificado um crescente interesse pela utilização de fontes alternativas de energia para geração de bioprodutos com valor agregado, como o etanol e xilitol. Neste contexto, o pedúnculo do caju tem sido considerado uma alternativa promissora para atender à demanda de forma mais sustentável. Em vista disso, o objetivo desta pesquisa foi estudar a ampliação de escala experimental da produção biotecnológica de xilitol utilizando o licor do tratamento ácido do bagaço do pedúnculo do caju como substrato e como agente de fermentação a levedura Candida guilliermondii CCT 3544. O bagaço do pedúnculo do caju obtido foi lavado, seco a 55 ºC, moído, peneirado (48 mesh), caracterizado e submetido à hidrólise ácida. Em seguida, realizou-se um planejamento experimental fatorial 23 + 3 pontos centrais com o intuito de verificar as influências das variáveis: temperatura, proporção bagaço/ácido diluído e concentração do ácido na liberação de pentoses e hexose dos licores hidrolisados. Após hidrólise o licor foi submetido ao processo de concentração e o meio de fermentação preparado em frascos de Erlenmeyer com 400 mL do meio com licor concentrado e em Biorreator (1600 mL), agitados a 200 rpm, 28 °C de 0 a 120 h, utilizando-se a levedura C. guilliermondii CCT 3544. A caracterização da composição lignocelulósica revelou a presença de 21,45 ± 0,31% de celulose, hemicelulose 10,96 ± 0,31% e lignina 35,39 ± 0,97%, respectivamente. Verificou-se que o licor do tratamento ácido deve operar sob condições de temperatura ao nível 1 (160 °C), concentração de ácido, proporção bagaço/ácido diluído ao nível -1 (1% e 1:6). O fermentado do hidrolisado concentrado obteve produção máxima com 48 h de fermentação, já o hidrolisado fermentado em biorreator produziu etanol e xilitol simultaneamente com máxima produção de xilitol com 6 h e etanol com 48 h de fermentação.

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.

Neste trabalho foram desenvolvidas estratégias para a determinação de cafeína e detecção de adulterações no café, empregando a eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (CE-C4D). A estratégia desenvolvida para a separação da cafeína se baseia na complexação dinâmica do analito com o ânion do eletrólito de corrida, 3,4-dimetoxicinamato. Utilizou-se como eletrólito de corrida 20 mmol L-1 de ácido 3,4-dimetoxicinâmico/Tris (pH 8,5). As separações foram conduzidas contra o fluxo eletrosmótico e o tempo de análise foi menor do que 5 minutos. Adicionalmente, o método se mostrou seletivo uma vez que análogos da cafeína (teobromina e teofilina) apresentaram tempo de migração diferenciado. O método proposto foi comparado com uma metodologia padrão (HPLC), apresentando resultados concordantes. O método foi aplicado para a determinação de cafeína em amostras de café convencional, solúvel e descafeinado. O limite de quantificação estimado para o método (0,33 mg/g) se mostrou suficientemente baixo, de forma a atender às exigências da legislação vigente. A identificação de adulterações no café provenientes da adição de outros materiais pode ser procedida utilizando como indicadores os teores totais de glicose e xilose obtidas por hidrólise controlada. Para promover a separação dessas espécies dos demais carboidratos presentes no café, varias estratégias foram avaliadas. As separações foram realizadas utilizando NaOH como eletrólito de corrida, de forma a possibilitar a ionização dessas espécies. O emprego de aditivos como metanol, acetonitrila e íons borato foram avaliados. A melhor condição obtida foi utilizando 80 mmol L-1 de NaOH, 0,5 mmol L-1 CTAB e 30% (v/v) de metanol. Os resultados mostraram que é possível identificar contaminações menores que aquelas consideradas como limites aceitáveis. / In this work, methods based on capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection (CE-C4D) for the determination of caffeine in coffee as well as for the identification of its adulteration by addition of some other vegetal products were developed. Caffeine is a neutral