[ES] Las plantas están emergiendo como una alternativa atractiva a los sistemas convencionales de producción heteróloga, como bacterias, cultivos celulares de mamíferos, levaduras u hongos, para la síntesis de productos de alto valor, como metabolitos secundarios y proteínas. La demanda de estos productos a menudo se ve limitada por la capacidad de producción y los costos asociados. Sin embargo, utilizar las plantas como plataformas de producción ofrece ventajas en términos de accesibilidad económica, sostenibilidad, escalabilidad y la ausencia de patógenos humanos y de animales, lo que las convierte en una opción cada vez más atractiva. A pesar de las limitaciones en la capacidad de carga, la expresión génica transitoria utilizando vectores virales proporciona un método eficiente y reproducible para la producción de proteínas recombinantes en plantas, a diferencia de la transformación estable, que requiere más mano de obra y tiempo. Los vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (TMV), particularmente aquellos en los que el gen de la proteína de la cubierta viral (CP) se reemplaza principalmente por el gen de interés, son clásicos en la biotecnología vegetal y se utilizan con frecuencia para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. En este trabajo, nuestro primer objetivo fue optimizar un vector de TMV para mejorar la producción. La fusión traduccional del extremo amino-terminal de la CP del TMV con la proteína recombinante de interés mostró un aumento en la acumulación de la proteína verde fluorescente, interferón alfa-2a y un nanobody contra la proteína Spike del SARS-CoV-2 en hojas de Nicotiana benthamiana. La inserción de un sitio de clivaje específico, basado en las proteasas de inclusión nuclear (NIaPro) de dos potyvirus, junto con la expresión de las proteasas correspondientes, además de la producción de la proteína recombinante madura, aumentó aún más la acumulación de las proteínas recombinantes mencionadas anteriormente. En segundo lugar, nuestro objetivo fue establecer estrategias para producir proteínas recombinantes de interés industrial y farmacéutico en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. Logramos producir grandes cantidades de una xilanasa termofílica, activa en condiciones extremas de temperatura y pH alcalino, en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La enzima que se acumuló rápidamente en los tejidos de la planta se dirigió al apoplasto, lo que facilitó enormemente la purificación y evitó cualquier efecto adverso en el crecimiento de la planta. Se demostró que esta enzima producida en planta es útil para la producción de xilooligosacáridos probióticos. También produjimos grandes cantidades de una glucosa oxidasa (GOX) modificada en hojas de N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La GOX producida en planta, que también se purificó fácilmente a partir de fluidos apoplásticos, exhibió potentes propiedades antimicrobianas contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. / [CA] Les plantes están emergint com una alternativa atractiva als sistemes convencionals de producció heteròloga, com ara bacteries, cultius cel·lulars de mamífers, llevats o fongs, per a la síntesi de productes d'alt valor, com son metabòlits secundaris i proteïnes d'interés industrial i farmacéutic. La demanda d'aquests productes sovint es veu limitada per la capacitat de producció i els costos associats. No obstant això, utilitzar les plantes com a plataformes de producció ofereix avantatges en termes d'accessibilitat econòmica, sostenibilitat, escalabilitat i l'absència de patògens humans i animals, la qual cosa les converteix en una opció cada vegada més atractiva. Malgrat les limitacions en la capacitat de càrrega, l'expressió gènica transitoria mitjançant vectors virals proporciona un mètode eficient i reproducible per a la producció de proteïnes recombinants en plantes, a diferència de la transformació estable, que requereix més mà d'obra i temps. Els vectors derivats del virus del mosaic del tabac (TMV), particularment aquells en els quals el gen de la proteïna de la coberta viral (CP) és principalment reemplaçat pel gen d'interès, són clàssics en la biotecnologia vegetal i s'utilitzen sovint per a la producció a gran escala de proteïnes recombinants. En aquest treball, el nostre primer objectiu va ser optimitzar un vector de TMV per a millorar la producció. La fusió traduccional de l'extrem amino-terminal de la CP del TMV amb la proteïna recombinant d'interès va