El objetivo de esta tesis fue desarrollar un ELISA multianalito, basado en anticuerpos monoclonales, para los plaguicidas N-metilcarbamatos carbaryl, carbofuran y methiocarb. Para ello se desarrollaron en primer lugar ELISAs individuales para carbofuran y methiocarb. Posteriormente estos inmunoensayos, junto con el de carbary1, previamente desarrollado en el LIB, se integraron en un ELISA multianalito. Para producir anticuerpos monoclonales frente a carbofuran y methiocarb se sintetizaron tres compuestos para cada analito, con un brazo espaciador carboxílico de diferente longitud introducido en el grupo carbamato de la estructura del analito. Posteriormente, estos compuestos fueron conjugados a proteínas y utilizados para inmunizar ratones. Los anticuerpos monoclonales producidos fueron caracterizados en los formatos de ELISA de conjugado inmovilizado (C1) y anticuerpo inmovilizado (Al), usando otros compuestos sintetizados como haptenos heterólogos de ensayo. Los anticuerpos de methiocarb LIB-MXNB31 y de carbofuran LIB-BFNB67, en combinación con los haptenos de methiocarb (DPNI-1 y MCNH) y de carbofuran (BFNH), acoplados a ovoalbúmina y a peroxidasa, respectivamente, se utilizaron para desarrollar ELISAs en los formatos Cl y Al, respectivamente. Los inmunoensayos desarrollados para carbofuran y methiocarb mostraron valores de I5o aproximadamente de 0.7 y 0.03 ng/ml, respectivamente. Los ELISAs de methiocarb fueron muy específicos, mientras que los de carbofuran reconocieron algunos compuestos estructuralmente similares. Los inmunoensayos de carbofuran y methiocarb, junto con el de carbary1, fueron validados frente a HPLC, como método de referencia, en el análisis de muestras purificadas de frutas y hortalizas, obteniéndose una buena correlación entre métodos. Asimismo, se demostró que estos ELISAs puede ser aplicados al análisis de carbary1, carbofuran y methiocarb en extractos crudos, obteniéndose incluso mejores resultados que en las muestras purificadas......... / Moreno Tamarit, MJ. (2002). Desarrollo de un inmunoensayo multianalito, basado en anticuerpos monoclonales, para la determinación de plaguicidas N-metilcarbamatos en frutas y hortalizas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2688 / Palancia

La presencia de residuos de antibióticos en alimentos de origen animal es uno de los problemas más importantes y actuales en seguridad alimentaria. Los medicamentos son utilizados en la producción animal con fines terapéuticos y como promotores del crecimiento. El problema surge cuando residuos de estos antibióticos llegan al consumidor a través de la cadena alimentaria a niveles perjudiciales para su salud, ya que tienen efectos secundarios al destruir las bacterias comensales de nuestro intestino y al provocar reacciones alérgicas, además de contribuir a la aparición de bacterias resistentes. A efectos normativos, en el reglamento CE No 470/2009 se establecen procedimientos comunitarios para la fijación de los límites máximos de residuos (LMR) de las sustancias farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal. Así, para la mayoría de los antibióticos usados con fines veterinarios y dependiendo del tejido, el LMR varía entre 5 y 600 µg/kg. Actualmente, la determinación de tetraciclinas y sulfonamidas se lleva a cabo, principalmente, mediante cromatografía liquida (HPLC) con detección fluorescente, UV o por espectrometría de masas (MS). El método es complicado y sobre todo caro. Además, la etapa de preparación y purificación de muestra requerida para obtener un alto grado de pureza es laboriosa, lo que unido a la baja capacidad de trabajo y el coste de los análisis, hacen que esta metodología sea poco adecuada para implementar programas de vigilancia y control que aseguren la inocuidad de los alimentos. Los métodos de barrido son los utilizados comúnmente para detectar residuos de antibióticos en alimentos previamente al análisis confirmativo. Estos métodos deben ser semicuantitativos, rápidos, robustos y relativamente baratos. Entre los métodos de barrido (screening) utilizados para detectar residuos de antibióticos se encuentran principalmente los cromatográficos, los microbiológicos y los inmunológicos. Esta Tesis se ha centrado en el desarrollo de inmunorreactivos y sistemas analíticos de barrido basados en métodos inmunoquímicos (ELISA), dirigida a la detección de residuos de antibióticos en alimentos, concretamente sulfonamidas y tetraciclinas. / Pastor Navarro, N. (2011). SÍNTESIS DE INMUNORREACTIVOS PARA LA DETERMINACIÓN DE SULFONAMIDAS Y TETRACICLINAS EN ALIMENTOS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14273 / Palancia

