Tese de mestrado. Mestrado em Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

La presencia de residuos de antibióticos en alimentos de origen animal es uno de los problemas más importantes y actuales en seguridad alimentaria. Los medicamentos son utilizados en la producción animal con fines terapéuticos y como promotores del crecimiento. El problema surge cuando residuos de estos antibióticos llegan al consumidor a través de la cadena alimentaria a niveles perjudiciales para su salud, ya que tienen efectos secundarios al destruir las bacterias comensales de nuestro intestino y al provocar reacciones alérgicas, además de contribuir a la aparición de bacterias resistentes. A efectos normativos, en el reglamento CE No 470/2009 se establecen procedimientos comunitarios para la fijación de los límites máximos de residuos (LMR) de las sustancias farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal. Así, para la mayoría de los antibióticos usados con fines veterinarios y dependiendo del tejido, el LMR varía entre 5 y 600 µg/kg. Actualmente, la determinación de tetraciclinas y sulfonamidas se lleva a cabo, principalmente, mediante cromatografía liquida (HPLC) con detección fluorescente, UV o por espectrometría de masas (MS). El método es complicado y sobre todo caro. Además, la etapa de preparación y purificación de muestra requerida para obtener un alto grado de pureza es laboriosa, lo que unido a la baja capacidad de trabajo y el coste de los análisis, hacen que esta metodología sea poco adecuada para implementar programas de vigilancia y control que aseguren la inocuidad de los alimentos. Los métodos de barrido son los utilizados comúnmente para detectar residuos de antibióticos en alimentos previamente al análisis confirmativo. Estos métodos deben ser semicuantitativos, rápidos, robustos y relativamente baratos. Entre los métodos de barrido (screening) utilizados para detectar residuos de antibióticos se encuentran principalmente los cromatográficos, los microbiológicos y los inmunológicos. Esta Tesis se ha centrado en el desarrollo de inmunorreactivos y sistemas analíticos de barrido basados en métodos inmunoquímicos (ELISA), dirigida a la detección de residuos de antibióticos en alimentos, concretamente sulfonamidas y tetraciclinas. / Pastor Navarro, N. (2011). SÍNTESIS DE INMUNORREACTIVOS PARA LA DETERMINACIÓN DE SULFONAMIDAS Y TETRACICLINAS EN ALIMENTOS [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14273

Este trabalho apresenta as propriedades ópticas dos complexos Európio Tetraciclinas (EuTcs) na presença de LDL e de LDL oxidada com potenciais aplicações em análises clínicas. Foram escolhidos quatro elementos da família das Tetraciclinas: Tetraciclina (Tc), Clorotetraciclina (CTc), Metatetraciclina (MTc) e Oxitetraciclina (OTc) para fazerem parte dos complexos com o íon európio. As melhores condições para se formar os complexos eficientemente foram determinadas, através das medidas dos parâmetros ópticos como: absorção, emissão e de tempo de vida. As melhores concentrações de európio nos complexos EuTcs e possíveis influências de íons inorgânicos normalmente presentes no plasma sanguíneo também foram analisadas. As amostras foram preparadas em pH neutro e a luminescência visível do lantanídeo foi detectada após tempo de repouso das amostras de 15 minutos. Os resultados deste trabalho mostraram que as moléculas de LDL e de LDL oxidada apresentaram um importante papel no aumento da intensidade de emissão dos complexos das Tcs. As medidas realizadas com os complexos EuTcs não apresentaram deslocamentos nos comprimentos de onda dos espectros de absorção e de emissão na presença de LDL, o que demonstra a ausência de interação direta entre as moléculas de Tcs e as moléculas de LDL e LDL oxidada. No entanto, o íon európio pode interagir em diferentes sítios das moléculas de tetraciclinas o que diferenciou a intensidade de emissão de cada complexo. Comparando os resultados obtidos entre os complexos de EuTcs, o complexo EuTc foi o que apresentou perspectivas promissoras na quantificação de LDL e LDL oxidada. / This work presents the optical properties of europium complexes - Tetracyclines (EuTcs) in the presence of LDL and oxidized LDL with potential applications in clinical analysis. Four elements were chosen from the Tetracyclines family: Tetracycline (Tc), Chlortetracycline (CTc), Metatetraciclina (MTc) and Oxytetracycline (OTc) to be part of complexes with europium ion. The best conditions to form the complex efficiently were determined through measurements of optical parameters such as absorption, emission and lifetime. The best concentrations of europium complexes in EuTcs and possible influences of inorganic ions normally present in blood plasma were also analyzed. The samples were prepared at neutral pH and the visible luminescence of lanthanide was detected after resting time of the samples of 15 minutes. These results showed that the molecules of LDL and oxidized LDL have an important role in increase of the emission intensity for Tcs complexes . The measurements performed with the complex EuTcs showed no shifts in the wavelengths of the absorption and emission spectra in the presence of LDL, which demonstrates the absence of direct interaction between the molecules of Tcs and the molecules of LDL and oxidized LDL. However, the europium ion can interact at different sites of the tetracyclines molecules which differed the emission intensity of each complex. Comparing the results obtained between the complexes EuTcs, the complex EuTc is the one that presented the promising prospects in the quantification of LDL and oxidized LDL.