species, and the proposed method was based on its mobilization by the formation of a complex with the anion 3,4 dimethoxycinnamate. The experiments were carried out in buffer Tris/3,4 dimethoxycinnamic acid (pH 8.5) and the migration of the complex was done in counter electroosmotic flow. The running time was less than 5 minutes. In addition, theobromine and theophylline (two caffeine analogues) were completely separated. The new method was compared to a standard method based on HPLC, and similar results were obtained. Samples of integral, soluble, and decaffeinated coffees were analyzed and the limit of quantification (0.33 mg/g) was low enough to fulfill the Brazilian norm. The proposed approach for the identification of adulteration was based on the controlled hydrolysis of xylan and starch present in some vegetable adulterants, followed by the analysis of the resulting xylose and glucose, which are the monosaccharides that compose, respectively, the two polysaccharides. Although the monosaccharides are neutral species in ordinary conditions, they form anionic species in high values of pH. The best separations were obtained in NaOH 80 mmol L-1, CTAB 0.5 mmol L-1, and methanol 30% (v/v). The results showed that it is possible to identify levels of contamination below tolerable limits.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar como algumas condições de pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com H2SO4 diluído influenciam a distribuição granulométrica do bagaço de cana, a composição química dos sólidos pré-tratados e hidrolisados hemicelulósicos, além da digestibilidade enzimática dos sólidos pré-tratados. Para isso, previamente, uma amostra de bagaço de cana-de-açúcar in natura foi caracterizada quanto suas composições percentuais; a distribuição granulométrica de suas fibras também foi avaliada antes e após o pré-tratamento. O pré-tratamento do bagaço com H2SO4 diluído foi realizado em reator piloto, aquecido por vapor direto, com capacidade de 100 L, onde o teor inicial de sólidos foi fixado em 15% (p/p). A temperatura (131,91-168,09 °C), tempo de residência (11,90-48,09 min) e concentração ácida (0,19 - 3,81 p/p) variaram de acordo com um planejamento fatorial 23. Após o pré-tratamento, os bagaços pré-tratados e hidrolisados hemicelulósicos foram caracterizados quanto suas composições químicas. A composição química dos bagaços in natura e pré-tratados, assim como a composição química dos hidrolisados, foi determinada por gravimetria, espectrofotometria e cromatografia líquida de alta eficiência. De acordo com a condição de pré-tratamento, os teores de celulose, hemicelulose e lignina nos bagaços pré-tratados diferiram substancialmente sendo que a maior variação foi observada para hemicelulose (0,14-17,62 %). Os três fatores avaliados no pré-tratamento influenciaram a composição química do bagaço pré-tratado, sendo que a variável com maior poder de influência no teor de celulose, hemicelulose e lignina dos sólidos foi a concentração ácida, seguida da temperatura e tempo de reação. Xilose foi o açúcar predominante nos hidrolisados hemicelulósicos variando de 1,43 a 21,05 g/L, de acordo com o planejamento. A concentração de furfural variou entre 0,08 e 4,68 g/L. Condições severas de pré-tratamento acarretaram na maior remoção de hemicelulose dos bagaços pré-tratados, porém nestas mesmas condições foram encontradas baixas concentrações de xilose e altas concentrações de furfural nos hidrolisados. A concentração de xilose no hidrolisado se mostrou dependente da temperatura e da concentração ácida. A variável com maior influência na formação de furfural foi a temperatura, seguida pela concentração ácida e tempo. A digestibilidade enzimática dos bagaços obtidos de acordo com planejamento experimental em 24 h variou de 25,35 a 63,76%, conforme a composição química dos sólidos. A temperatura de pré-tratamento foi o fator que exerceu maior influência na conversão da celulose dos sólidos. Com o intuito de avaliar o efeito da lavagem