Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-23Bitstream added on 2014-06-13T19:35:21Z : No. of bitstreams: 1 gomes_es_me_jabo.pdf: 1563110 bytes, checksum: d05b3a2a3af4b9eac347a74aebd3029e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As PKSs tipo II são complexos enzimáticos envolvidos na produção de policetídeos. Estes são metabólitos secundários que possuem papel-chave no desencadeamento das respostas bioquímicas que levam à diversificação fisiológica frente a fatores adversos, fazem parte da composição de pigmentos de esporos microbianos, além de comporem a estrutura química de importantes antibióticos explorados pela indústria farmacêutica. Foi feita a prospecção de novos “clusters” gênicos para PKSs tipo II em uma biblioteca metagenômica de 9.320 clones, através de amplificação por PCR com “primers” degenerados para uma região gênica conservada. Dentre três clones encontrados, um foi sequenciado pela estratégia de shotgun, resultando em um consensus de 22.988 pares de bases. Foi feita a predição funcional de ORFs por homologia obtida com a ferramenta Blast (NCBI) e também a identificação de domínios enzimáticos pelo PRODOM e PFAM. Dentre os resultados da predição por homologia de domínios enzimáticos foi possível identificar ORFs homologas à: reguladores gênicos (LacI e LuxR); carboidrases (Lacases, β-glucosidases, Quitinases/Celulases); transferases (O-metil-transferases, Acíl-transferases); pks mínima; ciclases, aromatases, hidroxilases, mono-oxigenases e transportadores ABC. Alguns “clusters” enzimáticos podem ainda atuar em degradação de celulose e lignina. As enzimas candidatas ao core biossíntético do “cluster” (pks mínima) foram submetidas à modelagem de estrutura tridimensional in silico. Os modelos 3D foram avaliados quanto a acurácia, utilizando as ferramentas: Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage e Swiss-Model. Uma vez validados, as KSA e CLF foram submetidas a simulações de “docking” enzimático / The type II PKSs are enzyme complexes involved in the production of polyketides. These are secondary metabolites that have key role in triggering the biochemical responses that lead to physiological diversification against adverse factors are part of the pigment composition of microbial spores, and compose the chemical structure of most antibiotics exploited by the pharmaceutical industry. Some clusters could act in enzymatic degradation of cellulose and lignin. It was made a prospection for new clusters gene for type II PKSs in a metagenomic library of 9320 clones by PCR amplification with degenerate primers for a conserved gene region. Among three clones found, one was sequenced by subcloning and shotgun strategy, resulting in a consensus of 22,988 base pairs. It was made the prediction of functional homology ORFs by Blast (NCBI) and also identifying areas for enzymatic Prodom and PFAM. Among them were found homologous to: ABC transporters; minimal PKS, cyclasea; Aromatasea; Hydroxylases; Mono-oxygenases; O-methyl-transferases; Multicopper oxidase/laccase, β-glucosidase, chitinase/ Cellulases; Peptidases; Acyl-transferases, in addition of gene regulators similar to LacI and LuxR. The biosynthetic enzymes candidates for the core of the cluster (minimal pks) underwent three-dimensional structure modeling in silico. The 3D models were evaluated for accurate, using the tools of 'Assessing Verify3D, Qmean, Procheck, Rampage and Swiss-Model. Once validated, the KSA and CLF were subjected to simulated docking enzyme between them

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-21Bitstream added on 2014-06-13T20:44:15Z : No. of bitstreams: 1 schuch_v_dr_jabo.pdf: 940291 bytes, checksum: b12a082987505c45883c2a6c161d5861 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho foi realizada a prospecção de novos genes de interesse biotecnológico em bibliotecas metagenômicas e em linhagens de Burkholderia através da técnica de reação em cadeia da polimerase. Nas bibliotecas metagenômicas, foi possível identificar genes que codificam álcool desidrogenase, oxirredutase, acil-CoA desidrogenase, luciferase, transportadores de membrana, thiolase, aminoglicosídeo fosfotransferase, desidrogenase de cadeia curta, proteínas repressoras TetR, enoil-CoA hidratase/isomerase, entre outras. Nas treze linhagens de Burkholderia testadas, seis apresentaram amplificação positiva para o gene de xilose isomerase. Estes genes foram completamente sequenciados e as sequências foram utilizadas em análises computacionais, que permitiram estabelecer a identidade entre as sequências e a dedução da função das proteínas baseado em similaridades. Foi realizada a medida do índice de adaptação de códons, com a finalidade de se encontrar um hospedeiro onde a expressão seja maximizada, baseando-se na presença de códons preferenciais e raros. Está análise mostrou que os genes encontrados possuem boas possibilidades de expressão em Escherichia coli, mas que podem apresentar uma taxa de expressão ineficiente em Saccharomyces cerevisiae. Foi realizado um teste de complementação gênica utilizando um dos genes descobertos e uma linhagem de Escherichia coli que possui o gene de xilose isomerase nocauteado. Os transformantes foram capazes de crescer em meio cuja única fonte de carbono era o açúcar xilose, mostrando que o gene é funcional. Estes genes serão utilizados futuramente em ensaios