Los insecticidas organofosforados se utilizan como tratamientos fitosanitarios en el cultivo del olivar y debido a su solubilidad en las grasas, sus residuos tienden a concentrarse en el aceite. España es uno de los principales países productores y exportadores de aceite de oliva, por lo que mejorar su calidad y garantizar su seguridad alimentaria, es primordial para defender este producto. En esta Tesis se ha desarrollado un método para el cribado rápido y sensible de residuos de organofosforados en aceite de oliva virgen extra, con la menor manipulación posible de la muestra, de modo que sea aplicable en el propio campo y en las almazaras. Para ello, se han desarrollado inmunoensayos en formato ELISA para los plaguicidas organofosforados diazinón, fentión, malatión y clorpirifos, y se ha estudiado su especificidad y tolerancia a disolventes orgánicos. Conjuntamente, se ha puesto a punto un método rápido y sencillo de extracción de residuos de plaguicidas en aceite de oliva virgen extra basado en extracción líquido-líquido y limpieza en frío. Este procedimiento se ha aplicado a la determinación de residuos de los plaguicidas organofosforados objeto de estudio, sin más que realizar una dilución del extracto -que contiene los residuos de los cuatro plaguicidas- previa al análisis mediante los ELISAs desarrollados, y utilizando curvas de calibrado en la matriz. Los resultados obtenidos se han comparado con el método de referencia (GC-MS), alcanzándose buenas correlaciones. Esta metodología se ha aplicado también a otros aceites vegetales (orujo, maíz, girasol, soja) sin más que realizar la curva de calibrado en el mismo tipo de aceite que se desea analizar. Además, se han desarrollado inmunoensayos en membrana para el cribado de residuos de diazinón, fentión, malatión y clorpirifos en aceite de oliva utilizando la metodología ELIFA. Combinando la inmunofiltración y el protocolo de extracción previamente desarrollado para aceite de oliva, la detección visual de una t / Garcés García, M. (2008). Inmunoensayos rápidos para la determinación de residuos de plaguicidas organofosforados en aceite de oliva [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2930

El objetivo principal de esta tesis consiste en la obtención de anticuerpos recombinantes frente a los fungicidas azólicos tetraconazol, hexaconazol e imazalil, y su aplicación en la determinación de residuos de estos fungicidas en muestras agroalimentarias. Para ello, en primer lugar, se han aplicado técnicas de biología molecular para la obtención de los fragmentos recombinantes scFv (single chain fragment variable) a partir del material genético de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente a los fungicidas tetraconazol, hexaconazol e imazalil. Posteriormente, dichos fragmentos se han expresado en sistemas bacterianos empleando vectores de expresión plasmídicos. Por otro lado, se ha optimizado un sistema de cribado y selección de colonias bacterianas productoras de fragmentos de anticuerpos recombinantes capaces de reconocer a los plaguicidas en estudio. Este sistema está basado en ELISAs simultáneos, competitivos y no competitivos, de la fracción soluble del anticuerpo recombinante. Finalmente, en el caso de los anticuerpos frente a hexaconazol e imazalil, se ha aplicado un protocolo de enriquecimiento cíclico denominado panning, basado en la tecnología de presentación de moléculas proteicas en la superficie de fagos (phage display). De este modo, se han obtenido anticuerpos recombinantes a partir de cada hibridoma productor de anticuerpos monoclonales. Cada anticuerpo recombinante se ha expresado tanto en su forma de proteína libre (scFv) como en forma de proteína de fusión (scFv-pIII). De igual modo, se han empleado técnicas de biología molecular para la generación de bibliotecas de fragmentos recombinantes scFv a partir del material genético de linfocitos de ratones inmunizados frente a cada uno de los tres fungicidas. En este caso, se han optimizado las condiciones tanto de la etapa de construcción de bibliotecas como del posterior proceso de enriquecimiento por panning. / Plana Andani, E. (2010). Selección y caracterización de anticuerpos recombinantes para fungicidas. Aplicación al desarrollo de técnicas inmunoanalíticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8477