Los virus de plantas constituyen, en ocasiones, una seria amenaza para numerosos cultivos. A pesar de las numerosas investigaciones realizadas, existe todavía un gran desconocimiento de las rutas y los mecanismos que operan en la invasión viral de los correspondientes huéspedes. Es importante destacar que el bloqueo en el movimiento viral constituye uno de los mecanismos de resistencia natural más frecuentes a los virus. El progreso en el conocimiento de estas etapas del ciclo viral puede llevar a estrategias antivirales. En el presente trabajo se ha pretendido caracterizar estructural y funcionalmente las 5 proteínas codificadas por el genoma del MNSV, haciendo especial hincapié en caracterizar los factores, tanto virales como celulares, que intervienen en el transporte intra e intercelular del virus. Como paso previo y necesario, en el Capítulo 1 de la presente Tesis, se ha obtenido un clon infeccioso del MNSV, denominado pMNSV(Al), a partir del cual se pueden generar transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el virus tras la inoculación mecánica sobre el huésped natural (melón). Este clon infeccioso constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de los genes virales. Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pMNSV(Al), se ha obtenido una colección de mutantes que impiden la expresión de cada una de las ORFs del genoma del virus. Además, las mismas modificaciones se han efectuado sobre un clon quimérico, pMNSV(Al)- cp-GFP, en el que se ha sustituido la ORF que codifica la CP viral por el gen testigo de la proteína de fluorescencia verde (GFP). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las proteínas 29 y 89 estarían implicadas en la replicación del genoma. Por otro lado, la p7A y la p7B participarían en el movimiento célula a célula del virus. Por último, p42 ó CP, además de su papel estructural, es necesaria para la invasión sistémica del virus, siendo capaz / Genovés Martínez, A. (2008). Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2401 / Palancia

[ES] La abscisión es un proceso de separación celular activo, organizado y altamente coordinado que permite el desprendimiento de órganos vegetativos y reproductivos completos, mediante la modificación de la adhesión celular y la desintegración de las paredes celulares en lugares específicos del cuerpo de la planta conocidos como zonas de abscisión. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), la abscisión de órganos florales y hojas caulinares está regulada por la interacción entre el péptido hormonal (IDA), un par de proteínas quinasas de tipo receptor redundantes, (HAE y HSL2), y correceptores de la familia SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El conocimiento sobre la maquinaria molecular que regula la abscisión en especies de plantas de importancia económica de la familia de las solanáceas es en la actualidad escaso. En esta investigación de doctorado, se realizó un análisis funcional de los componentes del módulo de señalización de abscisión IDA-HAE en N. benthamiana. En la primera sección de este trabajo, se estudió el grado de conservación y la filogenia de las familias de genes IDA-like y HAE-like en especies relevantes del género Solanum, Capsicum y Nicotiana. Se analizó la expresión de estos genes en el alopoliploide N. benthamiana, con el fin de identificar miembros implicados en la abscisión y en la respuesta a condiciones de estrés abiótico como la sequía. En la segunda sección, se evaluó el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de NbenIDA1A y NbenIDA1B, dos homeólogos IDA-like de N. benthamiana que se asociaron con la abscisión de la corola en la sección anterior. Además, también se determinó el efecto sobre la abscisión de la corola del silenciamiento de NbenHAE.1. Las relaciones filogenéticas entre los miembros IDA-like de las solanáceas estudiadas, agruparon los dos pares de homeólogos de proteínas NbenIDA1 y NbenIDA2 con los prepropéptidos de Arabidopsis relacionados con la abscisión. El análisis de las regiones promotoras en busca de elementos reguladores reveló que estos dos pares de homeólogos contenían elementos de respuesta tanto hormonales como de respuesta a la sequía, aunque NbenIDA2A carecía de los