Plum pox virus (PPV) es miembro del género Potyvirus, causa la enfermedad de la sharka que tiene un serio impacto agrícola y económico sobre el cultivo de frutales de hueso. Puesto que la utilización de variedades resistentes es la estrategia más duradera y definitiva en la lucha contra virosis de plantas. El objetivo general de esta tesis doctoral sería evaluar la expresión de anticuerpos recombinantes específicos de proteínas de PPV para interferir o inmunomodular la infección viral y servir así como estrategia para obtener resistencia. Para ello se ha utilizado el fragmento de anticuerpo recombinante scFv2A (del inglés "single chain Fv variable fragment) que reconoce específicamente a la proteína NIb replicasa de PPV. Esta proteína se localiza principalmente en el núcleo de células de plantas infectadas, aunque su función de replicación, presumiblemente, tiene lugar en estructuras membranosas derivadas del retículo endoplásmico (RE) en el citoplasma. Se transformaron plantas de Nicotiana benthamiana con tres versiones del fragmento recombinante scFv2A dirigidas a diferentes compartimentos celulares. Una versión citosólica (scFv2A), una versión nuclear (NLS-scFv2A) y otra dirigida a membranas del RE (6K2-scFv2A) por la cara citosólica. Se obtuvieron diversas líneas transgénicas: líneas A, líneas N y líneas K transformadas respectivamente con las construcciones scFv2A, NLS-scFv2A y 6K2-scFv2A. Se realizaron ensayos independientes de desafío, mediante inoculación mecánica con extractos de plantas infectadas con virus o bien inoculando con un clon recombinante de PPV fusionado a GFP (PPV-GFP). Tras los ensayos, se comprobó que las plantas de las diversas líneas transgénicas de N. benthamiana que expresaban los fragmentos scFv2A, 6K2scFv2A o NLSscFv2A presentaban diferentes grados de protección frente a la infección por PPV. Además, se determinó que varias de las líneas transgénicas, tanto líneas A como K y N, presentaban porcentajes de infección significativamente m / Gil Capitán, MT. (2010). Inmunomodulación de la infección de Plum pox virus mediante la expresión estable y transitoria de anticuerpos recombinantes contra la NIb replicasa viral en plantas de Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34204 / Palancia

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T04:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bismara_BeatrizAparecidaPassos_M.pdf: 3138714 bytes, checksum: 1bf8ed00aa70e66a625bf970d08a27e9 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Investigamos a presença de mutações em crianças infectadas verticalmente pelo vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) que conferem resistência aos agentes antiretrovirais. Amostras de sangue periférico foram coletadas de sessenta e seis pacientes em seguimento no do Ambulatório de Pediatria do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas. A partir de leucócitos destas amostras foi extraído o DNA, após diversas lavagens e precipitações. Foi preparado um Mix para 20 reações contendo 100µl de Buffer (50 mM de cloreto de potássio; 20 mM de Tris-HCl - pH 8,4); 100 µl de cloreto de magnésio (25mM); 12µl da mistura desoxirribonucléica - dNTPs (dATP, dGTP, dCTP; dTTP) a 25mM, 10µl de cada ¿primer¿ (25pmoles/µl); 0,5µl de Taq DNA polimerase e 0,5 µl do DNA a ser estudado, para a realização da PCR. As condições da reação foram: Desnaturação: 95ºC - 3 minutos; Anelamento: 55ºC ¿ 1 minuto; Extensão: 72ºC - 1 minuto (3 ciclos). Desnaturação: 95ºC ¿ 1 minuto; Anelamento: 55ºC ¿ 45 segundos; Extensão: 72ºC ¿ 1 minuto e Extensão final: 72ºC por 10 minutos (35 ciclos). As bandas foram visulizadas em gel de agarose 1%, obtendo-se uma banda de 1008 pares de bases. Os produtos selecionados foram submetidos a seguinte reação de seqüenciamento: 1,0 µl do produto da PCR; 4,0 µl de Premix (Amersham); 1,0 µl de primer 5 µM; Completar com dH2O para 10,0 µl de reação. Após a amplificação, os fragmentos foram analisados pelo Software MegaBACE¿ Sequence Analyzer, em seguida alinhados e comparados com o banco de dados público (GenBank), com o vírus selvagem, e com o programa Phred, Phrap, Consed. As principais mutações encontradas no gene da Transcriptase reversa foram: M184V(42,6%), M41L (39,3%), D67N (27,9%), T215Y (26,2%) e K70R (18%). No gene da Protease as principais encontradas foram: L63P (42,6%), L90M e M36I (32,8%), V77I (29,5%), I93L (24,6%), V82A (16,4%), I54V (14,8%) e K20R (13,1%). Concluímos que este método é muito eficaz para análise das seqüências, auxiliando na observação das mutações. Este exame deveria ser implantado na rotina para os pacientes portadores deste vírus, pois auxiliaria os clínicos na escolha de uma terapia ideal para cada paciente. As crianças que apresentavam estas mutações associadas às drogas antiretrovirais estavam com o quadro clínico afetado e a maioria dos esquemas terapêuticos não reduziam a carga viral em níveis desejáveis / Abstract: In this work our purpose was to determine the subtype, prevalence of drug-resistance mutations, and assess genotypic profiles in HIV-1 infected children under antiretroviral treatment, from Campinas, São Paulo, Brazil. Blood samples from sixty six vertically human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infected Brazilian children were studied for antiretroviral drug resistance. Combination therapy with protease (PR) and reverse transcriptase (RT) inhibitors can efficiently supress human immunodeficiency virus (HIV) replication, but the emergence of drug resistance variants correlates strongly with therapeutic failure1. DNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMc) samples, and a 1.0 kb fragment containing HIV-1PR and RT-coding sequence were amplified by Nested Polymerase Chain Reaction, sequencing and subtyping. The HIV-1 subtyping based on the polymerase (pol) gene sequences (protease and reverse transcriptase-RT regions) was as follow: subtype B (83,6%), subtype F (9,8%) and B/F viral recombinant forms (6,6%). We found fifty five sequences presented significant mutations and thirty five presented common polymorphism conferring resistance to protease inhibitors (PIs). Forty one presented mutations associated with resistant to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs). The entire viral protease and codons 1 to 219 of the reverse transcriptase gene from 61 HIV-1 isolates were amplified and sequenced for genotyping. Two major protease inhibitor-resistance associated mutations, M36I and L90M, were most prevalent in our samples (32,8%) and the polymorphism L69P (42,6%). Minor mutation were also found at the protease gene: V77I (29,5%), V82A (16,4%), I93L (24,6%), I54V (14,8%), K20R (13,1%). Many mutations associated with reduced susceptibility to nucleoside or non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors were detected: M41L (39,3%), M184V (42,6%), D67N (27,9%), T215Y (26,2%), L210W (21%), K70R (18%) and E44D (11,5%). This study demonstrated that 98,3% of the studied population from the Campinas, showing evidences of therapy failure, presented viral genomic mutations associated with drug resistance. The main antiretroviral to which this population showed resistance were PI nelfinavir (54%), and ritonavir with lopinavir (18%), and the NNRTIs efavirenz (18%) and nevirapine (3,2%), and the NRTIs zidovudine (60,6%), didanosine (47,5%), lamivudine (45,9%). Ninety-eight percent of patients under antiretroviral therapy and with high viral load counts showed resistance to at least one of the antiretroviral analyzed. / Mestrado / Mestre em Farmacologia