Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

A glicosilação é a modificação de proteínas mais abundante que existe, ocorrendo em todos os reinos da vida e com diversos tipos de ligação proteínacarboidrato já descritos. A ligação de um carboidrato em uma sequência de aminoácidos pode afetar estrutura e função desses, sendo importante para estabilidade e rigidez de proteínas, localização intracelular, sinalização e comunicação celular, adesão, resposta imune e invasão de parasitas, dentre outros. Apesar do amplo papel biológico dessas moléculas, ainda há poucos estudos acerca de sua glicobiologia estrutural, em parte em decorrência de características, como sua alta flexibilidade, que dificultam seu estudo por métodos como cristalografia de raio X e ressonância magnética nuclear. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar a estrutura e dinâmica: 1) do glicopeptídeo NETNES de Trypanosoma cruzi, completamente glicosilado e inserido em membrana; e 2) dos gangliosídeos GM1, GD1b e GT1b, em ambos os casos considerando soluções semelhantes às fisiológicas. A metodologia empregada envolveu a simulação de dissacarídeos, construção de mapas de energia por metadinâmica, montagem das glicanas e simulações por dinâmica molecular. Os parâmetros para as porções sacarídicas foram desenvolvidos pelo nosso grupo, enquanto que os da membrana foram retirados do trabalho de Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. No caso do NETNES, foram simulados quatro sistemas: membrana de fosfatidilcolina, membrana com glicosil fosfatidil inositol, membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com uma N-glicosilação e membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com duas N-glicosilações. Os resultados obtidos mostram que as propriedades da membrana e o modelo da âncora estão de acordo com os dados experimentais, e que a porção peptídica é bem flexível, principalmente o N-terminal, o qual se dobra na região próxima às asparaginas da Nglicosilação. Além disso o peptídeo se curva sobre a superfície da membrana, expondo ele próprio e algumas glicanas ao meio extracelular. Quanto aos gangliosídeos, cada um foi submetido a diversas simulações de dinâmica molecular, utilizando dois campos de força diferentes, e algumas com restrições de distâncias de acordo com dados experimentais de Nuclear Overhauser Effect. Foram realizadas análises dos diedros das ligações glicosídicas e das distâncias entre hidrogênios, sendo que essa última foi comparada com dados de ressonância magnética nuclear e cristalografia, indicando a capacidade dos campos de força GLYCAM, quando associado a restrições de distância, e do GROMOS96 em reproduzir os dados experimentais conformacionais dos gangliosídeos. / Glycosylation is the most abundant protein modification, occurring across all kingdoms of life and having several protein-carbohydrate linkages already described. The appendage of a carbohydrate to an amino acid sequence can affect its structure and function, being important for protein stability and rigidity, intracellular localization, cellular signalization and communication, adhesion, immune response, parasites invasion, among others. Despite the plentiful roles of those molecules, there are still a few works of structural glycobiology, due to some sugar features, as high flexibility, that hinder their characterization by experimental methods, such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. In this context, the present work aims to characterize and validate structure and conformation of: 1) NETNES glycopeptide from Trypanosoma cruzi attached to all glycans and membrane; 2) gangliosides GM1, GD1b and GT1b, in both cases considering solutions similar to the physiologic one. The employed methodology involves disaccharide simulations, construction of energy maps obtained from metadynamics, glycans building blocks and molecular dynamics simulations. The parameters for saccharidic portions were developed in our research group, and the ones for membrane were obtained from Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. In NETNES case, four systems were simulated: POPC membrane, membrane with glycosylphosphatidylinositol, membrane with glycosylphosphatidylinositol and one N-glycosylation NETNES, and membrane with glycosylphosphatidylinositol and NETNES with two N-glycosylations. The obtained results indicate that membrane proprieties and anchor model are in good agreement with experimental data, and that the protein portion is very flexible, mainly on the N-terminal, which bends on the region near the N-glycosylated asparagines. Moreover, the peptide curves over membrane surface, exposing itself and some glycans to extracellular medium. Regarding the gangliosides, each one was submitted to several molecular dynamics simulations, using two different force fields, and some of them with distance restraints according to experimental Nuclear Overhauser Effect signals. Dihedrals distribution and hydrogens distances were analyzed, and the latter was compared to nuclear magnetic resonance and crystallography data, indicating the capability of GLYCAM, when associated with distance restraints, and of GROMOS96 force fields to reproduce experimental data of gangliosides conformation.

Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.