elementos reguladores hormonales. Los análisis de expresión génica también indican que el par de homeólogos NbenIDA1 se regulan positivamente durante la abscisión de la corola. Los pares NbenIDA1 y NbenIDA2 mostraron una expresión diferencial tisular en condiciones de estrés hídrico, ya que los homeólogos NbenIDA1 se indujeron en hojas estresadas, mientras que los homeólogos NbenIDA2, especialmente NbenIDA2B, se indujeron en raíces estresadas. En las plantas con crecimiento activo no estresadas, los nudos y los entrenudos fueron los tejidos con los niveles de expresión más altos de todos los miembros de la familia IDA-like y sus receptores HAE-like putativos. El silenciamiento basado en VIGS del par de homeólogos NibenIDA1 y NbenHAE.1 suprimió la abscisión de la corola en flores de N. benthamiana, lo que fue causado por un bloqueo en la desintegración de la pared celular en la base de la corola, probablemente debido a la falta de inducción de las enzimas hidrolíticas relacionadas con la abscisión. La sobreexpresión ectópica del homeólogo NbenIDA1A adelantó la senescencia y la abscisión de la corola y afectó negativamente al crecimiento de las plantas de N. benthamiana. Los resultados obtenidos utilizando la aproximación VIGS mostraron que el par de homeólogos NbenIDA1 y el receptor NbenHAE.1, posiblemente actuando como un módulo de señalización similar al descrito en Arabidopsis, regulan la abscisión de la corola en las flores de N. benthamiana. Este es, por tanto, el primer ejemplo en una especie vegetal distinta de Arabidopsis thaliana que indica que el módulo de señalización de abscisión IDA-HAE/HSL2 se conserva en las angiospermas. / [CA] L'abscisió és un procés de separació cel·lular actiu, organitzat i altament coordinat que permet el despreniment d'òrgans vegetatius i reproductius complets, mitjançant la modificació de l'adhesió cel·lular i la desintegració de les parets cel·lulars en llocs específics del cos de la planta coneguts com a zones d'abscisió. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), l'abscisió d'òrgans florals i fulles caulinars està regulada per la interacció entre el pèptid hormonal (IDA), un parell de proteïnes cinases de tipus receptor redundants, (HAE i HSL2), i coreceptors de la família SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El coneixement sobre la maquinària molecular que regula l'abscisió en espècies de plantes d'importància econòmica de la família de les solanàcies és en l'actualitat escàs. En aquesta recerca de doctorat, es va realitzar una anàlisi funcional dels components del mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE en N. benthamiana. A la primera secció d'aquest treball, es va estudiar el grau de conservació i la filogènia de les famílies de gens IDA-like i HAE-like en espècies rellevants de l'gènere Solanum, Capsicum i Nicotiana. Es va analitzar l'expressió d'aquests gens en l'al·lopoliploide N. benthamiana, per tal d'identificar membres implicats en l'abscisió i en la resposta a condicions d'estrès abiòtic, com la sequera. A la segona secció, es va avaluar l'efecte del silenciament i la sobreexpressió de NbenIDA1A i NbenIDA1B, dos homeòlegs IDA-like de N. benthamiana, que es van associar amb l'abscisió de la corol·la en la secció anterior. A més, també es va determinar l'efecte sobre l'abscisió de la corol·la del silenciament de NbenHAE.1. Les relacions filogenètiques entre els membres IDA-like de les solanàcies estudiades, van agrupar els dos parells d'homeòlegs de proteïnes NbenIDA1 i NbenIDA2 amb els prepropèptids d'Arabidopsis relacionats amb l'abscisió. L'anàlisi de les regions promotores a la recerca d'elements reguladors va revelar que aquests dos parells d'homeòlegs contenien elements de resposta tant hormonals com de resposta a la sequera, encara que NbenIDA2A mancava dels elements reguladors hormonals. Les anàlisis d'expressió gènica també indiquen que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 es regulen positivament durant l'abscisió de la corol·la. Els parells NbenIDA1 i NbenIDA2 van mostrar una expressió diferencial tissular en condicions d'estrès hídric, ja que els homeòlegs NbenIDA1 es van induir en fulls estressades, mentre que els homeòlegs NbenIDA2, especialment NbenIDA2B, es