mostrar un augment en l'acumulació de la proteïna verda fluorescent, interferó alfa-2a i un nanobody contra la proteïna Spike del SARS-CoV-2 en fulles de Nicotiana benthamiana. La inserció d'un lloc de tall específic, basat en les proteases d'inclusió nuclear (NIaPro) de dos potivirus, juntament amb l'expressió de les proteases corresponents, a més de la producció de la proteïna recombinant madura, va augmentar encara més l'acumulació de les proteïnes recombinants esmentades anteriorment. En segon lloc, el nostre objectiu va ser establir estratègies per a produir proteïnes recombinants d'interés industrial i farmacèutic en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. Vam aconseguir produir grans quantitats d'una xilanasa termofílica, activa en condicions extremes de temperatura i pH alcalí, en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. El enzim que es va acumular ràpidament en els teixits de la planta es va dirigir a l'apoplast, la qual cosa va facilitar enormement la purificació i va evitar qualsevol efecte advers en el creixement de la planta. Es va demostrar que aquesta enzima produïda en planta és útil per a la producció de xilooligosacàrids probiòtics. També vam produir grans quantitats d'una glucosa oxidasa (GOX) modificada en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. La GOX produïda en planta, que també es va purificar fàcilment a partir de fluids apoplàstics, va exhibir potents propietats antimicrobianes contra Staphylococcus aureus i Escherichia coli. / [EN] Plants are emerging as an attractive alternative to conventional heterologous production systems, including bacteria, mammalian cell cultures, yeast, or fungi, for the synthesis of high-value products, such as secondary metabolites and proteins. The demand for these products is often limited by production capacity and associated costs. However, using plants as production platforms offers advantages in terms of affordability, sustainability, scalability, and the absence of human and livestock pathogens, making them an increasingly appealing choice. Despite limitations in cargo capacity, transient gene expression using viral vectors provides an efficient and reproducible method for producing recombinant proteins in plants, unlike stable transformation, which is more labor- intensive and time-consuming. Vectors derived from tobacco mosaic virus (TMV), particularly those in which the viral coat protein (CP) gene is mostly replaced with the gene of interest, are classic in plant biotechnology and frequently use for large-scale production of recombinant proteins. In this work, we first aimed to optimize a TMV vector to improve production. Translational fusion of the amino- terminal end of TMV CP to the recombinant protein of interest led to increased accumulation of the green fluorescent protein, interferon alfa-2a and a nanobody against the Spike protein of SARS-CoV-2 in Nicotiana benthamiana leaves. Insertion of a specific cleavage site, based on the nuclear inclusion a proteases (NIaPro) form two potyviruses, along expression of the cognate proteases led to, in addition to production of the mature recombinant protein, a further increase in the accumulation of the aforementioned recombinant proteins. Second, we aimed to set up strategies to produce recombinant proteins of industrial and pharmaceutical interest in N. benthamiana using a TMV vector. We successfully produced large amounts of a thermophilic xylanase, active under extreme temperature and alkaline pH conditions, in N.benthamiana using a TMV vector. The enzyme that accumulated rapidly in plant tissues was targeted the apoplast, which enormously facilitated purification, and avoided any adverse effect on plant growth. This plant-made enzyme was shown to be useful for the production of probiotic xylooligosaccharides. We also produced large amounts of an engineered glucose oxidase (GOX) in N. benthamiana leaves using a TMV vector. The plant-made GOX that was also easily purified from apoplastic fluids exhibited potent antimicrobial properties against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. / This work was supported Generalitat Valenciana, grant INNEST/2021/7 from Agència Valenciana de la Innovació, and by grant PID2020-114691RB-I00 from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación, through the Agencia Estatal de Investigación (co-financed European Regional Development Fund), and by the Bio Based Industries Joint Undertaking, under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program (Project WOODZYMES, Grant Agreement H2020-BBI- JU-792070). M.N.-S. is the recipient of a predoctoral contract from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (PRE2018-084771). / Nicolau Sanus, M. (2023). Production of Recombinant Proteins with Pharmaceutical and Industrial Applications in Plants Using a Tobacco Mosaic Virus-Derived Vector [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/200381