Orientador: Leonardo Pezza / Banca: Fabíola Manhas Verbi Pereira / Banca: Edilene Cristina Ferreira / Banca: Aline Theodoro Toci / Banca: Danilo Luiz Flumignan / Resumo: Este trabalho descreve o desenvolvimento de métodos analíticos ambientalmente mais amigáveis utilizando sistemas de screening e procedimentos de análise por injeção em fluxo para a detecção e quantificação de antibióticos, da classe das tetraciclinas, em amostras de medicamentos veterinários e alimentos de origem animal como leite bovino e suplementos de ovos. Os métodos desenvolvidos foram baseados na reação de acoplamento diazo obtida entre as tetraciclinas e o ácido p-sulfanílico diazotado em meio básico, resultando na formação de azo compostos com máximos de absorção em torno de 435 nm, permitindo determinar esses antibióticos por espectrofotometria. As condições analíticas foram otimizadas através de análise multivariada utilizando planejamentos experimentais fatoriais e o desempenho dos métodos propostos foi avaliado através de parâmetros como linearidade, efeito matriz, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação, recuperação e estudo de interferências. O primeiro trabalho desenvolvido fez uso de um procedimento de injeção em fluxo contínuo para a rápida determinação de tetraciclinas em formulações veterinárias comerciais, visando maior eficiência no controle de qualidade na indústria farmacêutica. Na sequência, foi desenvolvido um método de screening mediante análise por injeção em fluxo empregando uma cela capilar de longo caminho óptico (LWCC) para a detecção de resíduos de tetraciclinas em amostras de leite bovino, sem a necessidade de passos de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work describes the development of environmentally friendly analytical methods using screening systems and flow injection procedures for detection and quantification of tetracycline antibiotics in veterinary pharmaceuticals and animal-derived foods such as bovine milk and egg-based protein supplements. The developed methods were based on the diazo coupling reaction between the tetracyclines and diazotized p-sulfanilic acid in basic medium, resulting in the formation of azo compounds that present maximum absorption around 435 nm, which allows determining these antibiotics by spectrophotometry. The analytical conditions were optimized by means of multivariate analysis using factorial experimental designs. Performance of the proposed methods was assessed through parameters such as linearity, selectivity, precision, accuracy, detection limit, quantification limit, matrix effect and recovery. The first developed work used a continuous flow injection procedure for the rapid determination of tetracyclines in commercial veterinary formulations, aiming greater efficiency in quality control in the pharmaceutical industry. Thereafter, it was developed a screening method by flow injection analysis using a liquid waveguide capillary cell (LWCC) for detecting tetracyclines residues in bovine milk samples, without the need for expensive extraction steps that are time-consuming or complicated sample treatments. Finally, a new ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction (... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 62.pdf: 1343180 bytes, checksum: 81374788d79902cf138c199195d47e94 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Este estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de resíduos de quatro classes de antibióticos em dois relevantes produtos de origem animal da dieta da população brasileira: ovos (ionóforos poliéteres, macrolídeos e lincosamidas) e leite (tetraciclinas). Ainda não havia dados disponíveis sobre a incidência de resíduos das classes mencionadas em ovos no Brasil. Os programas nacionais de monitoramento não investigam a presença desses medicamentos