van induir en arrels estressades. A les plantes amb creixement actiu no estressades, els nusos i els entrenusos van ser els teixits amb els nivells d'expressió més alts de tots els membres de la família IDA-like i els seus receptors HAE-like putatius. El silenciament basat en VIGS del parell d'homeòlegs NibenIDA1 i NbenHAE.1 va suprimir l'abscisió de la corol·la en flors de N. benthamiana, lo qual va ser causat per un bloqueig en la desintegració de la paret cel·lular a la base de la corol·la, probablement degut a la manca d'inducció dels enzims hidrolítics relacionades amb l'abscisió. La sobreexpressió ectòpica de l'homeòleg NbenIDA1A va avançar la senescència i l'abscisió de la corol·la i va afectar negativament el creixement de les plantes de N. benthamiana. Els resultats obtinguts utilitzant l'aproximació VIGS van mostrar que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 i el receptor NbenHAE.1, possiblement actuant com un mòdul de senyalització similar al descrit en Arabidopsis, regulen l'abscisió de la corol·la en les flors de N. benthamiana. Aquest és, per tant, el primer exemple en una espècie vegetal diferent d'Arabidopsis thaliana que indica que el mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE/HSL2 es conserva en les angiospermes. / [EN] Abscission is an active, organized and highly coordinated cell separation process that enables the detachment of entire vegetative and reproductive organs, through the modification of cell-to-cell adhesion and breakdown of cell walls at specific sites on the plant body, known as abscission zones. In Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), abscission of floral organs and cauline leaves is regulated by the interaction of the hormonal peptide (IDA), a pair of redundant receptorlike protein kinases, (HAE and HSL2), and SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE co-receptors. Knowledge about the molecular machinery regulating abscission in economically important plant species of the Solanaceae family is currently scarce. In this PhD research, a functional analysis of the components of the abscission signaling module IDA-HAE in N. benthamiana was carried out. In the first section of this work, the degree of conservation and the phylogeny of the IDA-like and HAE-like gene families in relevant species of the genus Solanum, Capsicumand Nicotiana were determined. The expression of these genes in the allopolyploid N. benthamiana was analyzed, in order to identify members involved in abscission and in the response to abiotic stress conditions, such as drought. In the second section, the effect of the silencing and overexpression of NbenIDA1A and NbenIDA1B, two N. benthamiana IDA-like homeologs, which were associated with corolla abscission in the previous section, was evaluated. Furthermore, the effect on corolla abscission of the silencing of NbenHAE.1 was also determined. The phylogenetic relationships among the IDA-like members of the Solanaceae studied, grouped the two pairs of NbenIDA1 and NbenIDA2 protein homeologs with the Arabidopsis prepropeptides related to abscission. Analysis of promoter regions searching for regulatory elements showed that these two pairs of homeologs contained both hormonal and drought response elements, although NbenIDA2A lacked the hormonal regulatory elements. Gene expression analyses also indicate that the pair of NbenIDA1 homeologs are upregulated during corolla abscission. NbenIDA1 and NbenIDA2 pairs showed tissue differential expression under water stress conditions, since NbenIDA1 homeologs were highly expressed in stressed leaves, while NbenIDA2 homeologs, especially NbenIDA2B, were highly expressed in stressed roots. In non-stressed active growing plants, nodes and internodes were the tissues with the highest expression levels of all members of the IDA-like family and their putative HAE-like receptors. VIGS-based silencing of the pair of NibenIDA1 homeologs and NbenHAE.1 suppressed corolla abscission in flowers of N. benthamiana, which was supported by a blockage in cell wall disassembly at the corolla base, probably due to the lack of upregulation of abscission-related hydrolytic enzymes. Ectopic over-expression of the homeolog NbenIDA1A advanced