A N-glicosilação é um processo pós-traducional que se caracteriza pela adição de um oligossacarídeo a cadeia lateral de um resíduo de asparagina, contida na assinatura D/E-X-N-X-S/T em bactérias. Na última década, a partir do organismo modelo Campylobacter jejuni identificaram-se diversas enzimas participantes da rota da N-glicosilação. Dentre estas, a proteína responsável pela transferência em bloco da cadeia oligossacarídica para a proteína aceptora é a oligossacariltransferase PglB, cuja estrutura foi obtida por cristalografia em 2011. A partir destes avanços, o presente trabalho visa contribuir no entendimento do processo de N-glicosilação ao acrescentar à PglB cristalografada a presença de explícita de solvente, flexiblidade e substratos. Ainda, busca caracterizar filogeneticamente a proteína compreendendo os três domínios da vida, descrevendo a sua história evolutiva. Os resultados obtidos indicam que a PglB pode possuir diferentes conformações para o sítio catalítico, algo não observado na estrutura cristalográfica, alternando entre esses estados durante o tempo. Além disso, a proteína demonstrou realizar movimentos que sugerem a existência de uma espécie de alosteria no sítio catalítico, onde a proteína aceptora glicosilada tem sua saída facilitada a partir de alterações conformacionais comunicadas entre as cavidades da enzima. O motivo conservado WWDYGY manteve-se fortemente interagindo com o substrato, enquanto o motivo MIV pouco interagiu com a treonina da posição +2. Dessa maneira, os dados desse trabalho auxiliam no entendimento da glicobiologia estrutural da PglB e trazem novas informações relativas a catálise. Adicionalmente, dados preliminares sobre a ancestralidade dessa enzima formam a primeira amostragem de uma árvore compondo os três domínios, assim como uma segunda árvore descreve a transição do motivo MIV no domínio Bacteria. / N-glycosylation is a post-translational feature which is characterized by the addition of an oligosaccharide to the side-chain of an asparagine residue presented in the motif D/E-X-N-X-S/T in Bacteria. In the last decade, studies in the C. jejuni species identified many enzymes participating in the N-glycosylation pathway. Among these, the protein responsible for the en bloc transference of the oligosaccharide chain to the protein acceptor is the oligosaccharyltransferase PglB, whose structure was obtained in 2011 by x-ray crystallography. Departing from these findings, the present work aims to contribute for the comprehension of the N-glycosylation process by adding explicit solvent, flexibility and substrates to the PglB crystallographic structure. Still, we attempt to infer the phylogeny of the protein comprising the three domains of life, describing the evolutionary history of the enzyme. The obtained results indicate that PglB may possess different conformations for the catalytic site, a characteristic not observed in the crystal structure, alternating between states. Besides, the protein demonstrated movements that suggest the existence of an allosteric mechanism in the catalytic site, where the exit of the glycosylated protein is facilitated by conformational transitions communicated between cavities. The conserved motif WWDYGY performed strong interactions with the proteic substrate, while the MIV motif did not. Thus, these data may contribute to understand the structural glycobiology of PglB and bring new insights regarding the catalysis mechanism. Additionally, preliminary data involving the ancestrality of this enzyme demonstrated the first phylogenetic tree comprising the three domains, as well as a second tree which describes the transition of the MIV motif in the Bacteria domain.