veterinários em ovos e não incluem o leite pasteurizado como matriz de análise. A relevância da pesquisa no âmbito da saúde pública deve-se à toxicidade cardiovascular dos ionóforos, ao risco de teratogenicidade de algumas tetraciclinas e à contribuição ao surgimento de microorganismos resistentes devido ao uso em larga escala de produtos veterinários à base dos antimicrobianos estudados. As metodologias analíticas foram desenvolvidas, validadas e aplicadas a uma centena de amostras de leite pasteurizado e de ovos adquiridos na região metropolitana do Rio de Janeiro. A alta sensibilidade da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas Sequencial (CLAE-EM/EM) permitiu a detecção de ionóforos em ovos com uma frequência de 25%, com a salinomicina sendo identificada em 21% dos casos. Entretanto, o índice de resultados não-conformes foi de somente 2%. A lincosamida lincomicina e o macrolídeo tilosina foram detectados em níveis de traços em 4 e 1% dos ovos avaliados, respectivamente. Nenhum caso de contaminação por lasalocida, claritromicina e eritromicina foi verificado. Embora a incidência de resíduos de coccidiostáticos acima dos limites permitidos tenha sido pequena, os resultados indicam falhas no atendimento às Boas Práticas Veterinárias por parte de alguns produtores. Em relação ao leite, 14% das amostras apresentaram traços de oxitetraciclina, mas nenhuma foi não-conforme. Esses resultados demonstram que a população da região metropolitana do Rio de Janeiro não está exposta a níveis prejudiciais de resíduos de tetraciclinas pela ingestão de leite pasteurizado. Os dados obtidos serão utilizados futuramente na avaliação da exposição alimentar a resíduos desses fármacos, contribuindo assim nas ações de Vigilância Sanitária. / This study aimed to evaluate the occurrence of residues of four classes of antibiotics in two relevant animal origin products from the Brazilian diet: eggs (polyether ionophores, macrolides and lincosamides) and milk (tetracyclines). There was still no available data on the incidence of residues of the referred classes in eggs in Brazil. The national monitoring programs do not check for those veterinary drugs in eggs and do not include pasteurized milk as a matrix of analysis. The relevance of research within the scope of the public health relays on the cardiovascular toxicity of ionophores, on the risk of teratogenicity of some tetracyclines and on the contribution to the emergence of resistant microorganisms due to widespread use of veterinary products based on the studied antimicrobials. The analytical methodologies were developed, validated and applied to a hundred samples of pasteurized milk and eggs purchased in the metropolitan area of Rio de Janeiro. The high sensitivity of the technique High Performance Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Sspectrometry (HPLC-MS/MS) allowed the detection of ionophores in eggs at a rate of 25%, with salinomycin being identified in 21% of cases. However, the rate of non-compliant results was only 2%. The lincosamide lincomycin and the macrolide tylosin were detected at trace levels in 4 and 1% of the analyzed eggs, respectively. No lasalocid, clarithromycin and erythromycin contamination case was found. Notwithstanding the incidence of coccidiostats residues above the permitted limits has been small, the results indicate failures in meeting the Veterinary Good Practices by some producers. Regarding milk, 14% of samples showed traces of oxytetracycline, but anyone was non-compliant. These results evidence that people from the metropolitan area of Rio de Janeiro are not exposed to harmful levels of tetracyclines residues by the intake of pasteurized milk. Obtained data will be used in future assessment of dietary exposure to residues of these drugs, thus contributing to Health Surveillance actions.