[ES] El objetivo de la presente tesis doctoral es el estudio, desarrollo y validación de diferentes métodos inmunoquímicos que permitan determinar contaminantes químicos en alimentos de origen vegetal y en agua, de manera que contribuyan a mejorar su calidad y por ende la seguridad del consumidor. Spirotetramat es un plaguicida de nueva generación altamente eficiente, comercializado mundialmente para su uso como insecticida en multitud de cultivos agrícolas. Tiene propiedades sistémicas, ya que después de la absorción se transloca tanto a través del xilema como del floema, gracias a que es transformado por la planta en spirotetramat-enol, mucho más polar. En consecuencia, la definición de residuo de este insecticida en alimentos de origen vegetal para fines analíticos incluye también dicho metabolito. Por otro lado, anatoxina-a es un alcaloide secundario con neurotoxicidad aguda que se pueden encontrar en agua dulce. Esta toxina es producida por siete géneros diferentes de cianobacterias, y se ha detectado en lagos y otras fuentes de agua de todos los continentes. El análisis de sustancias como spirotetramat y anatoxina-a se lleva a cabo actualmente mediante métodos cromatográficos como HPLC-MS. Estas técnicas presentan una elevada sensibilidad y fiabilidad; sin embargo, requieren personal altamente cualificado y un equipamiento caro y no portable. Una opción complementaria son los métodos inmunoquímicos, como el ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o el inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, Lateral Flow ImmunoAssay), ya que son métodos de análisis rápidos y económicos, y además son muy versátiles permitiendo adaptarlos a necesidades analíticas particulares, como los ensayos de cribado de numerosas muestras o los ensayos portátiles con lectura visual de los resultados. A partir de una colección de bioconjugados y de anticuerpos de spirotetramat y de anatoxina-a se caracterizó la afinidad y especificidad de los inmunorreactivos con el fin de seleccionar parejas conjugado/anticuerpo aptas para el desarrollo de inmunoensayos tipo ELISA y LFIA competitivos. Se optimizaron las condiciones de ensayo, y se llevó a cabo un estudio de la influencia de diferentes factores fisicoquímicos sobre los parámetros analíticos de los ensayos seleccionados. Posteriormente se evaluó la influencia de la matriz alimentaria, particularmente uva, zumo de uva y vino, así como de aguas de diferente procedencia, sobre la señal y la sensibilidad de los inmunoensayos. La diferente afinidad de los anticuerpos hacia spirotetramat y spirotetramat-enol nos llevó a optimizar el tratamiento de muestra, incluyendo una etapa de hidrólisis para transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera controlada, rápida y cuantitativa. De este modo se hizo posible aportar resultados en forma de suma de la concentración de ambos compuestos en la muestra, tal y como exige la legislación vigente. Además, para la extracción de residuos de este insecticida a partir de muestras de uva se puso a punto un procedimiento empleando la tecnología QuEChERS, y para la reducción de interferencias de vinos y zumos se utilizó polivinilpolipirrolidona. En el caso de las aguas, se aplicó una simple filtración para eliminar partículas en suspensión. Los inmunoensayos enzimáticos en microplaca optimizados para determinar de manera competitiva residuos de spirotetramat presentaron valores de IC50 para spirotetramat-enol en torno a 0.1 ng/mL, y límites de detección alrededor de 0.02 ng/mL. El estudio de la precisión y exactitud del método empleando muestras de alimentos dopados reflejó límites de cuantificación de 2.5 ng/mL para uva, zumos de uva y vinos, tanto blancos como tintos, muy por debajo de los límites máximos de residuos autorizados en la Unión Europea para este insecticida en dichos alimentos. / [EN] The aim of this doctoral thesis is the study, development and validation of different immunochemical methods for determining chemical contaminants in produce and water, in a way that they may contribute to improving food quality and therefore to assure consumer safety. Spirotetramat is a highly efficient new-generation pesticide, marketed worldwide for use as insecticide in many agricultural crops. It has systemic properties, since short after absorption it translocates through both the xylem and the