El objetivo principal de esta tesis consiste en la obtención de anticuerpos recombinantes frente a los fungicidas azólicos tetraconazol, hexaconazol e imazalil, y su aplicación en la determinación de residuos de estos fungicidas en muestras agroalimentarias. Para ello, en primer lugar, se han aplicado técnicas de biología molecular para la obtención de los fragmentos recombinantes scFv (single chain fragment variable) a partir del material genético de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente a los fungicidas tetraconazol, hexaconazol e imazalil. Posteriormente, dichos fragmentos se han expresado en sistemas bacterianos empleando vectores de expresión plasmídicos. Por otro lado, se ha optimizado un sistema de cribado y selección de colonias bacterianas productoras de fragmentos de anticuerpos recombinantes capaces de reconocer a los plaguicidas en estudio. Este sistema está basado en ELISAs simultáneos, competitivos y no competitivos, de la fracción soluble del anticuerpo recombinante. Finalmente, en el caso de los anticuerpos frente a hexaconazol e imazalil, se ha aplicado un protocolo de enriquecimiento cíclico denominado panning, basado en la tecnología de presentación de moléculas proteicas en la superficie de fagos (phage display). De este modo, se han obtenido anticuerpos recombinantes a partir de cada hibridoma productor de anticuerpos monoclonales. Cada anticuerpo recombinante se ha expresado tanto en su forma de proteína libre (scFv) como en forma de proteína de fusión (scFv-pIII). De igual modo, se han empleado técnicas de biología molecular para la generación de bibliotecas de fragmentos recombinantes scFv a partir del material genético de linfocitos de ratones inmunizados frente a cada uno de los tres fungicidas. En este caso, se han optimizado las condiciones tanto de la etapa de construcción de bibliotecas como del posterior proceso de enriquecimiento por panning. / Plana Andani, E. (2010). Selección y caracterización de anticuerpos recombinantes para fungicidas. Aplicación al desarrollo de técnicas inmunoanalíticas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8477 / Palancia

El género Fabavirus pertenece a la familia Comoviridae e incluye tres especies: Broad bean wilt virus 1 (BBWV-1), BBWV-2 y Lamium mild mosaic virus (LMMV), aunque recientemente se ha propuesto una nueva especie, Gentian mosaic virus (GeMV). Estos virus afectan a un gran número de especies hortícolas y ornamentales y son transmitidos de manera no persistente por unas veinte especies de pulgones. El genoma está formado por dos cadenas de RNA monocatenario de polaridad positiva que se encapsidan separadamente con dos proteínas de cápsida formando viriones isométricos. BBWV-1 y BBWV-2 están distribuidos por todo el mundo. En España se ha encontrado BBWV-1 en cultivos de pimiento de Aragón, Cataluña, Castilla León, C. Valenciana, Murcia, Navarra, País Vasco y La Rioja. Los fabavirus son un grupo viral muy poco estudiado. Al comienzo de esta tesis, sólo se había determinado la secuencia nucleotídica del genoma completo de seis aislados de BBWV-2 procedentes de Extremo Oriente, mientras que no se disponía de ninguna secuencia completa de BBWV-1. Para desarrollar métodos rápidos, sensibles y específicos de detección, diferenciar aislados con secuencias divergentes y evaluar en su caso la efectividad de distintas estrategias de control se consideró necesario obtener la secuencia completa de al menos un aislado de BBWV-1 y secuencias parciales de aislados de distintos países. En esta tesis, se determinó la secuencia nucleotídica completa del genoma del aislado español 1S1 de BBWV-1 y se dedujo su organización genómica. El genoma está formado por dos moléculas de RNA monocatenario de polaridad positiva de 5814 y 3431 nt, respectivamente, con la organización genómica descrita para otros miembros de la familia Comoviridae. Al comparar esta secuencia con la única secuencia disponible de BBWV-1 correspondiente al aislado 1U2 de EEUU (publicado durante el desarrollo de esta tesis), se comprobó que los genomas de ambos aislados eran muy divergentes. / Ferrer Gual, RM. (2008). Caracterización molecular y desarrollo de métodos de diagnóstico del género Fabavirus Evaluación de BTH como método de control [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8313 / Palancia

