Orientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/08/2014 / Inclui referências / Resumo: Estudos com a finalidade de produzir bioplásticos, como polihidróxialcanoatos (PHA), têm crescido nas últimas décadas por ser uma alternativa sustentável para a produção de plásticos biodegradáveis e, portanto, uma alternativa ambientalmente viável para a substituição dos processos petroquímicos utilizados massivamente nos dias de hoje. Herbaspirillum seropedicae tem um grande potencial biotecnológico quanto à produção de PHA, sendo que essa capacidade já foi reportada sobdiferentes condições de cultivo. O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a produção de PHB na estirpe parental H. seropedicae SmR1 e no seu mutante ntrC, defectivo na expressão de NtrC, um importante regulador do metabolismo de nitrogênio em diversas bactérias. A estratégia desenhada nos permitiu avaliar a produção em alta e baixa relação carbono/nitrogênio (C/N) utilizando NH4Cl como fonte de nitrogênio e monossacarídeos ou ácidos carboxílicos como fontes de carbono. Entre os ácidos carboxílicos avaliados, o citrato se mostrou o mais promissor, já que a produção de polihidroxibutirato atingida foi de 47,1% de PHB/psc para H. seropedicae SmR1 e 76% de PHB/psc para o mutante ntrC. Entre os monossacarídeos testados, a D-frutose se destacou como a melhor fonte de carbono deste grupo, atingindo produções de 30,5% e 65,8% de PHB para SmR1 e o mutante ntrC, respectivamente. Interessantemente, a fonte de carbono em que H. seropedicae teve o melhor desempenho quanto a produção de PHB foi o glicerol. As produções de PHB atingidas foram de 74,4% e 78% para H. seropedicae SmR1 e mutante ntrC, respectivamente. De modo geral, observou-se que independente da fonte de carbono utilizada, as maiores produções de PHB foram obtidas quando as concentrações de amônio no meio eram menores que 5mM/L, o que indica que altas relações C/N favorecem a síntese de PHB em H. seropedicae. O mutante ntrC demonstrou em todas as condições avaliadas produzir entre 20 a 100% mais PHB do que a estirpe parental SmR1. A complementação do mutante ntrC com uma cópia integra do gene ntrC de H. seropedicae SmR1 reverteu sua maior produção de PHB, retornando aos níveis da estirpe SmR1. Este resultado indica que a proteína NtrC está regulando o processo de síntese de PHB em H. seropedicae. As principais conclusões deste trabalho são: (i) a produção de PHB depende da natureza da fonte de carbono e provavelmente da sua via de metabolização e da produção de metabólitos como acetil-CoA e equivalentes reduzidos(NADPH e NADH); (ii), o mutante ntrC em todas as condições testadas apresentou maior produção de PHB, indicando que a ausência de NtrC pode afetar o balanço metabólico em H. seropedicae favorecendo a produção de PHA. Palavras chaves: Herbaspirillum seropedicae, Pohidroxibutirato (PHB), razão carbono/nitrogênio, sistema NTR, ntrC. / Abstract: Studies aiming to produce bioplastics such as polyhydroxyalkanoates (PHA) has grown in recent decades to be a sustainable alternative for production of biodegradable plastics is therefore an environmentally feasible alternative to the substitution of petrochemical processes use in massively days today. Herbaspirillum seropedicae has great biotechnological potential for the production of PHA, and this ability has been reported under different culture conditions. The main objective of this study was to evaluate the production of PHB in the parental strain H. seropedicae SmR1 and its ntrC mutant, defective in the expression of NtrC, an important regulator of nitrogen metabolism in various bacteria. The strategy allowed us to evaluate the production in high and low carbon/nitrogen (C/N) using NH4Cl as a nitrogen source and monosaccharides or carboxylic acids as carbon sources compared. Among the tested monosaccharides, D-fructose emerged as the best source of carbon this group, reaching yields of 30.5% and 65.8% PHB for SMR1 and ntrC, respectively. Interestingly, the carbon source that seropedicae H. had the best performance as PHB production was glycerol. The PHB production was achieved of 74.4% and 78% for H. seropedicae SMR1 and mutant ntrC, respectively. In general, it was observed that independent of the carbon source used, the highest production of PHB were obtained when the concentration of ammonia in the medium were lower than 5mM / L, indicating that high C/N ratios favoring the synthesis of PHB H. seropedicae. The ntrC mutant demonstrated in all conditions evaluated to produce between 20 and 100% higher than PHB SMR1 parental strain. The complementation of mutant ntrC integrates with a copy of the ntrC gene of H. seropedicae SmR1 reversed its largest production of PHB, returning to levels of strain SmR1. The complementation of mutant ntrC integrates with the copy of the ntrC gene of H. seropedicae SmR1 reversed its largest production of PHB, returning to levels of strain SmR1. This result indicates that indeed the NtrC protein is regulating the process of synthesis of PHB in H. seropedicae. The main conclusions are: (i) the production of PHB depends on the nature of the carbon source and probably its route of metabolism and the production of metabolites such as acetyl-CoA and reduced equivalnetes (NADPH and NADH); (ii) the ntrC mutant under all conditions tested showed higher production of PHB, indicating that the absence of NtrC can affect the metabolic balance in H. seropedicae favoring the production of PHA. Key words: Herbaspirillum seropedicae, Pohidroxibutirato (PHB), carbon/nitrogen ratio, NTR system, ntrC. XIII