Este trabalho apresenta as propriedades ópticas dos complexos Európio Tetraciclinas (EuTcs) na presença de LDL e de LDL oxidada com potenciais aplicações em análises clínicas. Foram escolhidos quatro elementos da família das Tetraciclinas: Tetraciclina (Tc), Clorotetraciclina (CTc), Metatetraciclina (MTc) e Oxitetraciclina (OTc) para fazerem parte dos complexos com o íon európio. As melhores condições para se formar os complexos eficientemente foram determinadas, através das medidas dos parâmetros ópticos como: absorção, emissão e de tempo de vida. As melhores concentrações de európio nos complexos EuTcs e possíveis influências de íons inorgânicos normalmente presentes no plasma sanguíneo também foram analisadas. As amostras foram preparadas em pH neutro e a luminescência visível do lantanídeo foi detectada após tempo de repouso das amostras de 15 minutos. Os resultados deste trabalho mostraram que as moléculas de LDL e de LDL oxidada apresentaram um importante papel no aumento da intensidade de emissão dos complexos das Tcs. As medidas realizadas com os complexos EuTcs não apresentaram deslocamentos nos comprimentos de onda dos espectros de absorção e de emissão na presença de LDL, o que demonstra a ausência de interação direta entre as moléculas de Tcs e as moléculas de LDL e LDL oxidada. No entanto, o íon európio pode interagir em diferentes sítios das moléculas de tetraciclinas o que diferenciou a intensidade de emissão de cada complexo. Comparando os resultados obtidos entre os complexos de EuTcs, o complexo EuTc foi o que apresentou perspectivas promissoras na quantificação de LDL e LDL oxidada. / This work presents the optical properties of europium complexes - Tetracyclines (EuTcs) in the presence of LDL and oxidized LDL with potential applications in clinical analysis. Four elements were chosen from the Tetracyclines family: Tetracycline (Tc), Chlortetracycline (CTc), Metatetraciclina (MTc) and Oxytetracycline (OTc) to be part of complexes with europium ion. The best conditions to form the complex efficiently were determined through measurements of optical parameters such as absorption, emission and lifetime. The best concentrations of europium complexes in EuTcs and possible influences of inorganic ions normally present in blood plasma were also analyzed. The samples were prepared at neutral pH and the visible luminescence of lanthanide was detected after resting time of the samples of 15 minutes. These results showed that the molecules of LDL and oxidized LDL have an important role in increase of the emission intensity for Tcs complexes . The measurements performed with the complex EuTcs showed no shifts in the wavelengths of the absorption and emission spectra in the presence of LDL, which demonstrates the absence of direct interaction between the molecules of Tcs and the molecules of LDL and oxidized LDL. However, the europium ion can interact at different sites of the tetracyclines molecules which differed the emission intensity of each complex. Comparing the results obtained between the complexes EuTcs, the complex EuTc is the one that presented the promising prospects in the quantification of LDL and oxidized LDL.

A alveolite seca é uma das complicações pós-operatórias mais comuns e sintomáticas na exodontia, porém, até o momento não possui um protocolo de tratamento definido. A oxitetraciclina (OTC) é um antibiótico de amplo espectro utilizado no tratamento de múltiplas infecções. Entretanto, nos últimos anos as tetraciclinas de primeira geração, tais como a OTC, têm sido evitadas devido ao surgimento de microrganismos resistentes. Afortunadamente, nos últimos anos tem se observado uma tendência contrária graças às medidas de controle no uso de antibióticos. Sistemas de liberação controlada podem evitar o desenvolvimento de resistência bacteriana e diminuir o risco de efeitos adversos. Este estudo teve como objetivo preparar uma nanofibra polimérica de policaprolactona e oxitetraciclina (PCL/OTC), e ainda avaliar suas propriedades físicas e biológicas in vitro e in vivo, visando seu futuro uso no tratamento da alveolite seca. As nanofibras poliméricas carregadas com OTC foram preparadas pelo sistema de eletrofiação, caracterizadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e avaliadas sobre seu perfil de liberação do fármaco. A atividade antibacteriana da nanofibra sobre um biofilme misto de Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermédia, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Streptococcus sanguis e Aggregatibacter actinomycetemcomitans foi analisada mediante a contagem das unidades formadoras de colônias viáveis após os tempos de contato de 1, 4, 24, 30 e 48 h. O processo de reparo alveolar induzido pela nanofibra PCL/OTC foi avaliado de forma histomorfológica