A N-glicosilação é um processo pós-traducional que se caracteriza pela adição de um oligossacarídeo a cadeia lateral de um resíduo de asparagina, contida na assinatura D/E-X-N-X-S/T em bactérias. Na última década, a partir do organismo modelo Campylobacter jejuni identificaram-se diversas enzimas participantes da rota da N-glicosilação. Dentre estas, a proteína responsável pela transferência em bloco da cadeia oligossacarídica para a proteína aceptora é a oligossacariltransferase PglB, cuja estrutura foi obtida por cristalografia em 2011. A partir destes avanços, o presente trabalho visa contribuir no entendimento do processo de N-glicosilação ao acrescentar à PglB cristalografada a presença de explícita de solvente, flexiblidade e substratos. Ainda, busca caracterizar filogeneticamente a proteína compreendendo os três domínios da vida, descrevendo a sua história evolutiva. Os resultados obtidos indicam que a PglB pode possuir diferentes conformações para o sítio catalítico, algo não observado na estrutura cristalográfica, alternando entre esses estados durante o tempo. Além disso, a proteína demonstrou realizar movimentos que sugerem a existência de uma espécie de alosteria no sítio catalítico, onde a proteína aceptora glicosilada tem sua saída facilitada a partir de alterações conformacionais comunicadas entre as cavidades da enzima. O motivo conservado WWDYGY manteve-se fortemente interagindo com o substrato, enquanto o motivo MIV pouco interagiu com a treonina da posição +2. Dessa maneira, os dados desse trabalho auxiliam no entendimento da glicobiologia estrutural da PglB e trazem novas informações relativas a catálise. Adicionalmente, dados preliminares sobre a ancestralidade dessa enzima formam a primeira amostragem de uma árvore compondo os três domínios, assim como uma segunda árvore descreve a transição do motivo MIV no domínio Bacteria. / N-glycosylation is a post-translational feature which is characterized by the addition of an oligosaccharide to the side-chain of an asparagine residue presented in the motif D/E-X-N-X-S/T in Bacteria. In the last decade, studies in the C. jejuni species identified many enzymes participating in the N-glycosylation pathway. Among these, the protein responsible for the en bloc transference of the oligosaccharide chain to the protein acceptor is the oligosaccharyltransferase PglB, whose structure was obtained in 2011 by x-ray crystallography. Departing from these findings, the present work aims to contribute for the comprehension of the N-glycosylation process by adding explicit solvent, flexibility and substrates to the PglB crystallographic structure. Still, we attempt to infer the phylogeny of the protein comprising the three domains of life, describing the evolutionary history of the enzyme. The obtained results indicate that PglB may possess different conformations for the catalytic site, a characteristic not observed in the crystal structure, alternating between states. Besides, the protein demonstrated movements that suggest the existence of an allosteric mechanism in the catalytic site, where the exit of the glycosylated protein is facilitated by conformational transitions communicated between cavities. The conserved motif WWDYGY performed strong interactions with the proteic substrate, while the MIV motif did not. Thus, these data may contribute to understand the structural glycobiology of PglB and bring new insights regarding the catalysis mechanism. Additionally, preliminary data involving the ancestrality of this enzyme demonstrated the first phylogenetic tree comprising the three domains, as well as a second tree which describes the transition of the MIV motif in the Bacteria domain.