Os Polihidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres naturais, acumulados por diversos microorganismos como reserva de carbono e energia, sendo hoje considerados a melhor alternativa para o plástico tradicional, devido às suas propriedades biodegradáveis e biocompatíveis. Escherichia coli é considerada um hospedeiro ideal para a produção de PHAs, devido a várias vantagens sobre outros microrganismos. Linhagens de Escherichia coli foram avaliadas com o intuito de escolher aquela que apresentasse as melhores características como hospedeira dos genes envolvidos na produção dos PHAs. A linhagem E. coli LS5218 apresentou os melhores resultados de consumo das diferentes fontes de carbono avaliadas, assim como as melhores velocidades de crescimento. Esta linhagem tem a capacidade de produzir, além do P3HB, o copolímero P3HB-co-3HV. Os resultados obtidos a partir dos cultivos em frascos agitados demonstraram que a linhagem E. coli LS5218 consegue produzir P3HB, correspondendo a cerca de 40% da massa seca celular. A limitação do crescimento nos cultivos em biorreator, mediante o controle da velocidade de alimentação da fonte de carbono e nitrogênio, favoreceu a síntese e acúmulo do polímero. A análise de fluxos metabólicos indicou que existe uma considerável perda de carbono na forma de CO2, devido ao suprimento de NADPH pela isocitrato desidrogenase. A análise de modos elementares aponta que, para se atingir desempenhos melhores, o fluxo na via das pentoses deveria ser aumentado significativamente, de forma a que todo o NADPH para biossíntese de P3HB fosse suprido por essa via, e, que o fluxo no ciclo de Krebs deveria ser o menor possível, suprindo apenas a demanda de precursores para a biossíntese de biomassa residual. Finalmente, foi possivel obter, embora em pequenas quantidades, acúmulos do copolimero a partir de E. coli LS5218 expressando os genes de C. necator. A partir destes resultados, fica evidente que a utilização da linhagem LS5218 é interessante sob o ponto de vista industrial, devido ao fato de ela utilizar eficientemente fontes de carbono, e ter a capacidade de acumular o P3HB e seu copolímero P3HB-co-3HB. / The Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are natural polyesters accumulated by several microorganisms as a source of carbon and energy, now considered as the best alternative to the traditional plastic due to their biocompatible and biodegradable properties. Escherichia coli is considered an ideal host for the production of PHAs, due to several advantages over other microorganisms. Escherichia coli strains were evaluated in order to choose the one that presented the best characteristics as a host of genes involved in the production of PHAs. The strain E. coli LS5218 showed the best results in terms of consumption of different carbon sources being tested and the best growth rates. This strain has the ability to produce the P3HB and additionally, the copolymer P3HB-co-3HV. The results from the cultivation in shaked flasks showed that the strain E. coli LS5218 can produce P3HB, corresponding to 40% approximatelly of the dry cell mass using glucose as carbon source. Limiting the growth of cultures in a bioreactor by controlling the feeding speed of the carbon and nitrogen source, favored the synthesis and accumulation of the polymer. Analysis of the metabolic flux indicated that a considerable loss of carbon in the form of CO2 due to NADPH supply by the isocitrate dehydrogenase. Elemental analysis shows that to achieve better performance, the flow of the pentose pathway should be substantially increased, in order to all the NADPH for the biosynthesis of P3HB can be supplied by this pathway and that the flow in the Krebs cycle should be as small as possible, only to supply the demand of precursors for the biosynthesis of residual biomass. Finally, it was possible to obtain, although in small quantities, accumulation of the copolymer using E. coli LS5218 expressing the genes of C. necator. From these results it is evident that the use of LS5218 strain is interesting from the industrial point of view due to the fact of efficiently utilize carbon sources and have the capacity of accumulate the P3HB and its copolymer P3HB-co-3HB.