phloem, thanks to the fact that it is transformed by the plant into the much more polar spirotetramat-enol. Consequently, the residue definition for this insecticide in foods of plant origin with analytical purposes also includes said metabolite. On the other hand, anatoxin-a is a secondary alkaloid with acute neurotoxicity that can be found in fresh water. This toxin is produced by seven different genera of cyanobacteria, and has been detected in lakes and other water resources on all continents. The analysis of substances like spirotetramat and anatoxin-a is currently carried out by chromatographic methods like HPLC-MS. These techniques are highly sensitive and reliable; however, they require highly qualified personnel and expensive, non-portable equipment. Nowadays, the immunochemical methods, such as the ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) or the LFIA (Lateral Flow ImmunoAssay), constitute excellent complementary analytical options to instrumental strategies, since they are fast and inexpensive analytical methods, and are also very versatile so they can be adapted to particular analytical needs, such as screening assays for large numbers of samples or portable tests with visual reading of the results. The antibody affinity and specificity from a collection of spirotetramat and anatoxin-a immunoreagents was characterized in order to select conjugate/antibody pairs suitable for the development of competitive ELISA and LFIA tests. The assay conditions were optimized, and a study of the influence of different physicochemical factors over the analytical parameters of the selected immunoassays was carried out. Subsequently, the influence of the food matrix, particularly grape, grape juice and wine, as well as water from different sources, over the assay signal and sensitivity was evaluated. The different affinity of the available antibodies towards spirotetramat and spirotetramat-enol led us to optimize the sample treatment procedure, so a hydrolysis step to transform spirotetramat into spirotetramat-enol in a controlled, rapid and quantitative way, was included. Thus, it was possible to provide results in the form of the sum of the concentration of both compounds in the sample, as required by current legislation. In addition, a procedure using QuEChERS technology was developed to extract residues of this insecticide from grape samples, and polyvinylpolypyrrolidone was used to reduce interferences from wines and juices. In the case of waters, a simple filtration was applied to remove suspended particles. Microplate enzyme immunoassays that were optimized to competitively determine spirotetramat residues showed IC50 values for spirotetramat-enol around 0.1 ng/mL, and limits of detection around 0.02 ng/mL. Precision and accuracy studies with these immunoassays using fortified food samples reflected limits of quantification of 2.5 ng/mL for grapes, grape juices and wines, both white and red, well below the maximum residue limits authorized by the European Union for this insecticide in such foodstuffs. Finally, a comparative study with HPLC-MS/MS validated the studied immunoassay for analyzing spirotetramat residues in grape samples within a wide range of concentrations. / [CA] L’objectiu de la present tesi doctoral és l’estudi, desenvolupament i validació de diferents mètodes immunoquímics que permeten determinar contaminants químics en aliments d’origen vegetal i en aigua, de manera que contribuïsquen a millorar la seua qualitat i per tant la seguretat dels consumidors. Spirotetramat és un plaguicida de nova generació altament eficient, comercialitzat mundialment per a l’ús com insecticida en multitud de cultius agrícoles. Té propietats sistèmiques, ja que en ser absorbit es transloca tant a través del xilema com del floema, gràcies a que és transformat per la planta en spirotetramat-enol, molt més polar. Conseqüentment, la definició de residu d’aquest insecticida en aliments d’origen vegetal amb finalitats analítiques inclou també l’esmentat metabòlit. D’una altra banda, anatoxina-a és un alcaloide secundari amb neurotoxicitat aguda que es pot trobar en aigua dolça. Aquesta toxina és produïda per set gèneres de cianobacteris diferents, i s’ha detectat en llacs i altres fonts d’aigua de tots els continents. L’anàlisi de substàncies com spirotetramat i anatoxina-a es duu a terme actualment mitjançant mètodes cromatogràfics, com HPLC-MS. Aquestes tècniques presenten una elevada sensibilitat i fiabilitat; tanmateix, requereixen