Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina. / The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.