Polihidroxialcanoatos (PHA) produzidos por Pseudomonas sp. LFM046 a partir de carboidratos e ácido propiônico contem monômeros com número ímpar e par de carbonos, representando um bom modelo para o estudo do metabolismo de propionato. Genes relacionados ao ciclo do 2-metilcitrato foram encontrados em todas as espécies de Pseudomonas compondo um operon prpRBCAcnMprpFD. Genes da via do metilmalonil-CoA não foram encontrados em Pseudomonas. Genes da <font face=\"Symbol\">a-oxidação de propionato foram encontrados apenas em P. aeruginosa. A análise de um mutante prp obtido por inserção de transposon revelou que estava mutado no gene prpB, relacionado ao ciclo do 2-metilcitrato. A análise de mutantes obtidos por radiação ultravioleta revelou que dois devem estar afetados em via menos relevante para o metabolismo de propionato e outros dois na ativação desse ácido orgânico. Experimentos com propionato marcado (1C13) demonstraram que as vias do oxobutirato, do metimalonil-CoA e do 2-hidroxiglutarato não devem contribuir para o metabolismo de propionato em Pseudomonas sp. LFM046. / Polyhydroxyalkanoates (PHA) produced by Pseudomonas sp. LFM046 from carbohydrates and propionic acid contains monomers with odd and even number of carbons, representing a good model to study the propionate metabolism. Genes related to 2-methycytrate cycle were found in all Pseudomonas species organized in an operon prpRCAAcnMprpFD. Genes related to the methylmalonyl-CoA pathway were not found in Pseudomonas. Genes related to the propionic <font face=\"Symbol\">a-oxidation were found only in P. aeruginosa. Analysis of a prp mutant obtained by transposon insertion revealead that it was mutated in prpB gene, related to the 2-methylcytrate cycle. The analysis of mutants obtained using ultraviolet radiation showed that two should be affected in less relevant propionate metabolism pathways and other two in the activation of this organic acid. Experiments with labeled propionate (113C) demonstrated that the oxobutyrate, methylmalonil-CoA and 2-hydroxyglutarate pathways should not contribute to the propionate metabolism in Pseudomonas sp. LFM046.

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:54:52Z : No. of bitstreams: 1 000863371_20160803.pdf: 166425 bytes, checksum: 752e027feac0fcf614b869f789d1b5e5 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-03T14:23:01Z: 000863371_20160803.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-03T14:23:33Z : No. of bitstreams: 1 000863371.pdf: 1791623 bytes, checksum: 3c0e869b1e7500a28d6bcd4849409a72 (MD5) / A busca por materiais substitutos do petróleo para a produção de polímeros tem crescido muito na última década, devido a grande poluição causada por estes derivados. Dentre várias alternativas de novos materiais estudados a zeína, uma proteína componente do glúten do milho, apresenta ótimas características de polimerização com a possibilidade de formar filmes com funcionalidades compatíveis aos materiais derivados de petróleo. Entretanto, para determinadas utilizações, há necessidade de melhorias em algumas propriedades mecânicas e de resistência. O milho é um produto agrícola de grande consumo na alimentação humana e animal, devido a sua composição química, que confere aos seus derivados importantes funções nutricionais e tecnológicas. O Brasil é o terceiro maior produtor e a moagem úmida é o processo utilizado para obtenção de vários coprodutos do grão e tem como objetivo separar o grão em frações relativamente puras: germe (com alto teor de óleo), fibra (proveniente do pericarpo e endosperma dos grãos), amido (64%) e glúten (10%) de alto teor proteico (constituído pelas proteínas glutelina, globulina, albumina e zeína). A banana é uma das frutas mais importantes do mundo, tanto no que se refere à produção quanto à comercialização, constituindo o quarto produto alimentar mais produzido mundialmente, a seguir ao arroz, trigo e milho. O Brasil é o segundo colocado em área plantada com 7 milhões de toneladas ao ano, produzindo de 180 a 200 toneladas de resíduos vegetais, o que pode favorece a proliferação de fungos com difícil controle de tratamento, devido à alta umidade incidente nas plantações. A extração do pseudocaule das bananeiras pode ser uma alternativa de renda interessante para a mão de obra rural, além de poder ser uma alternativa viável para reforço de compósitos. Estudos têm sido realizados para buscar alternativas de uso dos subprodutos obtidos,... / The search for materials which substitute oil for the production of polymers has increased a lot in the last decade, due to the high pollution caused by its derivatives. Among several alternatives of new materials studied, zein, a protein component of corn gluten, presents great polymerization characteristics with the ability to form films with compatible roles to materials derived from petroleum, however for certain uses there is need for improvement in some mechanical and resistance properties. Corn is an agricultural product of major consumption in both human and animal food attributable to its chemical composition, which gives its derivatives important nutritional and technological functions. Brazil is the third largest producer and the second largest sector of corn processing in the country is the wet milling which aims to separate the grain in relatively pure fractions: germ (with high content of oil), fiber (from the pericarp and endosperm of the grain), starch (64%) and gluten (10%) of high protein content (formed by the glutelin, globulin, albumin and zein proteins). The banana is one of the most important fruit in the world, both as regards production and marketing, being the fourth most food product produced worldwide, after rice, wheat and corn. Brazil is the second in area planted to 7 million tons a year, producing 180-200 tons of plant residues, which may favor the proliferation of fungi difficult to control with treatment, due to high humidity incident on the plantations. The extraction of the pseudostem of banana trees can be an interesting alternative income for the hand of rural work, and can be a viable alternative for reinforcing composites. There is an emerging need to seek alternatives by using its by-products, primarily the ones of lower aggregated value such as fiber, since they have low value, and are used mainly for animal food formulations. The development of new materials using these components will add ...