personal altament qualificat i un equipament car i no portable. Una opció complementària són els mètodes immunoquímics, com l’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o l’immunoassaig de flux lateral (LFIA, Lateral Flow Immunoassay), ja que són mètodes d’anàlisi ràpids i econòmics, i a més són molt versàtils, la qual cosa permet adaptar-los a necessitats analítiques particulars, com són els assaigs per destriar nombroses mostres o els assaigs portàtils amb lectura visual dels resultats. A partir d’una col·lecció de bioconjugats i d’anticossos de spirotetramat i d’anatoxina-a es va caracteritzar l’afinitat i especificitat dels immunorreactius amb la finalitat de seleccionar parelles conjugat/anticòs aptes per desenvolupar immunoassaigs tipus ELISA i LFIA competitius. S’optimitzaren les condicions d’assaig, i es va dur a terme un estudi de la influència de diferents factors fisicoquímics sobre els paràmetres analítics dels assaigs seleccionats. Posteriorment, es va avaluar la influència de la matriu alimentària, particularment raïm, suc de raïm i vi, així com d’aigües de diferent procedència, sobre el senyal i la sensibilitat dels assaigs. La diferent afinitat dels anticossos cap a spirotetramat i spirotetramat-enol ens va dur a optimitzar el tractament de mostra mitjançant la inclusió d’una etapa d’hidròlisi per transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera ràpida, controlada i quantitativa. D’aquesta manera es va fer possible aportar resultats en forma de suma de la concentració d’ambdós composts en la mostra, tal i com exigeix la legislació vigent. A més a més, per extraure residus d’aquest insecticida a partir de mostres de raïm es va posar a punt un procediment emprant la tecnologia QuEChERS, i per reduir interferències de vins i sucs es va utilitzar polivinilpolipirrolidona. En el cas de les aigües, es va aplicar una simple filtració per eliminar partícules en suspensió. Els immunoassaigs enzimàtics en microplaca optimitzats per determinar de manera competitiva residus de spirotetramat presentaren valors d’IC50 per spirotetramat-enol al voltant de 0.1 ng/mL, i límits de detecció propers a 0.02 ng/mL. L’estudi de la precisió i exactitud del mètode emprant mostres d’aliments dopats va reflectir límits de quantificació de 2.5 ng/mL per raïm, sucs de raïm i vins, tant blancs com negres, molt per sota dels límits màxims de residus autoritzats per la Unió Europea per a aquest insecticida en els esmentats aliments. Finalment, un estudi comparatiu amb HPLC-MS/MS va validar l’immunoassaig estudiat per analitzar residus de spirotetramat en mostres de raïm en un ampli rang de concentracions. En el cas d’anatoxina-a, es van optimitzar dos immunoassaigs tipus ELISA competitiu, els valors d’IC50 dels quals van estar entre 0.5 i 1.0 ng/mL, amb límits de detecció per davall de 0.1 ng/mL. L’anàlisi de diferents tipus d’aigües fortificades amb anatoxina-a ens va revelar que els immunoassaigs desenvolupats permeten quantificar aquesta cianotoxina entre 0.5 i 500 ng/mL. Addicionalment es van optimitzar i caracteritzar assaigs immunocromatogràfics, tipus tires reactives, tant per spirotetramat com per anatoxina-a, vàlids com a tècniques portables i ràpides per determinar semi-quantitativament aquestes substàncies tòxiques en vi i aigües, respectivament. Seguint la normativa europea per a mètodes ràpids front a petites molècules orgàniques, es va determinar el senyal indicatiu del llindar per distingir les mostres positives, que superen la concentració de destriament establerta, de les negatives. En el cas de spirotetramat, el mètode desenvolupat permet el triatge, tant instrumental com visual, amb un interval de confiança del 99%, de mostres de vi amb una concentració de residu de 1000 ng/mL, equivalent al límit màxim de residus, expressada como la suma de spirotetramat més spirotetramat-enol. Per anatoxina-a, les tires immunocromatográfiques desenvolupades van poder detectar mostres d’aigua amb 2 ng/mL de l’esmentada cianotoxina amb una fiabilitat del 99%, i mostres amb 1 ng/mL amb una probabilitat del 40%, mentre que el límit de detecció visual va ser de 3 ng/mL. / A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT), del gobierno de la República de Ecuador que al adjudicarme la beca bajo el “PROGRAMA DE BECAS PARA DOCTORADO (PHD) PARA DOCENTES DE UNIVERSIDADES Y DE ESCUELAS POLITÉCNICAS 2015”, permitió formarme como persona y profesional en mis estudios de doctorado. / Cevallos Cedeño, RE. (2020). Desarrollo de métodos inmunoquímicos para la determinación de sustancias tóxicas en alimentos y aguas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149570 / TESIS

