Thesis (M. Phil.)--University of Hong Kong, 2002. / Includes bibliographical references (leaves 57-64).

Submitted by VANESSA SANTOS MOURA null (vanessa_smoura@hotmail.com) on 2017-08-29T04:50:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Vanessa_Santos_Moura.pdf: 2606729 bytes, checksum: 3c16d37b47ce11933b2d1f88e4aa9b1f (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-29T18:18:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moura_vs_me_jabo.pdf: 2606729 bytes, checksum: 3c16d37b47ce11933b2d1f88e4aa9b1f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T18:18:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moura_vs_me_jabo.pdf: 2606729 bytes, checksum: 3c16d37b47ce11933b2d1f88e4aa9b1f (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O bolor verde e a podridão azeda destacam-se entre as doenças de pós-colheita em frutos cítricos, causados por Penicillium digitatum e Geotrichum citri-aurantii, diminuindo a qualidade e a quantidade dos frutos e, consequentemente, resultando em significativas perdas econômicas. Uma alternativa para controle destes fungos é através da toxinas killer produzidas por algumas espécies de levedura, capazes de matar fungos filamentosos. Saccharomyces cerevisiae produz toxinas killer proteicas que são letais para células sensíveis de levedura. Estas toxinas foram agrupadas em quatro tipos, K1, K2, K28 e Klus, codificado por elementos extra cromossomais associados a partículas virais na forma de dsRNA. Este trabalho tem como objetivo caracterizar a toxina killer de S. cerevisiae ACB-K1 e testar sua atividade antagônica em patógenos pós-colheita de citros. O isolado ACB-K1 apresentou atividade killer, sobre levedura sensível (S. cerevisae NCYC 1006) além do fitopatógeno P. digitatum, não apresentando porém inibição contra o patógeno G. citri-aurantii. A toxina apresentou máxima atividade em pH 4,1 a 22 °C, tanto para a levedura sensível quanto para o fitopatógeno P. digitatum. A toxina apresentou estabilidade em diferentes pH de 4,1 a 6,0, após a incubação de 24h a 22 °C sobre o fungo. O isolado ACB-K1 apresentou dsRNA, sendo detectadas duas formas (LA e M-dsRNA), sugerindo que a base genética para a produção da toxina é extra cromossomal, dado confirmado pela cura do fenótipo killer a 40 °C. As frações obtidas por cromatografia de exclusão molecular em gel de Sephadex G75 demonstraram características de biocontrole contra o fitopatógeno P. digitatum. / Green mold and sour rot are among post-harvest diseases in citrus fruits, caused by Penicillium digitatum and Geotrichum citri-aurantii, reducing a quality and quantity of fruits and, consequently, resulting in significant economic losses. An alternative for the control of fungi is using killer toxins produced by some species of yeasts, capable of killing filamentous fungi. Saccharomyces cerevisiae produces protein killer toxins that are lethal to yeast sensitive cells. These toxins were grouped into four types, K1, K2, K28 and Klus, encoded by extrachromosomal elements associated with viral particles in the form of dsRNA. This work aims to characterize a killer toxin of S. cerevisiae ACB-K1 and to test its antagonistic activity in post-harvest citrus pathogens. The isolate ACB-K1 showed activity killer on sensitive yeast (S. cerevisae NCYC 1006) besides the phytopathogenic P. digitatum, but did not present inhibition against the pathogen G. citri-aurantii. The killer toxin showed maximum activity at pH 4.1 at 22 ° C for both a sensitive yeast and the phytopathogenic P. digitatum. The toxin presented stability at pH range from 4.1 to 6.0, after a 24h incubation at 22 ° C on the fungus. The ACB-K1 isolate showed dsRNA and two forms were detected (LA and M-dsRNA), suggesting that a genetic basis for a toxin production is extrachromosomal, confirmed by curing the killer phenotype at 40 ° C. The fractions obtained by exclusion chromatography Sephadex G75 gel, demonstrated biocontrol characteristics against the phytopathogen P. digitatum.