Con el fin de investigar los efectos en la homeostasis de iones de un aumento en la concentración celular de peróxido de hidrógeno, se aisló un mutante de inserción de T-DNA en el gen CATALASA 2 de Arabidopsis. El mutante cat2-1 presenta una reducción del 80% de la catalasa de hoja en comparación con genotipos silvestres y acumula más peróxido de hidrógeno en condiciones sin estrés. Además de presentar un tamaño reducido, un color verde más pálido y gran reducción en el número de raíces secundarias, el mutante cat2-1 presenta una marcada sensibilidad a peróxido de hidrógeno, cloruro sódico, norespermidina, alta intensidad lumínica y estrés por frío. Por otra parte, el mutante cat2-1 presenta una tolerancia parcial cuando es crecido en medios con cloruro de litio en comparación con el genotipo silvestre. Este novedoso fenotipo no puede ser explicado por cambios en el transporte de este catión. Realmente, la toma de litio y de otros cationes tóxicos como sodio y norespermidina es mayor en el mutante cat2-1, mientras que los niveles de potasio de la planta son inferiores. La tolerancia a litio de este mutante parece ser resultado de una insensibilidad a la inhibitoria respuesta de etileno producida por el catión y a su reducida capacidad de producción de etileno. De acuerdo con esto, la inducción por etileno de genes de respuesta tales como PR4 y EBP/ERF72 es menor en el mutante cat2-1. Mutantes insensibles a etileno como etr1-1 y ein3-3 son tolerantes a litio y la inhibición de la biosíntesis de etileno con 2-aminoisobutirato protege contra la toxicidad del litio. Análisis de la expresión génica con micromatrices indican que la expresión de genes relacionados al transporte de cationes y a la síntesis y percepción de etileno no están alterados en el mutante cat2-1, lo que nos hace suponer que el peróxido de hidrógeno modula estos procesos a nivel de proteína. Todos estos resultados descubren una estrecha relación entre estrés oxidativo, la homeostasis de cationes y el / Bueso Ródenas, E. (2008). La tolerancia a litio del mutante cat2 de arabidopsis revela una estrecha relación entre estrés oxidativo y etileno [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2341 / Palancia

Los virus de plantas constituyen, en ocasiones, una seria amenaza para numerosos cultivos. A pesar de las numerosas investigaciones realizadas, existe todavía un gran desconocimiento de las rutas y los mecanismos que operan en la invasión viral de los correspondientes huéspedes. Es importante destacar que el bloqueo en el movimiento viral constituye uno de los mecanismos de resistencia natural más frecuentes a los virus. El progreso en el conocimiento de estas etapas del ciclo viral puede llevar a estrategias antivirales. En el presente trabajo se ha pretendido caracterizar estructural y funcionalmente las 5 proteínas codificadas por el genoma del MNSV, haciendo especial hincapié en caracterizar los factores, tanto virales como celulares, que intervienen en el transporte intra e intercelular del virus. Como paso previo y necesario, en el Capítulo 1 de la presente Tesis, se ha obtenido un clon infeccioso del MNSV, denominado pMNSV(Al), a partir del cual se pueden generar transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el virus tras la inoculación mecánica sobre el huésped natural (melón). Este clon infeccioso constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de los genes virales. Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pMNSV(Al), se ha obtenido una colección de mutantes que impiden la expresión de cada una de las ORFs del genoma del virus. Además, las mismas modificaciones se han efectuado sobre un clon quimérico, pMNSV(Al)- cp-GFP, en el que se ha sustituido la ORF que codifica la CP viral por el gen testigo de la proteína de fluorescencia verde (GFP). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las proteínas 29 y 89 estarían implicadas en la replicación del genoma. Por otro lado, la p7A y la p7B participarían en el movimiento célula a célula del virus. Por último, p42 ó CP, además de su papel estructural, es necesaria para la invasión sistémica del virus, siendo capaz / Genovés Martínez, A. (2008). Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2401 / Palancia