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-09. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:19Z : No. of bitstreams: 1 000844480_20160509.pdf: 163596 bytes, checksum: 7a65afe1701f9255719a36c6da228163 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-09T17:15:59Z: 000844480_20160509.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-09T17:16:42Z : No. of bitstreams: 1 000844480.pdf: 648539 bytes, checksum: 8491bdb0a5d77bf2bfcc558c5c1cbb26 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Devido à sua composição química, os alimentos podem sofrer alteração da qualidade e do seu conteúdo nutricional como consequência de fatores tais como a contaminação microbiológica, a contaminação com outros alimentos ou compostos químicos, a ação de agentes ambientais como radiação (UV), ar (oxigênio), câmbios de temperatura, entre outros. Por essa razão, a indústria dos alimentos, a fim de proteger e garantir a qualidade, a segurança e o conteúdo nutricional dos produtos alimentícios, é a indústria que mais usa embalagens não biodegradáveis. No entanto, a preocupação mundial devido ao excessivo aumento da contaminação ambiental e acumulação de embalagens plásticas não biodegradáveis têm gerado a necessidade de desenvolver embalagens biodegradáveis que permitam garantir a qualidade do produto além de diminuir o impacto negativo ao ambiente. Dessa forma, nos últimos tempos, as indústrias de alimentos e de embalagens, assim como as instituições de pesquisa, têm focado os seus estudos no desenvolvimento de embalagens biodegradáveis produzidas a partir de resíduos agrícolas e subprodutos da agroindústria que podem ser rapidamente degradados pela ação de microrganismos do solo. Essas embalagens, principalmente na forma de filmes e coberturas, são baseadas em biopolímeros como proteínas (zeína, colágeno, gelatina, entre outras), carboidratos (amido, quitosana, alginato, entre outras) e lipídeos (ceras e ácidos graxos). A zeína, principal proteína do milho, tem sido usada em algumas aplicações na indústria de alimentos e farmacêutica, porém, o seu uso como embalagem ainda é um grande obstáculo visto que as suas propriedades físicas, mecânicas e estruturais são inferiores quando comparadas com as embalagens plásticas tradicionais. Baseado nisso, vários estudos têm demonstrado que a combinação de duas ou mais biomoléculas, além de agentes plastificantes, permite melhorar as... / Due to their chemical composition, foodstuffs may undergo quality and nutritional content deterioration as a consequence of factors such as microbiological contamination, contact with other foodstuffs or chemical compounds, the action of environmental agents as radiation (UV), air (oxygen), temperature variations, among others. Based on that, the food industry, aiming to protect and assure the quality and nutritional content of foodstuffs, is the greatest user of non-biodegradable packaging. In spite of that, the world's environmental concern due to the increase of the contamination and the accumulation of non-biodegradable packaging has promoted the development of biodegradable materials that allows for reducing the negative environmental impact as well as assures the food quality and nutritional content of foodstuffs. Thereby, food and packaging industries as well as several research institutions have focused their studies on the development of biodegradable packaging from sources such as agricultural residues and agroindustry by-products that are quickly degraded by soil microorganisms due to their natural origin. These packaging, mainly films and coatings, are based on biopolymers such as proteins (zein, collagen, gelatin, among others), carbohydrates (starch, chitosan, alginate, among others) and lipids (waxes and fatty acids). Zein, the main corn protein, has been used for industrial food and pharmaceutical applications; nonetheless, its use as an industrial packaging is limited due to its inferior physical, mechanical and structural properties compared to traditional plastic packaging. Based on that, several studies have demonstrated that combining two or more biopolymers as well as including plasticizer agents into the matrix of the biodegradable materials allows for improving the functional properties of the zeinbased films. Thus, in the first part of this study, different concentrations of ethanol (zein solvent) and glycerol... / FAPESP: 2011/08107-3 / FAPESP: 2013/125468