e histomorfométrica após o tratamento da alveolite seca em molares de ratos, e comparado ao tratamento com nanofibras de PCL pura e Alvogyl®, 7, 14 e 21 dias após a exodontia. Finalmente, foi realizada a identificação e contagem de osteoclastos através da marcação da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP), nos mesmos tempos de avaliação. As nanofibras PCL/OTC apresentaram orientação randômica em camadas e morfologia multiforme. O perfil de liberação do sistema apresentou um efeito de explosão nas primeiras 8 horas, seguido por um período de liberação lenta e prolongada da OTC. A nanofibra PCL/OTC (132 ?g de OTC/mL) reduziu mais de 50% das colônias do biofilme nas primeiras horas de liberação, seguido por um período de manutenção em que a porcentagem de colônias bacterianas permaneceu baixa. O grupo tratado com PCL/OTC apresentou a maior porcentagem de tecido conjuntivo no 7º dia (p<0,05) e maior porcentagem de osso neoformado no 14º e 21º dias após a exodontia (p<0,05), em comparação aos outros grupos. O tratamento de alveolite seca com a fibra PCL/OTC permitiu a regeneração tecidual do alvéolo quase em sua totalidade até o 21º dia, sendo que a cronologia de regeneração tecidual com este material foi mais rápida do que com a fibra de PCL pura, e esta última mais rápida que do que o controle positivo Alvogyl®. O grupo PCL/OTC apresentou uma quantidade menor (p<0,05) de osteoclastos por área em relação aos outros grupos nos três tempos experimentais. O perfil de liberação prolongando de OTC e as propriedades biológicas relevantes apresentadas pela nanofibra PCL/OTC, sugerem que esta poderia ser considerada uma alternativa para o tratamento da alveolite seca. / Dry socket is one of the most common and symptomatic postoperative complications in tooth extraction, however, to date, it does not have an established treatment protocol. Oxytetracycline (OTC) is a broad-spectrum antibiotic, employed in the treatment of multiple infections. Nevertheless, in the last few years, first-generation tetracyclines such as OTC, have been avoided due to the development of resistant microorganisms. Fortunately, in recent years there has been a contrary trend thanks to control measures in the use of antibiotics. Controlled release systems can prevent the development of bacterial resistance and decrease the risk of adverse effects. This study aimed to prepare a polymeric nanofiber of polycaprolactone and oxytetracycline (PCL/OTC), and to evaluate its physical and biological properties in vitro and in vivo, aiming its use in the treatment of dry socket at the future. The OTC-charged polymeric nanofibers were prepared by electrospinning, and characterized by scanning electron microscopy (SEM) and drug release profile evaluation. The antibacterial activity of the nanofiber over a mixed biofilm containing Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Streptococcus sanguis, and Aggregatibacter actinomycetemcomitans was analyzed by counting the viable colony-forming units after 1, 4, 24, 30 and 48 h of contact. The alveolar repair process induced by the PCL/OTC nanofiber was evaluated histomorphologically and histomorphometrically after the treatment of dry socket in rat molars, and compared to the treatment with plain PCL nanofibers and AlvogylTM, 7, 14 and 21 days after extraction. Finally, the identification and counting of osteoclasts were performed through the tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining, at the same evaluation time points. PCL/OTC nanofibers presented random orientation in layers and multiform morphology. The release profile of the PCL/OTC system showed a burst effect within the first 8 hours, followed by a prolonged slow release period. The PCL/OTC nanofiber at a concentration of 132 ?g OTC/mL reduced more than 50% of the biofilm colonies in the first few hours of release, followed by a maintenance period in which the percentage of bacterial colonies remained low. The PCL/OTC group presented the highest percentage of connective tissue on the 7th day (p<0.05), and of newly formed bone on the 14th and 21st days (p<0.05) after dental extraction, compared to the other groups. The treatment of dry socket with the PCL/OTC fiber allowed almost complete tissue regeneration up to the 21st day, and the chronology of tissue regeneration with this material was faster than with the plain PCL fiber, and the latter was more rapid than the positive control AlvogylTM. The PCL/OTC group presented a lower amount (p<0.05) of osteoclasts per area than the other two groups in the three experimental periods. The prolonged release profile of OTC and the relevant biological properties presented by the PCL/OTC nanofibers suggest that these may be considered as an alternative treatment of dry socket.