dos sólidos na digestibilidade enzimática da celulose, bagaços pré-tratados obtidos nas condições mais branda e severa de pré-tratamento, lavados e não-lavados, foram submetidos à sacarificação enzimática. A sacarificação de bagaços não-lavados foi prejudicada pela presença de inibidores nos hidrolisados hemicelulósicos, variando entre 0- 23,9%, em 72h. As condições de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar que maximizam a concentração de xilose no hidrolisado hemicelulósico e a sacarificação enzimática do bagaço pré-tratado são diferentes. O pré-tratamento com H2SO4 diluído acarretou na diminuição do tamanho das partículas do bagaço de cana. / This study aimed to evaluate how certain pretreatment conditions of sugarcane bagasse with dilute H2SO4 influence the size distribution of sugarcane bagasse, the chemical composition of solids pretreated and hemicellulosic hydrolysate, as well the enzymatic digestibility of pretreated solids. For that, previously, a sample of in natura sugarcane bagasse was characterized in terms of chemical composition; the size distribution of fibers was also evaluated before and after the pretreatment. The experiments of pretreatment of bagasse with dilute H2SO4 were conducted in a pilot reactor, heated by direct steam, with a capacity of 100 L, where the initial solids content was fixed at 15% (w / w). The temperature (131.91 to 168.09 ° C), residence time (11.90 to 48.09 min) and acid concentration (0.19 to 3.81 w / w) varied according to a factorial design 2³ . After pretreatment, the pretreated bagasse and hemicellulosic hydrolysates were characterized in terms of their chemical compositions. The chemical composition of in natura and pretreated bagasse , as well the chemical composition of the hydrolysates, was determined by gravimetry, spectrophotometry and high-efficiency liquid chromatography. According to the condition of pretreatment, cellulose, hemicellulose and lignin content in pretreated bagasse differed substantially, and the major variation was observed for hemicellulose content (0.14 to 17.62%).The three factors evaluated in the pretreatment influenced the chemical composition of pretreated bagasse, and the variable with greatest influence on the content of cellulose, hemicellulose and lignin concentration of solids was acid concentration, followed by temperature and reaction time.. Xylose was the predominant sugar in hemicellulose hydrolysates ranging from 1.43 to 21.05 g / L, according to the experimental design. Furfural concentration varied between 0.08 and 4.68 g / L. Severe conditions of pretreatment resulted in greater removal of hemicellulose from pretreated bagasse, but under these conditions were found low concentrations of xylose and high concentrations of furfural in the hydrolysates. The concentration of xylose in the hemicellulosic hydrolyzate were dependet of temperature and acid concentration. The variable with greatest influence on the formation of furfural was temperature, followed by acid concentration and time. The enzymatic digestibility of the pretreated solids, obtained according to experimental design, in 24 h, ranged from 25.35 to 63.76% depending on the chemical composition of solids. The temperature of the pretreatment was the factor that showed greater influence on the conversion of cellulose solids. In order to evaluate the effect of washing the solids in the enzymatic digestibility of cellulose, pretreated bagasses obtained in milder and severe conditions of pretreatment, non-washed and washed solids, were submitted to enzymatic saccharification. Saccharification of non-washed solids was impaired by the presence of inhibitors in hemicellulosic hydrolysates, ranging from 0 to 23.9% in 72h. The pretreatment conditions of sugarcane bagasse that maximize the concentration of xylose in the hemicellulosic hydrolyzate and enzymatic saccharification of pretreated bagasse are different. Pretreatment with dilute H2SO4 resulted in the decrease of particle size of bagasse.