A N-glicosilação é um processo pós-traducional que se caracteriza pela adição de um oligossacarídeo a cadeia lateral de um resíduo de asparagina, contida na assinatura D/E-X-N-X-S/T em bactérias. Na última década, a partir do organismo modelo Campylobacter jejuni identificaram-se diversas enzimas participantes da rota da N-glicosilação. Dentre estas, a proteína responsável pela transferência em bloco da cadeia oligossacarídica para a proteína aceptora é a oligossacariltransferase PglB, cuja estrutura foi obtida por cristalografia em 2011. A partir destes avanços, o presente trabalho visa contribuir no entendimento do processo de N-glicosilação ao acrescentar à PglB cristalografada a presença de explícita de solvente, flexiblidade e substratos. Ainda, busca caracterizar filogeneticamente a proteína compreendendo os três domínios da vida, descrevendo a sua história evolutiva. Os resultados obtidos indicam que a PglB pode possuir diferentes conformações para o sítio catalítico, algo não observado na estrutura cristalográfica, alternando entre esses estados durante o tempo. Além disso, a proteína demonstrou realizar movimentos que sugerem a existência de uma espécie de alosteria no sítio catalítico, onde a proteína aceptora glicosilada tem sua saída facilitada a partir de alterações conformacionais comunicadas entre as cavidades da enzima. O motivo conservado WWDYGY manteve-se fortemente interagindo com o substrato, enquanto o motivo MIV pouco interagiu com a treonina da posição +2. Dessa maneira, os dados desse trabalho auxiliam no entendimento da glicobiologia estrutural da PglB e trazem novas informações relativas a catálise. Adicionalmente, dados preliminares sobre a ancestralidade dessa enzima formam a primeira amostragem de uma árvore compondo os três domínios, assim como uma segunda árvore descreve a transição do motivo MIV no domínio Bacteria. / N-glycosylation is a post-translational feature which is characterized by the addition of an oligosaccharide to the side-chain of an asparagine residue presented in the motif D/E-X-N-X-S/T in Bacteria. In the last decade, studies in the C. jejuni species identified many enzymes participating in the N-glycosylation pathway. Among these, the protein responsible for the en bloc transference of the oligosaccharide chain to the protein acceptor is the oligosaccharyltransferase PglB, whose structure was obtained in 2011 by x-ray crystallography. Departing from these findings, the present work aims to contribute for the comprehension of the N-glycosylation process by adding explicit solvent, flexibility and substrates to the PglB crystallographic structure. Still, we attempt to infer the phylogeny of the protein comprising the three domains of life, describing the evolutionary history of the enzyme. The obtained results indicate that PglB may possess different conformations for the catalytic site, a characteristic not observed in the crystal structure, alternating between states. Besides, the protein demonstrated movements that suggest the existence of an allosteric mechanism in the catalytic site, where the exit of the glycosylated protein is facilitated by conformational transitions communicated between cavities. The conserved motif WWDYGY performed strong interactions with the proteic substrate, while the MIV motif did not. Thus, these data may contribute to understand the structural glycobiology of PglB and bring new insights regarding the catalysis mechanism. Additionally, preliminary data involving the ancestrality of this enzyme demonstrated the first phylogenetic tree comprising the three domains, as well as a second tree which describes the transition of the MIV motif in the Bacteria domain.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

Uma vez que não está determinado o perfil de AGEs e RAGE em modelo animal de isquemia cardíaca, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a formação de AGEs e a produção de RAGE ao longo do processo de remodelamento cardíaco em ratos submetidos ao IAM. Para o estudo, ratos Wistar machos foram randomizados para receber cirurgia sham ou de indução do IAM. Os animais foram avaliados por ecocardiografia e realizadas coletas de sangue nos tempos: pré-cirurgia, 2, 30 e 120 dias pós-cirurgia. Ao final do seguimento, o coração foi coletado para avaliação de AGEs e RAGE. Não foram identificadas diferenças plasmáticas em AGEs fluorescentes, CML, CEL, aminas livres e níveis de proteínas carboniladas entre os grupos. Porém, foi identificada diminuição dos níveis de AGEs amarronzados no plasma e no miocárdio após 120 dias do infarto. Ainda, foi encontrada uma diminuição de CML e CEL no miocárdio ao final do seguimento. Entretanto, não foi identificada diferença nos níveis de RAGE. Assim, apesar de o IAM apresentar um componente inflamatório e oxidativo, os AGEs analisados não apresentaram o aumento esperado. Sugerimos que o modelo de IAM em ratos Wistar deve ser empregado com cautela em estudos que avaliem o eixo AGE-RAGE.