El objetivo general de este trabajo es revelar por primera vez los cambios en la expresión génica que se producen durante el desarrollo y la maduración de la pulpa de los frutos cítricos, y en particular aquellos asociados a los mecanismos de regulación de la acidez, identificando el conjunto de genes inducidos y reprimidos que regulan la síntesis y la degradación del ácido cítrico durante la maduración interna de los frutos cítricos. Desde un punto de vista metabólico se ha estudiado la evolución de los principales ácidos de los frutos en cuatro variedades que presentan diferencias en su periodo de maduración, con la intención de determinar los correspondientes patrones de acumulación y degradación. Por otra parte, atendiendo a la expresión de los principales genes implicados en el metabolismo de los ácidos se incide sobre los mecanismos de regulación de su síntesis durante las fases I y II del desarrollo del fruto, y de su degradación en las fases II y III de maduración del fruto. De este modo se ha comprobado que el ácido cítrico se metaboliza vía 2-oxoglutarato a glutamina y a succinato, en la ruta de derivación del GABA, por lo que esta ruta parece ser una vía prioritaria de catabolismo del ácido cítrico. Además, se ha comprobado que la acumulación de ácido cítrico en los frutos se encuentra directamente relacionada con una disminución del nivel de transcrito de la ATP citrato liasa, la cual reduce la degradación de citrato en el citosol quedando más cantidad de citrato disponible para ser almacenado en la vacuola. / Soler Fayos, G. (2009). Cambios en la expresión génica asociados a la maduración interna del fruto de los cítricos: identificación de rutas metabólicas implicadas en la acumulación y eliminación de ácidos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6068 / Palancia

Beta-lapachona ( -lap) es un agente antitumoral que induce apoptosis selectivamente en células tumorales. El mecanismo preciso de citotoxicidad de -lap no es aún completamente comprendido. Aquí reportamos que -lap produce un retraso en la progresión del ciclo celular en la transición G1/S, aumenta la fosforilación de la quinasa de control Rad53p y disminuye la supervivencia celular en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. Además, -lap induce la fosforilación de histona H2A en la posición serina 129. Estas respuestas de control de ciclo son reguladas por las quinasas Mec1p y Tel1p. Mec1p se requiere para la fosforilación de Rad53p/histona H2A y supervivencia celular tras tratamiento con -lap en cultivos asincrónicos, pero no para el retraso en la transición G1/S. La mutación tel1 aumenta la sensibilidad a -lap en una cepa defectiva en mec1, y compromete las respuestas de los puntos de control de ciclo. La fosforilación de Rad53p y el retraso en G1/S son completamente dependientes de un complejo Mre11p-Rad50p-Xrs2p (XMR) funcional, y mutantes en el complejo XMR son extremadamente sensibles al tratamiento con -lap. Finalmente, XRS2 y TEL1 trabajan epistáticamente respecto a la sensibilidad a -lap y Xrs2p se fosforila en un modo dependiente de Tel1p tras el tratamiento. El tratamiento con -lap también genera la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la cual es bloqueada eficientemente por dicumarol, un inhibidor de NADH deshidrogenasas (NADH-DH). El tratamiento con dicumarol no afecta a la viabilidad ni a las respuestas de control activadas por la droga. Identificamos un mutante, defectivo en la NADH-DH mitocondrial Nde2p, que es resistente a la toxicidad de -lap. -lap induce la producción de ROS en este mutante, sin afectar la viabilidad o la progresión de ciclo. El mutante nde2 presenta un retraso en la entrada en fase S del ciclo celular, e hipersensibilidad a agentes que dañan el ADN. Nuestros datos indican que Nde2p es un determ / Menacho, MA. (2007). Mecanismos moleculares involucrados en la citotoxicidad del agente antitumoral beta-lapachona [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1877 / Palancia