the timing of both corolla senescence and abscission and negatively affected the growth of N. benthamiana plants. The results obtained using the VIGS approach showed that the pair of NbenIDA1 homeologs and the NbenHAE.1 receptor, possibly acting as a signaling module similar to that described in Arabidopsis, regulate corolla abscission in N. benthamiana flowers. This is therefore the first example in a plant species other than Arabidopsis thaliana that indicates that the IDA-HAE/HSL2 abscission signaling module is conserved in angiosperms. / Ventimilla Llora, D. (2021). The abscission regulatory module INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION (IDA) / HAESA (HAE)-like receptor kinases in Solanaceae species: Functional analysis in Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167777 / TESIS

[ES] Hoy en día, los virus de las plantas no sólo se perciben como patógenos, sino que también son capaces de establecer una asociación beneficiosa con sus huéspedes y colaborar desde un punto de vista biotecnológico. El virus, como vector, puede ser una herramienta para introducir genes heterólogos en la planta, que se procesarán junto con la información viral y producirán valiosas proteínas recombinantes, metabolitos o nanopartículas. Los vectores virales también son capaces de interferir con la maquinaria de silenciamiento de la planta dando prioridad a los genes virales. Los potyvirus son virus de ARN de plantas, que codifican principalmente una poliproteína con unas diez proteínas maduras con diferentes funciones, de las cuales las responsables de la supresión del silenciamiento son la proteína componente auxiliar (HC-Pro) y la proteína viral ligada al genoma (VPg). En la primera parte de este trabajo, utilizamos un aislado suave del virus del mosaico de la sandía (WMV; género Potyvirus, familia Potyviridae) para construir un vector para el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) en plantas de melón. Utilizando este virus como vector, expresamos un fragmento de ARNm de la Fitoeno desaturasa (PDS) de melón en las modalidades sentido, antisentido y horquilla para investigar el efecto de la construcción viral en el silenciamiento génico. Los resultados mostraron una expresión estable del fragmento de secuencia insertado en la planta en ambas orientaciones, sentido y antisentido, mientras que en la modalidad de horquilla el inserto se perdió pronto. Sin embargo, las tres construcciones indujeron el silenciamiento del gen PDS endógeno. Se confirmó la utilidad del WMV para el análisis genético inverso en melón expresando un fragmento de la subunidad I de la quelatasa de magnesio (CHLI). En general, nuestros resultados apoyaron que el vector WMV es útil para aplicar la tecnología VIGS en melón y, posiblemente, en otras cucurbitáceas. En la segunda parte de este trabajo, con el objetivo de fortificar las frutas comestibles con metabolitos promotores de la salud, se utilizó un vector de ARN viral derivado del virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV; género Potyvirus, familia Potyviridae) para expresar una fitoeno sintasa bacteriana (crtB) en los frutos del calabacín (Cucurbita pepo L.). Esta enzima cataliza el primer paso de la biosíntesis de carotenoides. La expresión de la crtB mediada por el ZYMV dio lugar a la sobreacumulación de una serie de metabolitos de carotenoides y tocoferoles, concretamente α- y β-caroteno (provitamina A), luteína y fitoeno, así como α- y γ-tocoferol (vitamina E), tanto en la piel como en la pulpa del calabacín. Este resultado ilustra cómo se pueden enriquecer metabólicamente las frutas comestibles utilizando vectores virales sin modificar el genoma de la planta. / [CA] A dia de hui, els virus de les plantes no sols es perceben com a patògens, sinó que també són capaços d'establir una associació beneficiosa amb els seus hostes i col·laborar des d'un punt de vista biotecnològic. El virus, com a vector, pot ser una eina per a introduir gens heteròlegs en la planta, que es processaran juntament amb la informació viral i produiran valuoses proteïnes recombinants, metabòlits o nanopartícules. Els vectors virals també són capaços d'interferir amb la maquinària de silenciament de la planta donant prioritat als