A importância atribuída aos biocombustíveis aumentou de forma drástica nos últimos anos, pois além de reduzir a dependência de petróleo e os gastos com energia fóssil, o uso de fontes de energia renováveis resulta também em uma diminuição significativa das emissões de gases tóxicos para a atmosfera. A biomassa de origem vegetal é uma das mais baratas e abundantes matérias-primas renováveis para o desenvolvimento sustentável e é uma fonte promissora para a produção de biocombustíveis. O bioetanol produzido a partir das frações lignocelulósicas, conhecido como etanol de segunda geração, tem um potencial de mercado promissor como biocombustível. No entanto, a tecnologia do processo ainda está em escala de demonstração. Há grande necessidade de melhorias no processo de produção a fim de reduzir o custo de produção. Caso houvesse a utilização total dos açúcares presentes na biomassa vegetal, existiria uma maior rentabilidade e competitividade, tornando esse processo mais viável. Os polissacarídeos constituintes do material lignocelulósico, como hemicelulose e celulose, por uma reação de hidrólise podem ser transformados em açúcares simples, tais como xilose e glicose, que podem ser utilizados como substrato em processos fermentativos. Algumas linhagens de leveduras não pertencentes ao gênero Saccharomyces possuem a capacidade de bioconversão das pentoses (xilose e arabinose), constituintes da fração hemicelulósica, em etanol. Neste contexto, o presente estudo objetivou isolar leveduras de madeira em fase de decomposição para avaliação das mesmas quanto à capacidade de bioconversão da xilose, principal constituinte da fração hemicelulósica, em etanol. Foram obtidas 83 colônias de leveduras do isolamento, sendo que todas foram inoculadas em meio de xilose como fonte de carbono. Somente onze isolados não apresentaram capacidade de produção de etanol a partir de xilose, os isolados que exibiram essa capacidade apresentaram uma variação de 0,60 até 6,58 g L-1 de etanol. Além dos isolados, quinze linhagens pertencentes a espécies de leveduras já conhecidas como fermentadoras de xilose foram avaliadas quanto à produção de etanol. As linhagens pertencentes às espécies Spathaspora passalidarum (HMD1.3) e Candida shehatae (HM52.2) foram as maiores produtoras de etanol e não apresentaram diferenças significativas entre elas. Dentre todos os isolados obtidos, os isolados I38 e I54 não diferiram entre si, e foram os maiores produtores de etanol. O isolado I38 apresentou resultados significativamente maiores do que as linhagens padrão Spathaspora arborariae HM19.1A e Sheffersomyces stipitis NRRLY7124, enquanto o isolado I54 não diferiu da linhagem padrão HM19.1A, mas foi superior à linhagem NRRLY7124. / The importance given to biofuels drastically increased in the last years, because besides reducing oil dependence and spending on fossil energy, the use of renewable energy sources also results in a significant reduction of toxic gas emissions to the atmosphere. Plant biomass is one of the cheapest and most abundant renewable feedstock for sustainable development and is a promising source for biofuel production. Bioethanol produced from lignocellulosic fractions, known as second generation ethanol, have a promising market potential as a biofuel. However, the process technology is still in demonstration scale. There is a great need for improvements in the production process in order to reduce the production cost. If there was a total utilization of sugars in plant biomass, there would be greater profitability and competitiveness, making this process more feasible. The polysaccharides components of lignocellulosic material, such as cellulose and hemicellulose, by hydrolysis reaction can be transformed into simple sugars such as xylose and glucose, which can be used as substrate for fermentation. Some yeast strains not belonging to the genus Saccharomyces have the ability of bioconversion of pentoses (xylose and arabinose), components of the hemicellulose fraction, to ethanol. In this context, the aim of the present study was the isolation of yeasts from decaying wood, to assess their ability in bioconversion of xylose, the main constituent of the hemicellulosic fraction, to ethanol. Eighty-three colonies were obtained from the yeasts isolation, which all were inoculated in media containing xylose as carbon source. Only eleven strains did not showed the ability of ethanol production from xylose, the strains that exhibited this ability varied between 0.60 to 6.58 g L-1 of ethanol. In addition to the isolated strains, fifteen strains belonging to yeast species already known as xylose fermenters were assessed for ethanol production. The strains belonging to the species Spathaspora passalidarum (HMD1.3) and Candida shehatae (HM52.2) were the largest producers of ethanol and showed no significant differences between them. Among all obtained strains from isolation, I38 and I54 did not differed from each other, and were the largest producers of ethanol. The I38 strain showed results significantly higher than the standard strains Spathaspora arborariae HM19.1A and Sheffersomyces stipitis NRRLY7124, while the I54 strain did not differed from the standard strain HM19.1A, but was higher than the strain NRRLY7124.