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-27T15:39:36Z No. of bitstreams: 1 2017_PollyneBororemaAlmeidadeLima.pdf: 7073248 bytes, checksum: a7c969e9336269c217c7c165b0bda9b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-31T21:04:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_PollyneBororemaAlmeidadeLima.pdf: 7073248 bytes, checksum: a7c969e9336269c217c7c165b0bda9b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-31T21:04:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_PollyneBororemaAlmeidadeLima.pdf: 7073248 bytes, checksum: a7c969e9336269c217c7c165b0bda9b5 (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes). / O descarte de resíduos plásticos no meio ambiente associado à dependência de insumo petroquímico para produção dos mesmos tem gerado grande preocupação, levando à busca constante pelo desenvolvimento de tecnologias verdes renováveis. Segundo a Plastics Europe, em 2016, 25,8 milhões de toneladas de resíduos de plástico pós-consumo acabaram nos fluxos oficiais de resíduos. Destes, 69,2% foi recuperado através de processos de reciclagem e recuperação de energia, enquanto 30,8% continuaram a ser depositados em aterros sanitários. Uma alternativa a utilização de plásticos derivados de petróleo é a produção de plásticos biodegradáveis, como o PLA -poli(ácido lático)-, pois além de ter tempo de degradação diminuído, é produzido a partir de fontes renováveis em bioprocessos estabelecidos, como exemplo, a fermentação microbiana. Dentre os diferentes microrganismos utilizados no estabelecimento destes bioprocessos, a utilização de leveduras é vantajosa, por produzirem metabólitos, proteínas recombinantes e permitir manipulação gênica para otimização. A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido bastante utilizada em processos fermentativos por atingir altas densidades celulares e produzir poucos co-produtos. Além disso, esta é capaz de utilizar glicerol como única fonte de carbono, principal resíduo da indústria do biodiesel. Porém, não é capaz de produzir ácido lático, monômero utilizado na síntese de PLA. Assim o presente estudo teve como objetivo a construção de cepas geneticamente modificadas de P. pastoris capazes de produzir ácido lático utilizando glicerol como substrato. Para isto, o gene codificador da enzima lactato desidrogenase bovina (Bos taurus) foi inserido no genoma de P.pastoris, permitindo que a cepa X-33 produzisse ácido lático. Embora P. pastoris seja conhecida por seu metabolismo respiratório, as fermentações em batelada realizadas com baixa oxigenação aumentou a produção de ácido láctico em 20%, indicando que nesta situação o metabolismo fermentativo prevaleceu. Além disso, um novo transportador putativo de lactato de P. pastoris denominado PAS, foi identificado por similaridade de pesquisa com o transportador de lactato de Saccharomyces cerevisiae Jen1p. Ambos os transportadores heterólogos e homólogos, Jen1p e PAS, foram avaliados em uma cepa que já continha atividade LDH. As fermentações em batelada das cepas de P. pastoris com o transportador de lactato foram realizadas em condições aeróbicas seguida por uma fase de oxigênio limitado, nesta a produção de ácido lático foi maior. Os resultados mostraram que a cepa contendo o transportador PAS apresentou o maior rendimento, 0,7 g/g (ácido lático/ glicerol). / The disposal of plastic waste in the environment associated with the dependence of petrochemical input for its production has generated great environmental concern, leading to the constant search for the development of green technologies. According to Plastics Europe, in 2016, 25.8 million tonnes of post-consumer plastic waste ended up in official waste streams. Of these, 69.2% was recovered through recycling and energy recovery processes, while 30.8% continued to be deposited in landfills. An alternative to the use of petroleum-based plastics is the production of biodegradable plastics, such as PLA –poly (lactic acid)-, in addition to having decreased degradation time, it is produced from renewable sources in established bioprocesses, such as microbial fermentation. Among the different microorganisms used in the establishment of these bioprocesses, the use of yeasts is advantageous, because they produce metabolites, recombinant proteins and allow gene manipulation for optimization. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been widely used in fermentative processes because it reaches high cell densities and produces few co-products. In addition, it is able to use glycerol as a unique carbon source, the main residue of the biodiesel industry. However, it is not capable of producing lactic acid, the monomer used in PLA synthesis. Thus the present study had as objective the construction of genetically modified strains of P. pastoris capable of producing lactic acid using glycerol as substrate. For this, the gene encoding bovine (Bos taurus) lactate dehydrogenase enzyme was inserted into the genome of P.pastoris, allowing strain X-33 to produce lactic acid. Batch fermentation of the P. pastoris X-33 strain producing LDHb allowed for lactic acid production in this yeast. Although P. pastoris is known for its respiratory metabolism, batch fermentations were performed with different oxygenation levels, indicating that lower oxygen availability increased lactic acid production by 20 %, pushing the yeast towards a fermentative metabolism. Furthermore, a newly putative lactate transporter from P. pastoris named PAS has been identified by search similarity with the lactate transporter from Saccharomyces cerevisiae Jen1p. Both heterologous and homologous transporters, Jen1p and PAS, were evaluated in one strain already containing LDH activity. Fed-batch experiments of P. pastoris strains carrying the lactate transporter were performed with the batch phase at aerobic conditions followed by an aerobic oxygen-limited phase where production of lactic acid was favored. The results showed that the strain containing PAS presented the highest lactic acid titer, reaching a yield of approximately 0.7 g/g (lactic acid/ glycerol).