Los antibióticos son ampliamente utilizados en veterinaria, produciendo beneficios inmensos, pero también conllevan riesgos medioambientales debidos a la aparición de residuos "incontrolados" que pueden desencadenar resistencias bacterianas, reacciones alérgicas y otros inconvenientes importantes. En esta tesis se han desarrollado varios sistemas inmunoquímicos para la determinación de residuos de distintos tipos de antibióticos, tanto mediante el formato tradicional en placa ELISA, como mediante el uso de microarrays utilizando CDs como plataformas analíticas. En primer lugar, se han desarrollado inmunoensayos en placa ELISA para sulfonamidas y tetraciclinas. Se han puesto a punto dos inmunoensayos genéricos para la determinación de seis sulfonamidas, con elevada sensibilidad (IC50 entre 1,32 y 12,82 ng mL-1) e inmunoensayos específicos para la determinación de SSZ y SMX con valores de IC50 de 0,51 y 0,16 ng mL-1, respectivamente. Asimismo, se ha puesto a punto un inmunoensayo específico para la determinación de CTC, con un valor de IC50 de 36,40 ng mL-1. Estos ELISAs se han aplicado con éxito a la cuantificación de residuos de sulfonamidas en alimentos (miel), aguas de depuradora y plasma humano. En otro apartado se presentan los resultados de las investigaciones sobre el desarrollo de microinmunoensayos utilizando la tecnología de discos compactos. Este soporte presenta gran área analítica donde depositar miles de biomoléculas sonda y la posibilidad de integrar tanto información numérica como bioquímica (identificando cada punto de cada matriz y almacenando los resultados del ensayo en la misma plataforma física en la que se desarrolla el análisis); por último, su fabricación a gran escala permite obtener productos de alta calidad a muy bajo precio. Además, los resultados analíticos son leídos y cuantificados por un lector comercial de CDs integrado en un ordenador personal convencional. / Gallego Iglesias, E. (2012). Desarrollo de inmunoensayos para antibióticos en microplaca y en disco compacto aplicados a la determinación multirresiduo de contaminantes [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14720 / Palancia

Los insecticidas organofosforados se utilizan como tratamientos fitosanitarios en el cultivo del olivar y debido a su solubilidad en las grasas, sus residuos tienden a concentrarse en el aceite. España es uno de los principales países productores y exportadores de aceite de oliva, por lo que mejorar su calidad y garantizar su seguridad alimentaria, es primordial para defender este producto. En esta Tesis se ha desarrollado un método para el cribado rápido y sensible de residuos de organofosforados en aceite de oliva virgen extra, con la menor manipulación posible de la muestra, de modo que sea aplicable en el propio campo y en las almazaras. Para ello, se han desarrollado inmunoensayos en formato ELISA para los plaguicidas organofosforados diazinón, fentión, malatión y clorpirifos, y se ha estudiado su especificidad y tolerancia a disolventes orgánicos. Conjuntamente, se ha puesto a punto un método rápido y sencillo de extracción de residuos de plaguicidas en aceite de oliva virgen extra basado en extracción líquido-líquido y limpieza en frío. Este procedimiento se ha aplicado a la determinación de residuos de los plaguicidas organofosforados objeto de estudio, sin más que realizar una dilución del extracto -que contiene los residuos de los cuatro plaguicidas- previa al análisis mediante los ELISAs desarrollados, y utilizando curvas de calibrado en la matriz. Los resultados obtenidos se han comparado con el método de referencia (GC-MS), alcanzándose buenas correlaciones. Esta metodología se ha aplicado también a otros aceites vegetales (orujo, maíz, girasol, soja) sin más que realizar la curva de calibrado en el mismo tipo de aceite que se desea analizar. Además, se han desarrollado inmunoensayos en membrana para el cribado de residuos de diazinón, fentión, malatión y clorpirifos en aceite de oliva utilizando la metodología ELIFA. Combinando la inmunofiltración y el protocolo de extracción previamente desarrollado para aceite de oliva, la detección visual de una t / Garcés García, M. (2008). Inmunoensayos rápidos para la determinación de residuos de plaguicidas organofosforados en aceite de oliva [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2930 / Palancia