published_or_final_version / Ecology and Biodiversity / Master / Master of Philosophy

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:39:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5369129 bytes, checksum: 9b335fdfaa7871edcc12363d6834d034 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The green mold, caused by Penicillium digitatum, is a major disease in the postharvest of citrus fruit. In this work the effects of alternatives to agrochemicals in the control of green mold in 'Ponkan' tangerines and 'Valencia' oranges were tested. Physiologically mature fruits were superficially wounded in the equatorial region with a tube of 9 mm in diameter filled with needles and inoculated with a conidial suspension of P. digitatum at a concentration of 1x106 conidia/mL. After air drying, they were sprayed to full wetting with distilled water (control), distilled water + 8 mL/L Tween 20, imazalil (200 mL EC/100 Magnate ® 500 L of water), thiabendazole (103 mL Tecto ® SC/100 L of water), methyl thiophanate (70 g Cercobin® 700 WP/100 L of water), chitosan 10 mL/L of water or essential oils of garlic 10 mL/L of water, clove 5 mL/L water, neem 10 mL/L of water, long pepper 5 mL/L of water and citric biomass 10 mL/L of water. To the essential oils and chitosan were added 8 mL/L Tween 20. Then the fruits were packed in groups of three in polystyrene trays and kept at 21 ± 1 º C and 85-90% RH for 8 ('Ponkan' tangerine) or 7 days ('Valencia' orange). The fruits were analyzed for incidence and severity of illness, incubation period and latent period of the fungus, loss of fresh weight and CO2 production. In the case of 'Ponkan' tangerine, citric biomass was able to reduce the incidence of 76.3% compared to the control, in the third day, and also reduce the severity in 44%, in the fourth day. For the incubation period, except for fruits treated with garlic oil, there is formation of distinct groups of averages between the control and those treated with alternative products, indicating capacity to delay the onset of symptoms. Citric biomass stood out, showing similar results to the fungicide methyl thiophanate, delaying the incubation period in a day in relation to the water. The same was observed for the latent period, in which the fruits treated with alternative products, except garlic oil, stood in a group other than the control. Although the fruits of all treatments overcome the control, imazalil was able to better maintain the turgidity of the fruit, showing the lower values of loss of fresh weight on the eighth day of evaluation (5.2%). The mass loss and CO2 production correlated positively with the incidence and severity, in other words, the largest mass losses and higher respiratory rates result from high values of incidence and severity. In the case of 'Valencia' orange, citric biomass and chitosan reduced the incidence and severity during the entire experimental period. On the seventh day after inoculation, the incidence was reduced by 73.7% and 67.4% by citric biomass and chitosan, respectively, in comparison to control water, while the severity was reduced by 59.6% and 62%, respectively. On the other hand, neem oil, long pepper oil and garlic oil were ineffective in controlling the pathogen. Imazalil and methyl thiophanate totally controlled the disease during the evaluation period. The loss of fresh weight was increasing over time, however, fruits of all treatments had acceptable values for the marketing, located in the range 3 until 5%. As for CO2 production, fungicides maintained the respiratory rate low, followed in ascending order by chitosan and subsequently by other products. Thus, the citric biomass has good potential for control of green mold on 'Ponkan', while citric biomass and chitosan are capable of controlling the disease in 'Valencia' orange. / O bolor verde, causado pelo fungo Penicillium digitatum, é uma das principais doenças na pós-colheita dos frutos cítricos. Neste trabalho foram testados os efeitos de produtos alternativos aos agroquímicos no controle do bolor verde em tangerinas Poncã e em laranjas Valência . Frutos fisiologicamente maduros foram feridos superficialmente na região equatorial com um tubo de 9 mm de diâmetro preenchido por agulhas e inoculados com uma