IIntrodução A utilização excessiva de antimicrobianos na medicina humana, veterinária e agricultura resultou no aparecimento da resistência bacteriana. Este fenômeno gera problemas de saúde pública que podem resultar na reemergência de doenças infecciosas. O uso de antibióticos, principalmente de forma profilática, tornou-se prática na aquicultura, como ocorre no Brasil, onde a regulamentação para o uso de medicamentos veterinários é ineficiente. Além disso, há evidências da transferência de organismos resistentes para humanos por meio do consumo de produtos de origem animal, quando, durante a fase de criação e produção destes foram administrados antibióticos. Objetivo Pesquisar a ocorrência de genes de resistência a antibióticos em filés de tilápia comercializados em supermercados do município de São Paulo SP. Material e Métodos Foram coletadas 10 amostras de filé de tilápia e realizada a pesquisa de coliformes termotolerantes como indicadores das condições higiênico-sanitárias do alimento. Em seguida, as amostras foram inoculadas em Caldo Lúria 0,5 por cento e o DNA total das bactérias cultivadas nesse meio foi extraído por meio de choque térmico para pesquisa de genes de resistência aos antibióticos -lactâmicos e tetraciclinas pela PCR. Os genes identificados pela PCR foram confirmados pelo sequenciamento. Resultados Em 100 por cento das amostras analisadas o resultado para coliformes termotolerantes foi < 3 NMP.g-1. Na pesquisa de genes de resistência a -lactâmicos, o gene blaOXY-5 foi detectado em 90 por cento das amostras, blaTEM-1b em 20 por cento , blaLEN-16 em 10 por cento , blaSHV-28 em 10 por cento , blaKPC-2 em 20 por cento , blaMOX-6 em 10 por cento e blaCphA em 60 por cento . Os genes de resistência a tetraciclinas identificados foram tetB em 10 por cento das amostras, tetC em 20 por cento , tetD em 80 por cento , tetE em 50 por cento , tetG em 60 por cento , tetO e tetS em 10 por cento cada e tetW em 20 por cento . Conclusões Em 90 por cento das amostras foi identificada a presença de genes de resistência aos antibióticos -lactâmicos e tetraciclinas, demonstrando uma grande circulação de resistência bacteriana na aquicultura e verificando a necessidade de legislação e fiscalização mais atuantes no controle do uso de antibióticos na aquicultura / IIntroduction The excessive use of antimicrobials in human medicine, veterinary medicine and agriculture has resulted in the emergence of bacterial resistance. This phenomenon creates public health problems that may result in the re-emergence of infectious diseases. The use of antibiotics, mainly prophylactically, has become a practice in aquaculture, including Brazil, where the legislation for the use of veterinary drugs is inefficient. Furthermore, there is evidence of transmission of resistant organisms to humans through consumption of animal products, especially when the antibiotics have been administered during the raising and production of these animals. Objective To search for the occurrence of antibiotics resistance genes in tilapia fillets commercialized in supermarkets in São Paulo city - SP. Material and Methods 10 tilapia fillet samples were collected and submitted to fecal coliform search as an indicator of the sanitary conditions of the food. Then, the samples were inoculated into Luria broth 0,5 per cent and the total DNA was extracted from growing bacteria by thermal shock for the search of resistance genes to -lactam and tetracyclines antibiotics by PCR. The genes identified by PCR were confirmed by sequencing. Results In 100 per cent of samples the result was < 3 NMP.g-1 for fecal coliform organisms. In the study of -lactam resistance genes, blaOXY-5 gene was detected in 90 per cent of samples, blaTEM-1b in 20 per cent , blaLEN-16 in 10 per cent , blaSHV-28 in 10 per cent , blaKPC-2 in 20 per cent , blaMOX-6 in 10 per cent and blaCphA in 60 per cent . The tetracyclines resistance genes identified were tetB in 10 per cent of samples, tetC in 20 per cent , tetD in 80 per cent , tetE in 50 per cent , tetG in 60 per cent , tetO and tetS in 10 per cent each and tetW in 20 per cent . Conclusions 90 per cent of the samples showed the presence of -lactam and tetracyclines resistance genes, demonstrating a high circulation of bacterial resistance in aquaculture and verifying the need for more active law and surveillance in controlling the use of antibiotics in aquaculture.