La Espectrometría de Masas mediante ionización en Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-MS) es una técnica de análisis elemental que permite cuantificar la mayor parte de los elementos de la tabla periódica de forma rápida y a niveles de ultratraza. A lo largo de la última década, y debido a sus características analíticas, el ICP-MS se ha utilizado como sistema de detección en inmunoensayos para la determinación de bioméculas. A pesar de los avances que se han producido, este tipo de estrategias todavía no están exentas de inconvenientes. Entre los retos que aún están por resolver, se encuentran: (i) desarrollo de metodologías para la determinación de haptenos (biomoléculas de bajo peso molecular < 10 kDa), (ii) falta de criterio para seleccionar el tipo de inmunoensayo más adecuado para una aplicación bioanalítica dada, sobre todo cuando se trabaja con haptenos; y (iii) escaso aprovechamiento del potencial del ICP-MS (sensibilidad, límites de detección, capacidad de análisis multielemental, etc.). En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado nuevos métodos de análisis de biomoléculas con detección mediante ICP-MS tratando de solucionar los inconvenientes citados con anterioridad. Los métodos se han aplicado al análisis de tóxinas en alimentos y de biomarcadores oncológicos en fluidos biológicos (suero). En primer lugar, debido a la gran preocupación existente por la seguridad alimentaria y el efecto de la alimentación sobre la salud humana, se ha desarrollado una nueva metodología para la cuantificación de la aflatoxina M1 (hapteno) en muestras de leche que cumpliera con los niveles de seguridad requeridos por las actuales políticas internacionales. Por otro lado, se han comparado diferentes formatos de inmunoensayos competitivos para la determinación de esta misma aflatoxina en leche. Además se ha estudiado el efecto de la naturaleza química y del tamaño de las nanopartículas (es decir, Ag / Au, 80 nm / 40 nm) empleadas en los inmunoensayos sobre los parámetros analíticos. Finalmente, se presenta un nuevo enfoque con el objeto de aumentar la sensibilidad de los inmunoensayos homogéneos con detección mediante ICP-MS, con la introducción de un alto número de etiquetas por anticuerpo monoclonal mediante el empleo de polímeros como portadores de múltiples iones lantánidos. Esta metodología se ha aplicado a la determinación simultánea de 4 biomarcadores de cáncer (CEA, sErbB2, CA 15.3 y CA 125) en suero humano.

Las hormonas recombinantes eritropoyetina (EPO) y hormona de crecimiento (GH), prácticamente iguales a las endógenas y de corta vida media en circulación, son de difícil detección directa en el control antidopaje. Se determinaron los valores poblacionales de los biomarcadores indirectos EPO, receptor soluble de la transferrina, insulin-like growth factor-I (IGF-I) y procolágeno tipo III péptido (P-III-P), en poblaciones seleccionadas de deportistas, y el efecto del ejercicio y los distintos tipos de entrenamiento sobre su concentración sérica. La comparación de resultados obtenidos mediante distintos ensayos demostró la necesidad de una validación exhaustiva previa a su utilización. A excepción del P-III-P, los biomarcadores séricos propuestos para la detección de rhEPO y rhGH no se encuentran directamente afectados por el nivel atlético, el ejercicio o la distinta carga de entrenamiento realizada a lo largo de la temporada deportiva. La edad es la principal influencia sobre las concentraciones séricas de IGF-I y P-III-P. / Direct detection of recombinant peptidic hormones erythropoietin (EPO) and growth hormone (GH), very similar to endogen molecules and with a short half life in blood, is difficult in antidoping control. The main objective of this work is to determine indirect biomarkers' values of EPO, soluble transferrin receptor, insulin-like growth factor-I (IGF-I) and procollagen type III peptide (P-III-P), in selected populations of athletes, and the effect of exercise and different types of training on their concentration in serum. The comparison of results obtained by the different assays showed the need of extensive validation of the analytical techniques before their use in the antidoping field. Excepting P-III-P, proposed biomarkers for the detection of rhEPO and rhGH abuse are not directly influenced by the athletic level, exercise or different training workload along the sport season. Age is the main factor affecting IGF-I and P-III-P concentrations in serum.