de expressão para caracterização da enzima / In this work was carried out prospection for new genes of biotechnological interest in metagenomic libraries and strains of Burkholderia through the technique of polymerase chain reaction. In metagenomics libraries, we could identify genes encoding alcohol dehydrogenase, oxidoreductase, acyl-CoA dehydrogenase, luciferase, membrane transporters, thiolase, aminoglycoside phosphotransferase, short-chain dehydrogenase, TetR repressor protein, enoyl-CoA hydratase/isomerase, among others. Of the 13 strains of Burkholderia tested, 6 showed positive amplification for the xylose isomerase gene. The genes were completely sequenced and the sequences were used in computational analysis, which allowed to establish the identity between the sequences and deducing protein function based on similarities. We evaluated the codon adaptation index, with the aim of finding a host in which the expression is maximized, based on the presence of preferred codons and rare. This analysis showed that the genes found have good possibilities of expression in Escherichia coli, but that may have an inefficient rate of expression in Saccharomyces cerevisiae. We conducted a genetic complementation test using one of the discovered genes and one strain of Escherichia coli that has the xylose isomerase gene knocked out. Transformants were able to grow in a medium whose sole source of carbon was the sugar xylose, showing that the gene is functional. These genes will be used in expression assays for characterization of new enzymes

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-02Bitstream added on 2014-06-13T19:55:59Z : No. of bitstreams: 1 paixao_daa_me_jabo.pdf: 1354562 bytes, checksum: 375f9e3806bd3d094111e5d1f95f8ddd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A estratégia de clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA é uma das técnicas moleculares que permite estimar e comparar a diversidade microbiana de diferentes amostras ambientais. O objetivo deste trabalho foi estimar a diversidade de microrganismos pertencentes ao Domínio Bactéria em um consórcio degradador de óleo diesel, por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA, assim como desenvolver uma nova metodologia de rastreamento em bibliotecas metagenômicas. O consórcio bacteriano foi obtido através de solo enriquecido com óleo diesel. O DNA metagenômico foi extraído com o auxílio do kit Fast DNA spin Kit for soil (Bio101- Quantum Biotechnologies) e amplificado por uma reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com os oligonucleotídeos iniciadores FD1 e RD1 específicos para a o gene 16S rRNA. Os produtos de PCR foram clonados em vetor pGEM T Easy (Promega) e transformados em células competentes de Escherichia Coli DH5 . O sequenciamento parcial dos clones foi feito com oligonucleotideos universais do vetor. Para a prospecção gênica foi utilizado membranas de nylon com “pools” de DNA de todas as placas. A biblioteca obtida gerou 431 clones. Os clones obtidos apresentaram similaridade com o filo Proteobacteria, com representantes das classes Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira e Betaproteobacteria. O gênero Pseudomonas apresentou-se com maior frequência de clones na biblioteca. O “software” DOTUR foi usado para determinar o número de unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A curva de extinção indicou que os 431 clones sequenciado foram suficientes para estimar a diversidade bacteriana do consórcio. A metodologia testada baseado em “pools” de DNA foi eficiente na detecção e isolamento do gene Alkb na bilbioteca metagenomica. / Cloning and sequencing of 16S rRNA gene it is one of the molecular techniques that permits estimate and compare the microbial diversity of different environmental samples. The aim of this work was estimate the diversity of microorganisms that belong to Bacteria domain in a consortium specialized in diesel oil degradation, through partial sequencing of 16S rRNA gene, as well as develop a new methodology for screening libraries in metagenomics. This consortium was obtained through enrichments achieved using diesel oil in soil samples. The metagenomic DNA was obtained using Fast DNA spin Kit for soil (Bio 101-Quantum Biotechnologies) and amplified by PCR (Polymerase chain reaction) with FD1 and RD1 oligonucleotides, which are specific for 16S rRNA gene. The PCR products were cloned into pGEM-TEasy vector (Promega) and Escherichia coli DH5 was used as the host cell for recombinant DNAs. The partial clones sequencing was obtained using universal primers of the vector. For the exploration of gene were used nylon membranes with Pools of DNA from all plates. The library generated from 431 clones. All clones sequenced showed similarity with the phylum Proteobacteria, distributed in Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira and Betaproteobacteria classes. The Pseudomonas genus was the most abundant genus found in the metagenomic library. The DOTUR software was used to assigns sequences to operational taxonomic units (OTUs). Using the OTUs composition data, rarefaction curves were made to show that 431 sequences were enough to obtain a satisfactory coverage of diversity of the microbial consortium. The test methodology based on Pools of DNA isolation was effective in detecting the gene Alkb Library metagenomics.