IIntrodução A utilização excessiva de antimicrobianos na medicina humana, veterinária e agricultura resultou no aparecimento da resistência bacteriana. Este fenômeno gera problemas de saúde pública que podem resultar na reemergência de doenças infecciosas. O uso de antibióticos, principalmente de forma profilática, tornou-se prática na aquicultura, como ocorre no Brasil, onde a regulamentação para o uso de medicamentos veterinários é ineficiente. Além disso, há evidências da transferência de organismos resistentes para humanos por meio do consumo de produtos de origem animal, quando, durante a fase de criação e produção destes foram administrados antibióticos. Objetivo Pesquisar a ocorrência de genes de resistência a antibióticos em filés de tilápia comercializados em supermercados do município de São Paulo SP. Material e Métodos Foram coletadas 10 amostras de filé de tilápia e realizada a pesquisa de coliformes termotolerantes como indicadores das condições higiênico-sanitárias do alimento. Em seguida, as amostras foram inoculadas em Caldo Lúria 0,5 por cento e o DNA total das bactérias cultivadas nesse meio foi extraído por meio de choque térmico para pesquisa de genes de resistência aos antibióticos -lactâmicos e tetraciclinas pela PCR. Os genes identificados pela PCR foram confirmados pelo sequenciamento. Resultados Em 100 por cento das amostras analisadas o resultado para coliformes termotolerantes foi < 3 NMP.g-1. Na pesquisa de genes de resistência a -lactâmicos, o gene blaOXY-5 foi detectado em 90 por cento das amostras, blaTEM-1b em 20 por cento , blaLEN-16 em 10 por cento , blaSHV-28 em 10 por cento , blaKPC-2 em 20 por cento , blaMOX-6 em 10 por cento e blaCphA em 60 por cento . Os genes de resistência a tetraciclinas identificados foram tetB em 10 por cento das amostras, tetC em 20 por cento , tetD em 80 por cento , tetE em 50 por cento , tetG em 60 por cento , tetO e tetS em 10 por cento cada e tetW em 20 por cento . Conclusões Em 90 por cento das amostras foi identificada a presença de genes de resistência aos antibióticos -lactâmicos e tetraciclinas, demonstrando uma grande circulação de resistência bacteriana na aquicultura e verificando a necessidade de legislação e fiscalização mais atuantes no controle do uso de antibióticos na aquicultura / IIntroduction The excessive use of antimicrobials in human medicine, veterinary medicine and agriculture has resulted in the emergence of bacterial resistance. This phenomenon creates public health problems that may result in the re-emergence of infectious diseases. The use of antibiotics, mainly prophylactically, has become a practice in aquaculture, including Brazil, where the legislation for the use of veterinary drugs is inefficient. Furthermore, there is evidence of transmission of resistant organisms to humans through consumption of animal products, especially when the antibiotics have been administered during the raising and production of these animals. Objective To search for the occurrence of antibiotics resistance genes in tilapia fillets commercialized in supermarkets in São Paulo city - SP. Material and Methods 10 tilapia fillet samples were collected and submitted to fecal coliform search as an indicator of the sanitary conditions of the food. Then, the samples were inoculated into Luria broth 0,5 per cent and the total DNA was extracted from growing bacteria by thermal shock for the search of resistance genes to -lactam and tetracyclines antibiotics by PCR. The genes identified by PCR were confirmed by sequencing. Results In 100 per cent of samples the result was < 3 NMP.g-1 for fecal coliform organisms. In the study of -lactam resistance genes, blaOXY-5 gene was detected in 90 per cent of samples, blaTEM-1b in 20 per cent , blaLEN-16 in 10 per cent , blaSHV-28 in 10 per cent , blaKPC-2 in 20 per cent , blaMOX-6 in 10 per cent and blaCphA in 60 per cent . The tetracyclines resistance genes identified were tetB in 10 per cent of samples, tetC in 20 per cent , tetD in 80 per cent , tetE in 50 per cent , tetG in 60 per cent , tetO and tetS in 10 per cent each and tetW in 20 per cent . Conclusions 90 per cent of the samples showed the presence of -lactam and tetracyclines resistance genes, demonstrating a high circulation of bacterial resistance in aquaculture and verifying the need for more active law and surveillance in controlling the use of antibiotics in aquaculture.