gens virals. Els potyvirus són virus d'ARN de plantes, que codifiquen principalment una poliproteïna d'unes deu proteïnes madures amb diferents funcions, de les quals les responsables de la supressió del silenciament són la proteïna component auxiliar (HC-Pro) i la proteïna viral lligada al genoma (VPg). En la primera part d'aquest treball, utilitzem un aïllat suau del virus del mosaic del meló d'Alger (WMV; gènere Potyvirus, família Potyviridae) per a construir un vector per al silenciament gènic induït per virus (VIGS) en plantes de meló. Utilitzant aquest virus com a vector, expressem un fragment d'ARNm de la Fitoeno desaturasa (PDS) del meló en les modalitats de sentit, antisentit i forqueta per a investigar l'efecte de la construcció viral en el silenciament gènic. Els resultats van mostrar una expressió estable del fragment de seqüència inserit en la planta en totes dues orientacions, sentit i antisentit, mentre que en la modalitat de forqueta l'inserit es va perdre prompte. No obstant això, les tres construccions van induir el silenciament del gen PDS endogen. Es va confirmar la utilitat de la WMV per a l'anàlisi genètica inversa en meló expressant un fragment de la Subunitat I de la quelatasa de magnesi (CHLI). En general, els nostres resultats van secundar que el vector WMV és útil per a aplicar la tecnologia VIGS en meló i, possiblement, en altres cucurbitáceas. En la segona part d'aquest treball, amb l'objectiu de fortificar les fruites comestibles amb metabòlits promotors de la salut, es va utilitzar un vector d'ARN viral derivat del virus del mosaic groc de la carabasseta (ZYMV; gènere Potyvirus, família Potyviridae) per a expressar una fitoeno sintasa bacteriana (crtB) en els fruits de la carabasseta (Cucurbita pepo L.). Aquest enzim catalitza el primer pas compromés de la biosíntesi de carotenoides. L'expressió de la crtB mediada pel ZYMV va donar lloc a la sobreacumulación d'una sèrie de metabòlits de carotenoides i tocoferoles, concretament α- i β caroté (provitamina A), luteïna i fitoeno, així com α- i γ--tocoferol (vitamina E), tant en la pell com en la polpa de la carabasseta. Aquest resultat il·lustra com es poden enriquir metabólicamente les fruites comestibles utilitzant vectors virals sense modificar el genoma de la planta. / [EN] Nowadays, plant viruses are not only perceived as pathogens, but also able to build a beneficial partnership with their hosts and co-work together from a biotechnological view. The virus, as a vector, can be a tool to introduce heterologous genes into the plant, which will process together with the viral information and produce valuable recombinant proteins, metabolites or nanoparticles. Viral vectors are also able to interfere with plant silencing machinery giving priority to the viral genes. Potyviruses are plant RNA viruses, mainly encoding a polyprotein of about ten mature proteins with different functions, from which the responsible of silencing suppression are helper-component proteinase (HC-Pro) and the viral protein genome-linked (VPg). In the first part of this work, we used a mild isolate of Watermelon mosaic virus (WMV; genus Potyvirus, family Potyviridae) to build a vector for virus induced gene silencing (VIGS) in melon plants. Using this virus as a vector, we expressed a fragment of melon Phytoene desaturase (PDS) mRNA in sense, antisense, and hairpin modalities to investigate the effect of the viral construct on gene silencing. The results showed a stable expression of the inserted sequence fragment in the plant in both sense and antisense orientations, whereas in the hairpin modality the insert was soon lost. Yet, all three constructs induced silencing of the endogenous PDS gene. The usefulness of the WMV for reverse genetic analysis in melon was confirmed expressing a fragment of Magnesium chelatase subunit I (CHLI). Overall, our results supported that the WMV vector is useful to apply the VIGS technology in melon and, possibly, other cucurbits. In the second part of this work, with the aim to fortify edible fruits with health promoting metabolites, a viral RNA vector derived from Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; genus Potyvirus, family Potyviridae) was used to express a bacterial