A glicosilação é a modificação de proteínas mais abundante que existe, ocorrendo em todos os reinos da vida e com diversos tipos de ligação proteínacarboidrato já descritos. A ligação de um carboidrato em uma sequência de aminoácidos pode afetar estrutura e função desses, sendo importante para estabilidade e rigidez de proteínas, localização intracelular, sinalização e comunicação celular, adesão, resposta imune e invasão de parasitas, dentre outros. Apesar do amplo papel biológico dessas moléculas, ainda há poucos estudos acerca de sua glicobiologia estrutural, em parte em decorrência de características, como sua alta flexibilidade, que dificultam seu estudo por métodos como cristalografia de raio X e ressonância magnética nuclear. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar a estrutura e dinâmica: 1) do glicopeptídeo NETNES de Trypanosoma cruzi, completamente glicosilado e inserido em membrana; e 2) dos gangliosídeos GM1, GD1b e GT1b, em ambos os casos considerando soluções semelhantes às fisiológicas. A metodologia empregada envolveu a simulação de dissacarídeos, construção de mapas de energia por metadinâmica, montagem das glicanas e simulações por dinâmica molecular. Os parâmetros para as porções sacarídicas foram desenvolvidos pelo nosso grupo, enquanto que os da membrana foram retirados do trabalho de Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. No caso do NETNES, foram simulados quatro sistemas: membrana de fosfatidilcolina, membrana com glicosil fosfatidil inositol, membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com uma N-glicosilação e membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com duas N-glicosilações. Os resultados obtidos mostram que as propriedades da membrana e o modelo da âncora estão de acordo com os dados experimentais, e que a porção peptídica é bem flexível, principalmente o N-terminal, o qual se dobra na região próxima às asparaginas da Nglicosilação. Além disso o peptídeo se curva sobre a superfície da membrana, expondo ele próprio e algumas glicanas ao meio extracelular. Quanto aos gangliosídeos, cada um foi submetido a diversas simulações de dinâmica molecular, utilizando dois campos de força diferentes, e algumas com restrições de distâncias de acordo com dados experimentais de Nuclear Overhauser Effect. Foram realizadas análises dos diedros das ligações glicosídicas e das distâncias entre hidrogênios, sendo que essa última foi comparada com dados de ressonância magnética nuclear e cristalografia, indicando a capacidade dos campos de força GLYCAM, quando associado a restrições de distância, e do GROMOS96 em reproduzir os dados experimentais conformacionais dos gangliosídeos. / Glycosylation is the most abundant protein modification, occurring across all kingdoms of life and having several protein-carbohydrate linkages already described. The appendage of a carbohydrate to an amino acid sequence can affect its structure and function, being important for protein stability and rigidity, intracellular localization, cellular signalization and communication, adhesion, immune response, parasites invasion, among others. Despite the plentiful roles of those molecules, there are still a few works of structural glycobiology, due to some sugar features, as high flexibility, that hinder their characterization by experimental methods, such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. In this context, the present work aims to characterize and validate structure and conformation of: 1) NETNES glycopeptide from Trypanosoma cruzi attached to all glycans and membrane; 2) gangliosides GM1, GD1b and GT1b, in both cases considering solutions similar to the physiologic one. The employed methodology involves disaccharide simulations, construction of energy maps obtained from metadynamics, glycans building blocks and molecular dynamics simulations. The parameters for saccharidic portions were developed in our research group, and the ones for membrane were obtained from Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. In NETNES case, four systems were simulated: POPC membrane, membrane with glycosylphosphatidylinositol, membrane with glycosylphosphatidylinositol and one N-glycosylation NETNES, and membrane with glycosylphosphatidylinositol and NETNES with two N-glycosylations. The obtained results indicate that membrane proprieties and anchor model are in good agreement with experimental data, and that the protein portion is very flexible, mainly on the N-terminal, which bends on the region near the N-glycosylated asparagines. Moreover, the peptide curves over membrane surface, exposing itself and some glycans to extracellular medium. Regarding the gangliosides, each one was submitted to several molecular dynamics simulations, using two different force fields, and some of them with distance restraints according to experimental Nuclear Overhauser Effect signals. Dihedrals distribution and hydrogens distances were analyzed, and the latter was compared to nuclear magnetic resonance and crystallography data, indicating the capability of GLYCAM, when associated with distance restraints, and of GROMOS96 force fields to reproduce experimental data of gangliosides conformation.

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina. / The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.

Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.