La mancha bacteriana causada por el patógeno Pseudomonas syringae pv. tomato (P. s. tomato) es una de las enfermedades más devastadoras del cultivo del tomate. En este trabajo se demuestra que la sola inhibición de la expresión del gen Ep5C, que codifica una peroxidasa catiónica extracelular, es suficiente para conferir una marcada resistencia a P.s. tomato. Esta inhibición encontrada en las plantas de tomate produce una resistencia que no requiere la activación de las rutas de defensa descritas hasta ahora, controladas por el ácido salicílico y el ácido jasmónico. Así, la inhibición de este gen constituye una nueva herramienta genética para obtener plantas transgénicas resistentes a esta enfermedad. La temprana inducción del gen Ep5C está mediada por el H2O2, una especie reactiva de oxígeno generada durante el curso de u interacciones planta-patógeno. Los mecanismos que controlan la resistencia de las plantas a patógenos necrotrofos constituye uno de los aspectos menos estudiados en la actualidad. La búsqueda de nuevos componentes genéticos que participan en la cascada de señalización de las plantas frente a patógenos constituye uno de los retos de la biología molecular moderna. En este trabajo llevamos a cabo un escrutinio, utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana portadoras del gen de la B-glucoronidasa (GUS) como gen marcador bajo el control del promotor del gen Ep5C, en busca de mutantes alterados en la expresión de dicho gen. En el presente trabajo presentamos la identificación y caracterización de uno de los mutantes, en concreto el mutante ocp3 (overexpressor of cationic peroxidase 3), el cual presenta expresión constitutiva del gen GUS. Las plantas ocp3 muestran una elevada acumulación de H2O2, y se caracterizan por presentar expresión constitutiva de GST1 y PDF1.2, dos genes marcadores de la respuesta defensiva, pero sin embargo no muestra expresión de PR-1, un gen marcador dependiente de la ruta del ácido salicílico (SA). La característic / Coego González, A. (2006). Análisis funcional del gen Ep5C y su implicación en los mecanismos de defensa en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1972 / Palancia

La mayor parte de la pérdida de producción vegetal en el planeta es debida principalmente a la salinidad y a la sequía, junto con la aparición de temperaturas extremas (Epstein et al., 1980; Yancey et al., 1982). Este factor, entre otros, provoca que el estudio de los procesos de tolerancia a estos estreses sea de vital importancia, no sólo desde el punto de vista biológico, donde existen plantas capaces de tolerar concentraciones extremas de sales y periodos enormes de tiempo sin agua, sino que desde el punto de vista humano, el estudio de estos procesos beneficia sin duda el aspecto económico de la agricultura. Este beneficio humano obtenido, podría, siendo muy optimistas, resolver los problemas de hambruna de vastos territorios desertificados o salinizados, aunque siendo más realistas, podría permitir en un futuro no muy lejano utilizar agua de mar poco tratada para el riego de cultivos. Siguiendo este planteamiento y utilizando datos previos del "screening" funcional de genes de Arabidopsis thaliana en levadura (Forment et al., 2002), se inició esta Tesis doctoral tomando al gen RCY1 como protagonista. Este gen implicado presuntamente en procesamiento de mRNA fue sometido a estudio, siguiendo el dogma de su relación con la tolerancia a estrés salino en levadura. Así, se realizaron una serie de estudios en Arabidopsis thaliana, encaminados a comprobar si en esta planta, de donde procede el gen, también interviene en procesos de tolerancia a sal, así como encaminados a discernir parte del mecanismo de acción del gen con o sin sal. En primer lugar se comprobó que la expresión de dicho gen en esta planta se dispara en situaciones de estrés salino (NaCl y LiCl), hídrico (ausencia de riego) y osmótico (sorbitol). Es decir, a partir de una expresión basal muy baja y sometiendo a la planta a dichos estreses, los niveles de mRNA de RCY1 aumentan significativamente. También se ha comprobado que de forma silvestre y en ausencia de sal, este gen no tiene una expresión i / Amoros Seller, B. (2008). RCY1: proteína nuclear relacionada con el estrés salino [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2501 / Palancia