Polihidroxialcanoatos (PHA) produzidos por Pseudomonas sp. LFM046 a partir de carboidratos e ácido propiônico contem monômeros com número ímpar e par de carbonos, representando um bom modelo para o estudo do metabolismo de propionato. Genes relacionados ao ciclo do 2-metilcitrato foram encontrados em todas as espécies de Pseudomonas compondo um operon prpRBCAcnMprpFD. Genes da via do metilmalonil-CoA não foram encontrados em Pseudomonas. Genes da <font face=\"Symbol\">a-oxidação de propionato foram encontrados apenas em P. aeruginosa. A análise de um mutante prp obtido por inserção de transposon revelou que estava mutado no gene prpB, relacionado ao ciclo do 2-metilcitrato. A análise de mutantes obtidos por radiação ultravioleta revelou que dois devem estar afetados em via menos relevante para o metabolismo de propionato e outros dois na ativação desse ácido orgânico. Experimentos com propionato marcado (1C13) demonstraram que as vias do oxobutirato, do metimalonil-CoA e do 2-hidroxiglutarato não devem contribuir para o metabolismo de propionato em Pseudomonas sp. LFM046. / Polyhydroxyalkanoates (PHA) produced by Pseudomonas sp. LFM046 from carbohydrates and propionic acid contains monomers with odd and even number of carbons, representing a good model to study the propionate metabolism. Genes related to 2-methycytrate cycle were found in all Pseudomonas species organized in an operon prpRCAAcnMprpFD. Genes related to the methylmalonyl-CoA pathway were not found in Pseudomonas. Genes related to the propionic <font face=\"Symbol\">a-oxidation were found only in P. aeruginosa. Analysis of a prp mutant obtained by transposon insertion revealead that it was mutated in prpB gene, related to the 2-methylcytrate cycle. The analysis of mutants obtained using ultraviolet radiation showed that two should be affected in less relevant propionate metabolism pathways and other two in the activation of this organic acid. Experiments with labeled propionate (113C) demonstrated that the oxobutyrate, methylmalonil-CoA and 2-hydroxyglutarate pathways should not contribute to the propionate metabolism in Pseudomonas sp. LFM046.