A glicosilação é a modificação de proteínas mais abundante que existe, ocorrendo em todos os reinos da vida e com diversos tipos de ligação proteínacarboidrato já descritos. A ligação de um carboidrato em uma sequência de aminoácidos pode afetar estrutura e função desses, sendo importante para estabilidade e rigidez de proteínas, localização intracelular, sinalização e comunicação celular, adesão, resposta imune e invasão de parasitas, dentre outros. Apesar do amplo papel biológico dessas moléculas, ainda há poucos estudos acerca de sua glicobiologia estrutural, em parte em decorrência de características, como sua alta flexibilidade, que dificultam seu estudo por métodos como cristalografia de raio X e ressonância magnética nuclear. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar a estrutura e dinâmica: 1) do glicopeptídeo NETNES de Trypanosoma cruzi, completamente glicosilado e inserido em membrana; e 2) dos gangliosídeos GM1, GD1b e GT1b, em ambos os casos considerando soluções semelhantes às fisiológicas. A metodologia empregada envolveu a simulação de dissacarídeos, construção de mapas de energia por metadinâmica, montagem das glicanas e simulações por dinâmica molecular. Os parâmetros para as porções sacarídicas foram desenvolvidos pelo nosso grupo, enquanto que os da membrana foram retirados do trabalho de Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. No caso do NETNES, foram simulados quatro sistemas: membrana de fosfatidilcolina, membrana com glicosil fosfatidil inositol, membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com uma N-glicosilação e membrana com glicosil fosfatidil inositol e NETNES com duas N-glicosilações. Os resultados obtidos mostram que as propriedades da membrana e o modelo da âncora estão de acordo com os dados experimentais, e que a porção peptídica é bem flexível, principalmente o N-terminal, o qual se dobra na região próxima às asparaginas da Nglicosilação. Além disso o peptídeo se curva sobre a superfície da membrana, expondo ele próprio e algumas glicanas ao meio extracelular. Quanto aos gangliosídeos, cada um foi submetido a diversas simulações de dinâmica molecular, utilizando dois campos de força diferentes, e algumas com restrições de distâncias de acordo com dados experimentais de Nuclear Overhauser Effect. Foram realizadas análises dos diedros das ligações glicosídicas e das distâncias entre hidrogênios, sendo que essa última foi comparada com dados de ressonância magnética nuclear e cristalografia, indicando a capacidade dos campos de força GLYCAM, quando associado a restrições de distância, e do GROMOS96 em reproduzir os dados experimentais conformacionais dos gangliosídeos. / Glycosylation is the most abundant protein modification, occurring across all kingdoms of life and having several protein-carbohydrate linkages already described. The appendage of a carbohydrate to an amino acid sequence can affect its structure and function, being important for protein stability and rigidity, intracellular localization, cellular signalization and communication, adhesion, immune response, parasites invasion, among others. Despite the plentiful roles of those molecules, there are still a few works of structural glycobiology, due to some sugar features, as high flexibility, that hinder their characterization by experimental methods, such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. In this context, the present work aims to characterize and validate structure and conformation of: 1) NETNES glycopeptide from Trypanosoma cruzi attached to all glycans and membrane; 2) gangliosides GM1, GD1b and GT1b, in both cases considering solutions similar to the physiologic one. The employed methodology involves disaccharide simulations, construction of energy maps obtained from metadynamics, glycans building blocks and molecular dynamics simulations. The parameters for saccharidic portions were developed in our research group, and the ones for membrane were obtained from Kukol, A. J. Chem. Theory Comput., 2009,5:615-626. In NETNES case, four systems were simulated: POPC membrane, membrane with glycosylphosphatidylinositol, membrane with glycosylphosphatidylinositol and one N-glycosylation NETNES, and membrane with glycosylphosphatidylinositol and NETNES with two N-glycosylations. The obtained results indicate that membrane proprieties and anchor model are in good agreement with experimental data, and that the protein portion is very flexible, mainly on the N-terminal, which bends on the region near the N-glycosylated asparagines. Moreover, the peptide curves over membrane surface, exposing itself and some glycans to extracellular medium. Regarding the gangliosides, each one was submitted to several molecular dynamics simulations, using two different force fields, and some of them with distance restraints according to experimental Nuclear Overhauser Effect signals. Dihedrals distribution and hydrogens distances were analyzed, and the latter was compared to nuclear magnetic resonance and crystallography data, indicating the capability of GLYCAM, when associated with distance restraints, and of GROMOS96 force fields to reproduce experimental data of gangliosides conformation.

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina. / The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.