Orientador: Carlos Rossa Junior / Banca: Guiseppe Alexandre Romito / Banca: Daniela Leal Zandim-Barcelos / Resumo: moleculares (PRR) reconhecido principalmente por seu envolvimento na patogênese de complicações secundárias do Diabetes Mellitus. Sua ativação está relacionada à modulação da resposta imune-inflamatória, promovendo ativação, migração e maturação de leucócitos; e induzindo a liberação de citocinas inflamatórias. A sinalização via RAGE também está relacionada à regulação dos processos de sobrevivência, apoptose e autofagia celular. Pouco se sabe sobre o papel de RAGE na regulação desses processos em células da resposta imune adaptativa e, especificamente, em linfócitos T. Nosso objetivo foi avaliar a influência da ativação de RAGE na biologia de células T. Para isso, observamos seus efeitos na modulação da proliferação, apoptose e autofagia, e a contribuição da ativação de NF-κB na indução desses processos. Células de linhagem de linfócitos T (JM/Jurkat) foram estimuladas com os ligantes de RAGE BSA-AGE (100 e 200 μg/mL) e S100b (10 μg/mL). A estimulação também foi realizada mediante a pré-ativação do receptor de células T (TCR). Experimentos de ganho de função foram realizados por meio da transfecção transitória das células com um vetor plasmidial de RAGE. A proliferação celular foi determinada por ensaio de exclusão com azul de Trypan. A apoptose foi avaliada através da detecção da fragmentação do DNA pelo método TUNEL e da expressão de p53, Bax e Bcl-2 por Western blot. Ainda por Western blot, observamos a expressão de proteínas características do processo de autofagia, p62 e LC3; e de p50, subunidade do fator de transcrição NF-κB. O estímulo com BSA-AGE e S100b não alterou a proliferação e a viabilidade, mas, em células transfectadas, esse estímulo tendeu a aumentar a proliferação e a viabilidade, sobretudo após a pré-ativação das células. O BSA-AGE e o S100b produziram efeitos distintos sobre a apoptose a depender da pré-ativação e do período... / Abstract: RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts) is a pattern recognition receptor (PRR) that is especially recognized for its involvement in the pathogenesis of secondary complications of Diabetes Mellitus. Its activation is related to the modulation of immune-inflammatory responses, by promoting activation, maturation and migration of leukocytes, as well as the induction of inflammatory cytokines. RAGE signaling is also related to the regulation of cellular processes like survival, apoptosis and autophagy. Little is known about the role of RAGE in the regulation of these processes in cells of the adaptive immune response, specifically in T lymphocytes. Our main purpose was to evaluate the influence of RAGE activation in T cell biology. We observed the role of this receptor in the modulation of proliferation, apoptosis and autophagy, and the contribution of NF-kB in the induction of these processes. A human cell line of T lymphocytes (JM/ Jurkat) were stimulated with the RAGE ligands: BSA-AGE (100 and 200 μg/mL) and S100B (10 μg/mL). The stimulation was also performed after pre-activation of the T cell receptor (TCR). Gain of function experiments were performed by transient transfection of cells with a plasmid vector to increase RAGE expression. Cell proliferation was determined by Trypan blue dye exclusion assay. Apoptosis was assessed by the detection of DNA fragmentation by the TUNEL method, and p53, Bax and Bcl-2 expression by Western blotting. Also by Western blotting, we observed the effect of RAGE on the expression of autophagy-related proteins, p62 and LC3, and on the expression of p50, subunit of the transcription factor, NF-κB. The stimulation with BSA- AGE and S100b did not alter the proliferation and viability, but, in transfected cells, this stimulation tended to increase proliferation and viability, especially after the cell pre-activation. BSA-AGE and S100b had distinct effects on apoptosis depending on the... / Mestre