phytoene synthase (crtB) in zucchini (Cucurbita pepo L.) fruits. This enzyme catalyzes the first committed step of carotenoid biosynthesis. The crtB expression mediated by ZYMV resulted in the overaccumulation of a range of carotenoids and tocopherols metabolites, namely α- and ß-carotene (pro-vitamin A), lutein and phytoene, as well as α- and γ-tocopherol (vitamin E), in both zucchini rind and flesh. This result illustrates how edible fruits can be metabolically fortified using viral vectors without plant genome modification. / This research was supported by grants BIO2017-83184-R, AGL2017-85563-C2-1-R and RTA2017-00061-C03-03 from Ministerio de Ciencia e Innovación (Spain), through Agencia Estatal de Investigación (cofinanced European Regional Development Fund). / Houhou, F. (2021). Biotechnological Application of Potyvirus-Based Vectors in Cucurbit Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/177644 / TESIS

El ácido salicílico (SA) juega un papel fundamental en la respuesta defensiva de las plantas. Este compuesto se acumula en las mismas como consecuencia de infecciones patogénicas de tipo incompatible, y su aplicación exógena induce resistencia. Asimismo, plantas transgénicas incapaces de acumularlo presentan una mayor susceptibilidad a patógenos de distinta naturaleza. Por otra parte, el ácido gentísico (GA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) se acumula en plantas en infecciones compatibles no necrotizantes. La aplicación exógena de GA induce un conjunto de proteínas de defensa PR (Pathogenesis related) distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario en la señalización frente a patógenos en plantas. Ambos compuestos se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una o más moléculas de azúcar. Estas reacciones de conjugación son catalizadas por proteínas denominadas glicosiltransferasas. En plantas de tomate el SA se acumula como SA 2-O-ß-glucósido, unido a una molécula de glucosa, mientras el GA lo hace en forma de GA 5-O-ß-xilósido, unido a xilosa. GAGT (Gentisic Acid Glycosyl Transferase) ha sido descrita como la proteína que conjuga GA en tomate. Dado que la glicosilación de metabolitos es una forma rápida de inactivarlos, la existencia de esta proteína con actividad conjugadora de GA refuerza la idea del ácido gentísico (GA) como molécula señal complementaria al SA en la interacción planta-patógeno. Por otra parte, la proteína Twi1 (Tomato wound inducible), descrita en tomate como una posible glicosiltransferasa debido a sus características comunes con este grupo de proteínas, presenta inducción por SA y otros compuestos de naturaleza fenólica, además de herida e interacciones de tipo incompatible. Trabajos en los que se ha llevado a cabo la sobreexpresión o el silenciamiento de una GT han puesto de manifiesto cómo ello conlleva la aparición de resistencia o susceptibilidad frente a una infección patogénica. Por tanto, las GTs tienen un papel fundamental en la respuesta defensiva de la planta, modulando los niveles de moléculas que intervienen en dicha respuesta. Por otra parte, se han realizado estudios dirigidos a elucidar la implicación de compuestos del metabolismo secundario en la interacción de plantas de tomate con distintos patógenos. Ello ha permitido detectar cambios concretos de los niveles de un número determinado de metabolitos a lo largo de las infecciones, como son cuatro amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) que se acumulan en plantas de tomate infectadas con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Las HCAAs son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, de bajo peso molecular y que se caracterizan por la presencia de nitrógeno en su estructura. En su ruta de biosíntesis participan diversos enzimas tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), la tirosina descarboxilasa (TYDC) o la tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). La acumulación en tomate de las cuatro amidas como consecuencia de la infección bacteriana va acompañada de la inducción del isoenzima THT1-3. La obtención de plantas transgénicas que sobreexpresen o silencien las proteínas GAGT, Twi1 y THT1-3 permitirá llevar a cabo ensayos de resistencia frente a infecciones patogénicas que contribuyan al conocimiento del sistema defensivo de las plantas, tanto en sus aspectos de señalización como en los referidos a componentes de la respuesta final de la planta. Al mismo tiempo, esta estrategia puede constituir, en sí misma, un medio de obtención de plantas más resistentes frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza. / Campos Beneyto, L. (2014). Metabolitos secundarios de naturaleza fenólica: papel en la respuesta defensiva de plantas de tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/44236 / TESIS