[ES] Hoy en día, los virus de las plantas no sólo se perciben como patógenos, sino que también son capaces de establecer una asociación beneficiosa con sus huéspedes y colaborar desde un punto de vista biotecnológico. El virus, como vector, puede ser una herramienta para introducir genes heterólogos en la planta, que se procesarán junto con la información viral y producirán valiosas proteínas recombinantes, metabolitos o nanopartículas. Los vectores virales también son capaces de interferir con la maquinaria de silenciamiento de la planta dando prioridad a los genes virales. Los potyvirus son virus de ARN de plantas, que codifican principalmente una poliproteína con unas diez proteínas maduras con diferentes funciones, de las cuales las responsables de la supresión del silenciamiento son la proteína componente auxiliar (HC-Pro) y la proteína viral ligada al genoma (VPg). En la primera parte de este trabajo, utilizamos un aislado suave del virus del mosaico de la sandía (WMV; género Potyvirus, familia Potyviridae) para construir un vector para el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) en plantas de melón. Utilizando este virus como vector, expresamos un fragmento de ARNm de la Fitoeno desaturasa (PDS) de melón en las modalidades sentido, antisentido y horquilla para investigar el efecto de la construcción viral en el silenciamiento génico. Los resultados mostraron una expresión estable del fragmento de secuencia insertado en la planta en ambas orientaciones, sentido y antisentido, mientras que en la modalidad de horquilla el inserto se perdió pronto. Sin embargo, las tres construcciones indujeron el silenciamiento del gen PDS endógeno. Se confirmó la utilidad del WMV para el análisis genético inverso en melón expresando un fragmento de la subunidad I de la quelatasa de magnesio (CHLI). En general, nuestros resultados apoyaron que el vector WMV es útil para aplicar la tecnología VIGS en melón y, posiblemente, en otras cucurbitáceas. En la segunda parte de este trabajo, con el objetivo de fortificar las frutas comestibles con metabolitos promotores de la salud, se utilizó un vector de ARN viral derivado del virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV; género Potyvirus, familia Potyviridae) para expresar una fitoeno sintasa bacteriana (crtB) en los frutos del calabacín (Cucurbita pepo L.). Esta enzima cataliza el primer paso de la biosíntesis de carotenoides. La expresión de la crtB mediada por el ZYMV dio lugar a la sobreacumulación de una serie de metabolitos de carotenoides y tocoferoles, concretamente α- y β-caroteno (provitamina A), luteína y fitoeno, así como α- y γ-tocoferol (vitamina E), tanto en la piel como en la pulpa del calabacín. Este resultado ilustra cómo se pueden enriquecer metabólicamente las frutas comestibles utilizando vectores virales sin modificar el genoma de la planta. / [CA] A dia de hui, els virus de les plantes no sols es perceben com a patògens, sinó que també són capaços d'establir una associació beneficiosa amb els seus hostes i col·laborar des d'un punt de vista biotecnològic. El virus, com a vector, pot ser una eina per a introduir gens heteròlegs en la planta, que es processaran juntament amb la informació viral i produiran valuoses proteïnes recombinants, metabòlits o nanopartícules. Els vectors virals també són capaços d'interferir amb la maquinària de silenciament de la planta donant prioritat als gens virals. Els potyvirus són virus d'ARN de plantes, que codifiquen principalment una poliproteïna d'unes deu proteïnes madures amb diferents funcions, de les quals les responsables de la supressió del silenciament són la proteïna component auxiliar (HC-Pro) i la proteïna viral lligada al genoma (VPg). En la primera part d'aquest treball, utilitzem un aïllat suau del virus del mosaic del meló d'Alger (WMV; gènere Potyvirus, família Potyviridae) per a construir un vector per al silenciament gènic induït per virus (VIGS) en plantes de meló. Utilitzant aquest virus com a vector, expressem un fragment d'ARNm de la Fitoeno desaturasa (PDS) del meló en