Os Polihidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres naturais, acumulados por diversos microorganismos como reserva de carbono e energia, sendo hoje considerados a melhor alternativa para o plástico tradicional, devido às suas propriedades biodegradáveis e biocompatíveis. Escherichia coli é considerada um hospedeiro ideal para a produção de PHAs, devido a várias vantagens sobre outros microrganismos. Linhagens de Escherichia coli foram avaliadas com o intuito de escolher aquela que apresentasse as melhores características como hospedeira dos genes envolvidos na produção dos PHAs. A linhagem E. coli LS5218 apresentou os melhores resultados de consumo das diferentes fontes de carbono avaliadas, assim como as melhores velocidades de crescimento. Esta linhagem tem a capacidade de produzir, além do P3HB, o copolímero P3HB-co-3HV. Os resultados obtidos a partir dos cultivos em frascos agitados demonstraram que a linhagem E. coli LS5218 consegue produzir P3HB, correspondendo a cerca de 40% da massa seca celular. A limitação do crescimento nos cultivos em biorreator, mediante o controle da velocidade de alimentação da fonte de carbono e nitrogênio, favoreceu a síntese e acúmulo do polímero. A análise de fluxos metabólicos indicou que existe uma considerável perda de carbono na forma de CO2, devido ao suprimento de NADPH pela isocitrato desidrogenase. A análise de modos elementares aponta que, para se atingir desempenhos melhores, o fluxo na via das pentoses deveria ser aumentado significativamente, de forma a que todo o NADPH para biossíntese de P3HB fosse suprido por essa via, e, que o fluxo no ciclo de Krebs deveria ser o menor possível, suprindo apenas a demanda de precursores para a biossíntese de biomassa residual. Finalmente, foi possivel obter, embora em pequenas quantidades, acúmulos do copolimero a partir de E. coli LS5218 expressando os genes de C. necator. A partir destes resultados, fica evidente que a utilização da linhagem LS5218 é interessante sob o ponto de vista industrial, devido ao fato de ela utilizar eficientemente fontes de carbono, e ter a capacidade de acumular o P3HB e seu copolímero P3HB-co-3HB. / The Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are natural polyesters accumulated by several microorganisms as a source of carbon and energy, now considered as the best alternative to the traditional plastic due to their biocompatible and biodegradable properties. Escherichia coli is considered an ideal host for the production of PHAs, due to several advantages over other microorganisms. Escherichia coli strains were evaluated in order to choose the one that presented the best characteristics as a host of genes involved in the production of PHAs. The strain E. coli LS5218 showed the best results in terms of consumption of different carbon sources being tested and the best growth rates. This strain has the ability to produce the P3HB and additionally, the copolymer P3HB-co-3HV. The results from the cultivation in shaked flasks showed that the strain E. coli LS5218 can produce P3HB, corresponding to 40% approximatelly of the dry cell mass using glucose as carbon source. Limiting the growth of cultures in a bioreactor by controlling the feeding speed of the carbon and nitrogen source, favored the synthesis and accumulation of the polymer. Analysis of the metabolic flux indicated that a considerable loss of carbon in the form of CO2 due to NADPH supply by the isocitrate dehydrogenase. Elemental analysis shows that to achieve better performance, the flow of the pentose pathway should be substantially increased, in order to all the NADPH for the biosynthesis of P3HB can be supplied by this pathway and that the flow in the Krebs cycle should be as small as possible, only to supply the demand of precursors for the biosynthesis of residual biomass. Finally, it was possible to obtain, although in small quantities, accumulation of the copolymer using E. coli LS5218 expressing the genes of C. necator. From these results it is evident that the use of LS5218 strain is interesting from the industrial point of view due to the fact of efficiently utilize carbon sources and have the capacity of accumulate the P3HB and its copolymer P3HB-co-3HB.

Burkholderia sacchari é uma nova espécie bacteriana do solo brasileiro que tem a capacidade de crescer em sacarose e acumular grânulos intracelulares de poliésteres pertencentes à família dos polihidroxiaIcanoatos (PHA). Quando cultivado em sacarose, o homopolímero poli-3¬hidroxibutirato é acumulado por esta bactéria, que é usado como um plástico biodegradável e biocompatível. Quando sacarose e ácido propiônico são fornecidos como fontes de carbono, as células de B. sacchari acumulam o copolímero poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (P3HB-co-3HV). Entretanto, uma pequena porcentagem do ácido propiônico fornecido é convertido a unidades 3HV devido à eficientes vias catabólicas que convertem este substrato preferencialmente a biomassa, CO2 e água, reduzindo portanto a eficiência da produção do polímero. Ao menos duas vias do catabolismo de propionato foram previamente propostas em B. sacchari: a-oxidação e ciclo do 2-metilcitrato (2MCC), sendo somente a última confilmada no nível molecular. Mutantes UV, obtidos anteriormente, foram incapazes de crescer em propionato (prp) e também apresentaram fenótipo afetado no crescimento em intermediários da a-oxidação. No presente trabalho, após uma busca em bibliotecas genômicas de B. sacchari, uma delas construída