A glicosilação é a modificação de proteínas mais abundante que existe, ocorrendo em todos os reinos da vida e com diversos tipos de ligação proteínacarboidrato já descritos. A ligação de um carboidrato em uma sequência de aminoácidos pode afetar estrutura e função desses, sendo importante para estabilidade e rigidez de proteínas, localização intracelular, sinalização e comunicação celular, adesão, resposta imune e invasão de parasitas, dentre outros. Apesar do amplo papel biológico dessas moléculas, ainda há poucos estudos acerca de sua glicobiologia estrutural, em parte em decorrência de características, como sua alta flexibilidade, que dificultam seu estudo por métodos como cristalografia de raio X e ressonância magnética nuclear. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar a estrutura e dinâmica: 1) do glicopeptídeo NETNES de Trypanosoma cruzi, completamente glicosilado e inserido em membrana; e 2) dos gangliosídeos GM1, GD1b e GT1b, em ambos os casos considerando soluções semelhantes às fisiológicas. A metodologia empregada envolveu a simulação de dissacarídeos, construção de mapas de energia por metadinâmica, montagem das glicanas e simulações por dinâmica molecular. Os parâmetros para as porções sacarídicas foram desenvolvidos pelo nosso grupo, enquanto que os da membrana foram retirados do trabalho de Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. No caso do NETNES, foram simulados quatro sistemas: membrana de fosfatidilcolina, membrana com glicosil fosfatidil inositol, membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com uma N-glicosilação e membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com duas N-glicosilações. Os resultados obtidos mostram que as propriedades da membrana e o modelo da âncora estão de acordo com os dados experimentais, e que a porção peptídica é bem flexível, principalmente o N-terminal, o qual se dobra na região próxima às asparaginas da Nglicosilação. Além disso o peptídeo se curva sobre a superfície da membrana, expondo ele próprio e algumas glicanas ao meio extracelular. Quanto aos gangliosídeos, cada um foi submetido a diversas simulações de dinâmica molecular, utilizando dois campos de força diferentes, e algumas com restrições de distâncias de acordo com dados experimentais de Nuclear Overhauser Effect. Foram realizadas análises dos diedros das ligações glicosídicas e das distâncias entre hidrogênios, sendo que essa última foi comparada com dados de ressonância magnética nuclear e cristalografia, indicando a capacidade dos campos de força GLYCAM, quando associado a restrições de distância, e do GROMOS96 em reproduzir os dados experimentais conformacionais dos gangliosídeos. / Glycosylation is the most abundant protein modification, occurring across all kingdoms of life and having several protein-carbohydrate linkages already described. The appendage of a carbohydrate to an amino acid sequence can affect its structure and function, being important for protein stability and rigidity, intracellular localization, cellular signalization and communication, adhesion, immune response, parasites invasion, among others. Despite the plentiful roles of those molecules, there are still a few works of structural glycobiology, due to some sugar features, as high flexibility, that hinder their characterization by experimental methods, such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. In this context, the present work aims to characterize and validate structure and conformation of: 1) NETNES glycopeptide from Trypanosoma cruzi attached to all glycans and membrane; 2) gangliosides GM1, GD1b and GT1b, in both cases considering solutions similar to the physiologic one. The employed methodology involves disaccharide simulations, construction of energy maps obtained from metadynamics, glycans building blocks and molecular dynamics simulations. The parameters for saccharidic portions were developed in our research group, and the ones for membrane were obtained from Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. In NETNES case, four systems were simulated: POPC membrane, membrane with glycosylphosphatidylinositol, membrane with glycosylphosphatidylinositol and one N-glycosylation NETNES, and membrane with glycosylphosphatidylinositol and NETNES with two N-glycosylations. The obtained results indicate that membrane proprieties and anchor model are in good agreement with experimental data, and that the protein portion is very flexible, mainly on the N-terminal, which bends on the region near the N-glycosylated asparagines. Moreover, the peptide curves over membrane surface, exposing itself and some glycans to extracellular medium. Regarding the gangliosides, each one was submitted to several molecular dynamics simulations, using two different force fields, and some of them with distance restraints according to experimental Nuclear Overhauser Effect signals. Dihedrals distribution and hydrogens distances were analyzed, and the latter was compared to nuclear magnetic resonance and crystallography data, indicating the capability of GLYCAM, when associated with distance restraints, and of GROMOS96 force fields to reproduce experimental data of gangliosides conformation.

Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.