Las pérdidas causadas por podredumbres durante la post-cosecha de frutos cítricos suelen suponer entre un 5 y un 10 % de la producción, siendo Penicillium digitatum el principal hongo patógeno, responsable de hasta el 80 % de las pérdidas causadas por podredumbres en frutos almacenados a temperatura ambiente. A pesar de la importancia económica de este patógeno nuestro conocimiento sobre los mecanismos de patogenicidad/ virulencia son muy escasos, en contraste con el avance experimentado en los últimos años en el conocimiento de las respuestas de defensa del fruto a la infección por este patógeno. Así, en el grupo de Fisiología y Biotecnología Postcosecha del IATA se está trabajando en la caracterización a nivel bioquímico y molecular de las respuestas de los frutos cítricos frente a la infección por P. digitatum y en el proceso de inducción de resistencia en frutos cítricos frente a la infección. Por este motivo en esta Tesis se han desarrollado un conjunto de herramientas esenciales para poder abordar la caracterización funcional de genes involucrados en virulencia/patogenicidad: transformación de P. digitatum mediada por Agrobacterium tumefaciens, utilización de la proteína verde fluorescente como marcadora, metodología para la obtención de mutantes de deleción de genes específicos, incluyendo mutantes nulos ¿ku80, vectores para silenciamiento génico mediante RNAi y la construcción de una genoteca de DNA genómico de P. digitatum. Se ha secuenciado y analizado el factor de transcripción PacC, que controla la expresión de un grupo de genes regulados por el pH ambiental. En P. digitatum se produce una acidificación del medio para adaptarlo al pH óptimo de su arsenal de enzimas. Se han obtenido mutantes de expresión constitutiva de PacC que presentan una disminución la capacidad infectiva en un 20 %. Mediante el empleo de técnicas de alto rendimiento se ha construido una genoteca substractiva de cDNA para obtener fragmentos de genes de P. digitatum que se inducen durante la infección de frutos de naranja y se ha analizado la expresión génica de los mismos y se ha elaborado una macromatriz conteniendo más de 1330 clones de la genoteca. El grupo de genes con mayor representación en la genoteca y con altos valores de inducción, corresponde a genes que codifican cinco proteasas diferentes. Además, en la genoteca substractiva también hay una alta representación de genes que codifican enzimas de degradación de la pared celular, y otras proteínas implicadas en glucólisis, respuesta a estrés o detoxificación. La ya demostrada importancia de las enzimas de degradación de la pared celular en la virulencia de hongos fitopatógenos, su abundancia y niveles de inducción en la macromatriz nos llevaron a estudiar más en profundidad algunos de estos genes (dos poligalacturonasas y una pectin liasa). Para comprobar su implicación en el proceso de infección se secuenciaron y se obtuvieron mutantes de P. digitatum en los que se eliminó el gen. La disminución de la virulencia de estos mutantes sobre frutos de naranja con respecto a la cepa silvestre fue de aproximadamente un 25 %. Del conjunto de genes relacionados con el metabolismo redox se seleccionó por su patrón de expresión el gen ris1, que codifica una naftaleno dioxigenasa posiblemente implicada en la detoxificación de compuestos aromáticos. A diferencia de los mutantes nulos en los genes de las poligalacturonasas o de la pectin liasa, los mutantes nulos ¿ris1 no presentaron ninguna alteración en su capacidad patogénica. / López Pérez, M. (2013). Estudio de los factores de patogenicidad/virulencia de Penicillium digitatum sobre frutos cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34176