Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímico / El cobre es un micronutriente esencial, pero a altas concentraciones puede inducir la síntesis de especies reactivas de oxígeno (ROS), causando una condición de estrés oxidativo. En sitios costeros contaminados por cobre, prevalecen sólo algunas especies de macroalgas, como Scytosiphon lomentaria y Ulva compressa, las que presentan mecanismos eficientes de tolerancia al metal. Contrariamente, la macroalga parda Lessonia nigrescens, ecológicamente importante en la zona intermareal, se encuentra ausente en sitios contaminados por cobre y presenta mecanismos de tolerancia al metal insuficientes. Recientemente, en Scytosiphon gracilis, macroalga parda que presenta mecanismos de tolerancia similares a los descritos en S. lomentaria, se identificaron proteínas involucradas en la tolerancia al estrés por cobre, entre las que se encuentran las peroxirredoxinas (PRXs), enzimas capaces de reducir peróxido de hidrógeno, alquilhidroperóxidos y peroxinitritos, escasamente estudiadas en macroalgas. Estas enzimas reaccionan a bajas concentraciones de peróxidos en comparación a otras enzimas como catalasa y son susceptibles a inactivación a elevadas concentraciones de peróxidos. En el presente trabajo, se estudió la activación PRXs en respuesta al estrés oxidativo generado por cobre en las algas pardas S. gracilis y L. nigrescens, cultivadas en presencia de concentraciones crecientes del metal (5 a 100 μg Cu L-1, más un control sin adición de cobre) durante 96 h. Se evaluó marcadores de daño oxidativo, como la generación de lipoperóxidos y la pérdida de eficiencia máxima del fotosistema II (Fv/Fm). Adicionalmente, se realizó estudios de inmunofluorescencia para detectar PRXs en ambas especies. Los resultados indicaron que las PRXs mostraron afinidad tanto por peróxido de hidrógeno como por ter-butil hidroperóxido como sustratos y se observó un aumento de la actividad usando DTT como agente reductor a partir de 5 μg Cu L-1. Los niveles de actividad PRX en S. gracilis fueron superiores a los de L. nigrescens en todas las concentraciones del metal evaluadas e incluso en individuos no expuestos al metal (i.e. actividad basal). Los valores máximos de actividad PRX se registraron en 40 μg Cu L-1 en S. gracilis y en 10 μg Cu L-1 en L. nigrescens. En ambas especies se detectó un aumento de la actividad PRX acoplada a tiorredoxina, pero la actividad PRX acoplada a glutarredoxina sólo aumentó en S. gracilis. Se observó inhibición de la actividad PRX a partir de 20 μg Cu L-1 en L. nigrescens y en S. gracilis a partir de 100 μg Cu L-1. Este fenómeno coincidió en ambas especies con un aumento de lipoperóxidos, lo que sugiere que las PRXs controlarían los niveles de lipoperóxidos generados por estrés oxidativo. Respecto a la medición de eficiencia fotosintética, si bien se observó un efecto del cobre sobre los fotosistemas en ambas especies, resultó ser un parámetro menos sensible que los lipoperóxidos y no hubo diferencias a nivel global entre las especies. Análisis de inmunofluorescencia mostraron que en L. nigrescens no variaron los niveles proteicos de PRX en individuos tratados con 10 y 100 μg Cu L-1 respecto a su control y que en S. gracilis aumentan los niveles proteicos de PRX en individuos tratados con 40 μg Cu L-1 y disminuye en 300 μg Cu L-1, coincidiendo con los resultados de actividad enzimática. Los resultados sugieren que las PRXs participan en la tolerancia al estrés por cobre, actuando como una barrera antioxidante, siendo más eficientes en S. gracilis que en L. nigrescens. La actividad de las PRXs en S. gracilis ayuda a explicar funcionalmente la capacidad de esta especie de tolerar ambientes contaminados con altos niveles de cobre, mediante la reducción de peróxidos y posiblemente mediante el control de vías de señalización redox, que regulan la adaptación de esta especie a sitios contaminados por cobre. En el caso de L. nigrescens, la pérdida de actividad de las PRXs frente a bajas concentraciones de cobre ayudaría a explicar el grave daño celular que se genera en esta especie y, a nivel ecológico, el impedimento que esto le genera para colonizar ambientes contaminados por el metal. / Copper is an essential micronutrient, but at high concentrations can induce the synthesis of reactive oxygen species (ROS), generating a condition of oxidative stress. In coastal copper-impacted sites, prevail only a few species of macroalgae, such as Scytosiphon lomentaria and Ulva compressa, which have efficient metal tolerance mechanisms. Conversely, the brown seaweed Lessonia nigrescens, environmentally important in the intertidal zone, is absent from copper-impacted sites and presents insufficient metal tolerance mechanisms. Recently, in Scytosiphon gracilis, brown seaweed that presents similar tolerance mechanisms to those described in S. lomentaria, proteins involved in tolerance to copper-induced stress were identified, among them, peroxiredoxins (PRXs). These enzymes are capable to reduce hydrogen peroxide, alkylhydroperoxides and peroxynitrites, and have been poorly studied