les modalitats de sentit, antisentit i forqueta per a investigar l'efecte de la construcció viral en el silenciament gènic. Els resultats van mostrar una expressió estable del fragment de seqüència inserit en la planta en totes dues orientacions, sentit i antisentit, mentre que en la modalitat de forqueta l'inserit es va perdre prompte. No obstant això, les tres construccions van induir el silenciament del gen PDS endogen. Es va confirmar la utilitat de la WMV per a l'anàlisi genètica inversa en meló expressant un fragment de la Subunitat I de la quelatasa de magnesi (CHLI). En general, els nostres resultats van secundar que el vector WMV és útil per a aplicar la tecnologia VIGS en meló i, possiblement, en altres cucurbitáceas. En la segona part d'aquest treball, amb l'objectiu de fortificar les fruites comestibles amb metabòlits promotors de la salut, es va utilitzar un vector d'ARN viral derivat del virus del mosaic groc de la carabasseta (ZYMV; gènere Potyvirus, família Potyviridae) per a expressar una fitoeno sintasa bacteriana (crtB) en els fruits de la carabasseta (Cucurbita pepo L.). Aquest enzim catalitza el primer pas compromés de la biosíntesi de carotenoides. L'expressió de la crtB mediada pel ZYMV va donar lloc a la sobreacumulación d'una sèrie de metabòlits de carotenoides i tocoferoles, concretament α- i β caroté (provitamina A), luteïna i fitoeno, així com α- i γ--tocoferol (vitamina E), tant en la pell com en la polpa de la carabasseta. Aquest resultat il·lustra com es poden enriquir metabólicamente les fruites comestibles utilitzant vectors virals sense modificar el genoma de la planta. / [EN] Nowadays, plant viruses are not only perceived as pathogens, but also able to build a beneficial partnership with their hosts and co-work together from a biotechnological view. The virus, as a vector, can be a tool to introduce heterologous genes into the plant, which will process together with the viral information and produce valuable recombinant proteins, metabolites or nanoparticles. Viral vectors are also able to interfere with plant silencing machinery giving priority to the viral genes. Potyviruses are plant RNA viruses, mainly encoding a polyprotein of about ten mature proteins with different functions, from which the responsible of silencing suppression are helper-component proteinase (HC-Pro) and the viral protein genome-linked (VPg). In the first part of this work, we used a mild isolate of Watermelon mosaic virus (WMV; genus Potyvirus, family Potyviridae) to build a vector for virus induced gene silencing (VIGS) in melon plants. Using this virus as a vector, we expressed a fragment of melon Phytoene desaturase (PDS) mRNA in sense, antisense, and hairpin modalities to investigate the effect of the viral construct on gene silencing. The results showed a stable expression of the inserted sequence fragment in the plant in both sense and antisense orientations, whereas in the hairpin modality the insert was soon lost. Yet, all three constructs induced silencing of the endogenous PDS gene. The usefulness of the WMV for reverse genetic analysis in melon was confirmed expressing a fragment of Magnesium chelatase subunit I (CHLI). Overall, our results supported that the WMV vector is useful to apply the VIGS technology in melon and, possibly, other cucurbits. In the second part of this work, with the aim to fortify edible fruits with health promoting metabolites, a viral RNA vector derived from Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; genus Potyvirus, family Potyviridae) was used to express a bacterial phytoene synthase (crtB) in zucchini (Cucurbita pepo L.) fruits. This enzyme catalyzes the first committed step of carotenoid biosynthesis. The crtB expression mediated by ZYMV resulted in the overaccumulation of a range of carotenoids and tocopherols metabolites, namely α- and ß-carotene (pro-vitamin A), lutein and phytoene, as well as α- and γ-tocopherol (vitamin E), in both zucchini rind and flesh. This result illustrates how edible fruits can be metabolically fortified using viral vectors without plant genome modification. / This research was supported by grants BIO2017-83184-R, AGL2017-85563-C2-1-R and RTA2017-00061-C03-03 from Ministerio de Ciencia e Innovación (Spain), through Agencia Estatal de Investigación (cofinanced European Regional Development Fund). / Houhou, F. (2021). Biotechnological Application of Potyvirus-Based Vectors in Cucurbit Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/177644 / TESIS