El objetivo general fue la construcción de una inmunoglobulina reportera y su expresión en plantas a fin de evaluar la factibilidad de generar un reportero funcional. Los objetivos específicos fueron: Objetivo 1: Diseñar y construir una fusión del gen codificante para la cadena liviana del anticuerpo 14D9 a proteínas fluorescentes (kappa-PF). Objetivo 2: Estudiar la síntesis y localización subcelular de la fusión Kappa-PF por expresión temporal. Objetivo 3: Estudiar la síntesis y localización subcelular de la fusión Kappa-PF en presencia de la cadena pesada.

El objetivo principal de esta tesis consiste en la obtención de anticuerpos recombinantes frente a los fungicidas azólicos tetraconazol, hexaconazol e imazalil, y su aplicación en la determinación de residuos de estos fungicidas en muestras agroalimentarias. Para ello, en primer lugar, se han aplicado técnicas de biología molecular para la obtención de los fragmentos recombinantes scFv (single chain fragment variable) a partir del material genético de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente a los fungicidas tetraconazol, hexaconazol e imazalil. Posteriormente, dichos fragmentos se han expresado en sistemas bacterianos empleando vectores de expresión plasmídicos. Por otro lado, se ha optimizado un sistema de cribado y selección de colonias bacterianas productoras de fragmentos de anticuerpos recombinantes capaces de reconocer a los plaguicidas en estudio. Este sistema está basado en ELISAs simultáneos, competitivos y no competitivos, de la fracción soluble del anticuerpo recombinante. Finalmente, en el caso de los anticuerpos frente a hexaconazol e imazalil, se ha aplicado un protocolo de enriquecimiento cíclico denominado panning, basado en la tecnología de presentación de moléculas proteicas en la superficie de fagos (phage display). De este modo, se han obtenido anticuerpos recombinantes a partir de cada hibridoma productor de anticuerpos monoclonales. Cada anticuerpo recombinante se ha expresado tanto en su forma de proteína libre (scFv) como en forma de proteína de fusión (scFv-pIII). De igual modo, se han empleado técnicas de biología molecular para la generación de bibliotecas de fragmentos recombinantes scFv a partir del material genético de linfocitos de ratones inmunizados frente a cada uno de los tres fungicidas. En este caso, se han optimizado las condiciones tanto de la etapa de construcción de bibliotecas como del posterior proceso de enriquecimiento por panning. / Plana Andani, E. (2010). Selección y caracterización de anticuerpos recombinantes para fungicidas. Aplicación al desarrollo de técnicas inmunoanalíticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8477

Plum pox virus (PPV) es miembro del género Potyvirus, causa la enfermedad de la sharka que tiene un serio impacto agrícola y económico sobre el cultivo de frutales de hueso. Puesto que la utilización de variedades resistentes es la estrategia más duradera y definitiva en la lucha contra virosis de plantas. El objetivo general de esta tesis doctoral sería evaluar la expresión de anticuerpos recombinantes específicos de proteínas de PPV para interferir o inmunomodular la infección viral y servir así como estrategia para obtener resistencia. Para ello se ha utilizado el fragmento de anticuerpo recombinante scFv2A (del inglés "single chain Fv variable fragment) que reconoce específicamente a la proteína NIb replicasa de PPV. Esta proteína se localiza principalmente en el núcleo de células de plantas infectadas, aunque su función de replicación, presumiblemente, tiene lugar en estructuras membranosas derivadas del retículo endoplásmico (RE) en el citoplasma. Se transformaron plantas de Nicotiana benthamiana con tres versiones del fragmento recombinante scFv2A dirigidas a diferentes compartimentos celulares. Una versión citosólica (scFv2A), una versión nuclear (NLS-scFv2A) y otra dirigida a membranas del RE (6K2-scFv2A) por la cara citosólica. Se obtuvieron diversas líneas transgénicas: líneas A, líneas N y líneas K transformadas respectivamente con las construcciones scFv2A, NLS-scFv2A y 6K2-scFv2A. Se realizaron ensayos independientes de desafío, mediante inoculación mecánica con extractos de plantas infectadas con virus o bien inoculando con un clon recombinante de PPV fusionado a GFP (PPV-GFP). Tras los ensayos, se comprobó que las plantas de las diversas líneas transgénicas de N. benthamiana que expresaban los fragmentos scFv2A, 6K2scFv2A o NLSscFv2A presentaban diferentes grados de protección frente a la infección por PPV. Además, se determinó que varias de las líneas transgénicas, tanto líneas A como K y N, presentaban porcentajes de infección significativamente m / Gil Capitán, MT. (2010). Inmunomodulación de la infección de Plum pox virus mediante la expresión estable y transitoria de anticuerpos recombinantes contra la NIb replicasa viral en plantas de Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34204