in macroalgae. These enzymes react at low concentrations of peroxides in comparison to other enzymes such as catalase and are susceptible to inactivation at high concentrations of peroxides. In this work, the PRX activation was studied in response to copper-induced oxidative stress in brown algae S. gracilis and L. nigrescens cultured with increasing concentrations of the metal (5 to 100 μg Cu L-1, and a control without copper addition) for 96 hours. Oxidative damage markers, such as the generation of lipoperoxides and loss of photosystem II efficiency (Fv/Fm) were evaluated. Additionally, an immunofluorescence study was carried out in order to detect PRXs in both species. The results indicated that the PRXs showed affinity for both hydrogen peroxide and ter-butyl hydroperoxide as substrates, and an increase in activity was observed using DTT as a reducing agent from 5 μg Cu L- 1. PRX activity in S. gracilis was superior to L. nigrescens in all the copper concentrations assessed and even in individuals not exposed to the metal (i.e. basal activity). The maximum values of PRX activity occurred at 40 μg Cu L-1 in S. gracilis and at 10 μg Cu L- 1 in L. nigrescens. An increase of PRX activity coupled to thioredoxin was detected in both species, but PRX activity coupled to glutaredoxin only increased in S. gracilis. It was observed loss of PRX activity from 20 μg Cu L- 1 in L. nigrescens and S. gracilis from 100 μg Cu L-1. This phenomenon coincided in both species with an increase of lipoperoxides, which suggests that the PRXs would control the levels of oxidative stress-generated lipoperoxides. Respect to the measurement of photosytem II efficiency, while an effect of copper on the photosystems in both species was observed, this marker was less sensitive than the lipoperoxides and there was no overall differences between the species. Immunofluorescence analysis showed that in L. nigrescens treated with 10 and 100 μg Cu L-1 PRX levels did not suffer any change respect to the control. In S. gracilis there was an increase of PRX levels in individuals treated with 40 μg Cu L- 1 and a decrease at 300 μg Cu L-1, coinciding with the results of enzymatic activity. The results suggest that the PRXs are involved in tolerance to copper-induced stress, acting as an antioxidant barrier, being more efficient in S. gracilis than in L. nigrescens. The PRX activity in S. gracilis helps to explain the ability of this species to tolerate copper-enriched environments, through the reduction of peroxides and possibly through the control of redox signaling pathways that regulate the adaptation of this species to polluted sites. In the case of L. nigrescens, the loss of activity of the PRXs at low copper concentrations would help to explain the severe cellular damages that occur in this species, and ecologically, the impediment of L. nigrescens to colonize copper-enriched environments. / Conicyt; Fondecyt

La mancha bacteriana causada por el patógeno Pseudomonas syringae pv. tomato (P. s. tomato) es una de las enfermedades más devastadoras del cultivo del tomate. En este trabajo se demuestra que la sola inhibición de la expresión del gen Ep5C, que codifica una peroxidasa catiónica extracelular, es suficiente para conferir una marcada resistencia a P.s. tomato. Esta inhibición encontrada en las plantas de tomate produce una resistencia que no requiere la activación de las rutas de defensa descritas hasta ahora, controladas por el ácido salicílico y el ácido jasmónico. Así, la inhibición de este gen constituye una nueva herramienta genética para obtener plantas transgénicas resistentes a esta enfermedad. La temprana inducción del gen Ep5C está mediada por el H2O2, una especie reactiva de oxígeno generada durante el curso de u interacciones planta-patógeno. Los mecanismos que controlan la resistencia de las plantas a patógenos necrotrofos constituye uno de los aspectos menos estudiados en la actualidad. La búsqueda de nuevos componentes genéticos que participan en la cascada de señalización de las plantas frente a patógenos constituye uno de los retos de la biología molecular moderna. En este trabajo llevamos a cabo un escrutinio, utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana portadoras del gen de la B-glucoronidasa (GUS) como gen marcador bajo el control del promotor del gen Ep5C, en busca de mutantes alterados en la expresión de dicho gen. En el presente trabajo presentamos la identificación y caracterización de uno de los mutantes, en concreto el mutante ocp3 (overexpressor of cationic peroxidase 3), el cual presenta expresión constitutiva del gen GUS. Las plantas ocp3 muestran una elevada acumulación de H2O2, y se caracterizan por presentar expresión constitutiva de GST1 y PDF1.2, dos genes marcadores de la respuesta defensiva, pero sin embargo no muestra expresión de PR-1, un gen marcador dependiente de la ruta del ácido salicílico (SA). La característic / Coego González, A. (2006). Análisis funcional del gen Ep5C y su implicación en los mecanismos de defensa en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1972 / Palancia