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los antimicrobianos en animales productivos son la principal herramienta terapéutica para combatir enfermedades bacterianas, sin embargo su uso incorrecto puede derivar en la presencia de residuos en los productos y subproductos de origen animal. Cuando sobrepasan los Límites Máximos Residuales (LMR) son un riesgo para la salud de la población y una causa del aumento de la resistencia microbiana. Las plumas como subproducto son utilizadas en piensos y según estudios previos acumulan residuos antimicrobianos, de esta forma son una ruta de reingreso de residuos antimicrobianos a través de la cadena alimentaria. Para comparar concentraciones presentes de tetraciclinas en plumas con las de los tejidos, es imprescindible la validación de las metodologías analíticas implementadas para la detección de Tetraciclinas en estas matices por lo cual el objetivo del estudio fue validar metodologías analíticas mediante cromatografía liquida acoplado a detector de masas (LC-MS/MS) para detectar y cuantificar Oxitetraciclina, Clortetraciclina y sus metabolitos activos en plumas, músculo e hígado. Se utilizaron 20 pollos broiler criados con una dieta libre de antimicrobianos. El análisis fue mediante LC-MS/MS, utilizando columnas de extracción en fase sólida OASISTM HLB y sep-pak C18. Los resultados indican que las metodologías implementadas son válidas ya que cumplen con los criterios descritos por la FDA: VICH GL49 y la Directiva 2002/657/CE, siendo precisas, selectivas y lineales. Todas las curvas presentaron un coeficiente de determinación (R2) >0,95 y una recuperación para todos los analitos mayor a 90%. Mediante las metodologías validadas es posible detectar y cuantificar tetraciclinas, en las tres matrices con un límite de detección de 20 μg/kg-1 / Antimicrobials in livestock are the main therapeutic tool for the combat of bacterial diseases, however the inadequate use may result in the presence of residues in animal edible and non-edible (byproducts) tissues. When exceeding Maximum Residue Limit (MRL) are a risk to the health of the population and a cause of increased antimicrobial resistance. Among the byproduct, feathers are used in feed and according to previous studies can accumulate antimicrobial residues, in this way is a route re-entry of antimicrobial residues via food chain. To compare concentrations of tetracycline present in feathers with tissue, it is essential to validate analytical methodologies implemented for the detection of tetracyclines in these matrices, so the aim of the study was to validate analytical methodologies by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) to detect and quantify Oxytetracycline, Chlortetracycline and it's metabolites in feathers, muscle and liver. 20 broiler chickens were used, raised with a diet free of antibiotics. The analysis was made by LC-MS / MS, using columns of solid phase extraction OASISTM HLB and sep-pak C18. The results indicate that the implemented methods are valid because they meet the criteria described by the FDA: VICH GL49 and Directive 2002/657 / EC, to be precise, selective and linear. All curves showed a coefficient of determination (R2)> 0.95 and a recovery for all analytes greater than 90%. By validated methods can detect and quantify Tetracyclines, in the three matrices with a detection limit of 20 mg / kg-1 / Financiamiento: Proyecto Fondo de Investigación en Ciencias Veterinarias (FIV) 2013.