também no presente trabalho, três diferentes fragmentos de DNA presentes nos clones AI, PI e P2 foram capazes de restaurar o fenótipo prp+ aos mutantes. Experimentos quantitativos revelaram que AI somente restaurou parcialmente a conversão de propionato a unidades 3HV aos mutantes. PI foi capaz de restaurar a capacidade de crescimento em propionato, e em outros intermediários da a-oxidação, a um dos mutantes. Um DNA de 1.2 Kb, subfragmento de PI, ainda capaz de complementar mutantes prp, foi subclonado e seqüenciado, demonstrando similaridade a seqüências de DNA codificadoras de reguladores transcricionais do tipo LysR de várias bactérias, incluindo espécies de Bllrkholderia. Regiões adjacentes a LysR em diferentes genomas de Burkholderia são anotados como codificadores de acil-CoA desidrogenases, ao lado de proposta acil-CoA transferases/carnitina desidrogenases e de uma permease do facilitador maior da superfamília MFS-l. Após confirmação das mesmas regiões adjacentes em B. sacchari e também a sua específica deleção, será possível provar a presença da via do catabolismo de propionato indicada neste trabalho. / Burkholderia sacchari is a new bacterial species from brazilian soil, able to grow in sucrose, accumulating intracellular granules of polyester belonging to the polyhydroxyalkanoate family (PHA). When cultivated on sucrose, the homopolymer poly-3-hydroxybutyrate is accumulated by this bacterium, which is used as biodegradable and biocompatible plastic. When sucrose and propionic acid are supplied as carbon sources, B. sacchari cells accumulate the copolymer poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (P3HB-co-3HV). However, a small percentage ofthe propionic acid supplied is converted to 3HV units, because efficient catabolic pathways convert this substrate preferentially to biomass, CO2 and water, thus reducing the efficiency of polymer production. At least two propionate catabolic pathways have been previously indicated in B. sacchari: a-oxidation and the 2-methylcitric acid (2MCC), the latter confirmed at molecular leveI. UV mutants previously obtained were unable to grow in propionate (prp) and also showed the phenotype affected concerning grow on intermediates of propionate a-oxidation. In the present work, after a screening in B. sacchari genomic libraries, one ofthem constructed also in the present work, the prp + phenotype was restored to the mutants by three different DNA fragments harbored by dones A), PI and P2. Quantitative experiments revealed that AI restored only partially the quantitative conversion of propionate to 3HV units to the mutants. PI restored the ability to grow in propionate and in other intermediates of a-oxidation to one prp mutant. A DNA 1.2 Kb subfragment of PI, still able to complement prp mutants, was subcloned and sequenced, showing similarity to DNA sequences encoding to LysR-type transcriptional regulators of various bacteria, including BlIrkholderia species. Adjacent regions to LysR in different genomes of BlIrkholderia are annotated as encoding to acyl-CoA dehydrogenases, neighboring a predicted acyl-CoA transferases/carnitine dehydratase and a permease ofthe major facilitator superfamily MFS-1. After confirmation ofthe same adjacent regions in B. sacchari and also their especific deletion, it will be possible to prove the presence of the pathway indicated here in the catabolism of propionate.

Resíduos lignocelulósicos são substratos proeminentes para a produção sustentável de polihidroxialcanoatos (PHAs) e etanol. A xilose é um dos principais componentes da lignocelulose, mas o aproveitamento eficiente desse açúcar ainda representa uma barreira técnica. O objetivo desse trabalho foi obter linhagens bacterianas mais eficientes no consumo desse açúcar. Foi introduzido maior número de cópias dos genes do catabolismo (xylAB) e transporte (xylFGH) de xilose, nas linhagens Escherichia coli KO11, produtora de etanol, e Burkholderia sacchari LFM 101, produtora de poli-3-hidroxibutirato (PHB). Os recombinantes foram avaliados quanto ao consumo de xilose e produção na presença e ausência de glicose. Para B. sacchari LFM 101 essa estratégia não incrementou o consumo desse açúcar. Para E. coli KO11 xylAB reduziu o tempo de consumo de xilose e aumentou a produção final de etanol em 30%, mas esse efeito foi prejudicado pela repressão catabólica; enquanto xylFGH foi deletério ao reduzir para quase zero o crescimento e produção de etanol por essa linhagem. / Lignocellulosic residues are remarkable substrates for the sustainable production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) and ethanol. Xylose is one of the most important lignocelullose component but its efficient utilization still represents a technical barrier. The aim of this work was to obtain bacterial strains more efficient in the xylose consumption. Multiple copies of the catabolism (xylAB) and transport (xylFGH) genes of xylose were introduced in the ethanol producer Escherichia coli KO11 strain and the poly-3-hydroxybutyrate (PHB) producer Burkholderia sacchari LFM 101. The recombinants strains were evaluated for their production and xylose consumption in the presence and absence of glucose. This strategy did not increase xylose consumption in B. sacchari strains. The xylAB gene improved xylose consumption and increased the ethanol production about 30% in E. coli KO11, but this effect was impaired by catabolite repression; while xylFGH gene was deleterious to reduce the growth and ethanol production by this strain.