suspensão de conídios de P. digitatum na concentração de 1x106 conídios/mL. Após a secagem ao ar, foram pulverizados até o molhamento completo com água destilada (testemunha), água destilada + 8 mL/L de tween 20, imazalil (200 mL de Magnate® 500 EC/100 L de água), thiabendazole (103 mL de Tecto® SC/100 L de água), tiofanato metílico (70 g de Cercobin® 700 WP/100 L de água), quitosana 10 mL/L de água ou óleos essenciais de alho 10 mL/L de água, cravo-da-índia 5 mL/L de água, nim 10 mL/L de água, pimenta longa 5 mL/L de água e biomassa cítrica 10 mL/L de água. Os óleos essenciais e a quitosana foram acrescidos de 8 mL/L de tween 20. Em seguida, os frutos foram acondicionados em grupos de três em bandejas de poliestireno expandido e mantidos em câmara a 21±1 ºC e 85-90% UR por 8 (tangerina Poncã ) ou 7 dias (laranja Valência ). Os frutos foram analisados quanto à incidência e severidade da doença, período de incubação e período latente do fungo, perda de massa da matéria fresca e produção de CO2. No caso da tangerina Poncã , a biomassa cítrica foi capaz de reduzir a incidência em 76,3%, em comparação à testemunha, no terceiro dia, e reduzir também a severidade em 44%, no quarto dia. Para o período de incubação, com exceção dos frutos tratados com óleo de alho, observa-se formação de grupos de médias distintos entre a testemunha e aqueles tratados com produtos alternativos, indicando capacidade de atrasar o surgimento de sintomas da doença. A biomassa cítrica destacou-se, apresentando resultado semelhante ao fungicida tiofanato metílico, atrasando o período de incubação em um dia em relação à água. O mesmo foi observado para o período latente, em que os frutos tratados com produtos alternativos, exceto óleo de alho, situaram-se em um grupo distinto da testemunha. Embora os frutos de todos os tratamentos superassem a testemunha, o imazalil foi capaz de melhor preservar a turgidez dos frutos, apresentando os menores valores de perda de massa da matéria fresca no oitavo dia de avaliação (5,2%). A perda de massa e a produção de CO2 se correlacionaram positivamente com a incidência e severidade, ou seja, as maiores perdas de massa e maiores taxas respiratórias decorrem de altos valores de incidência e severidade. No caso da laranja Valência , biomassa cítrica e quitosana reduziram a incidência e severidade durante todo o período experimental. No sétimo dia após a inoculação, a incidência foi reduzida em 73,7% e 67,4% pela biomassa cítrica e quitosana, respectivamente, em comparação com a testemunha água, enquanto a severidade foi reduzida em 59,6% e 62%, respectivamente. Por outro lado, óleo de nim, óleo de pimenta longa e óleo de alho foram ineficazes em controlar o patógeno. Imazalil e tiofanato metílico controlaram totalmente a doença durante o período de avaliação. A perda de massa da matéria fresca foi crescente ao longo do tempo, porém, os frutos de todos os tratamentos apresentaram valores aceitáveis para a comercialização, situados na faixa de 3 a 5%. Quanto à produção de CO2, os fungicidas mantiveram a taxa respiratória dos frutos baixa, seguidos em ordem crescente pela quitosana e, posteriormente, pelos demais produtos. Dessa maneira, conclui-se que a biomassa cítrica tem bom potencial para controle do bolor verde em tangerina Poncã , enquanto biomassa cítrica e quitosana são capazes de controlar a doença em laranja Valência .

Thesis (MScAgric)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Please refer to full text for abstract / AFRIKAANSE OPSOMMING: Sien volteks vir opsomming

Submitted by Luriany Pompeo Ferraz (luriany@hotmail.com) on 2018-05-10T13:54:38Z No. of bitstreams: 1 Tese Luriany Pompeo Ferraz.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) Previous issue date: 2018-04-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fenômeno killler é característico de leveduras que produzem e excretam proteínas ou glicoproteínas que são inibidoras de células microbianas sensíveis. A estabilidade e atividade das toxinas killer são altamente sensíveis a fatores como pH, temperatura de incubação das leveduras, composição e propriedades físico-químicas do meio e concentração de células sensíveis. Sporobolomyces koalae é uma nova espécie de levedura com potencial para produção de toxina killer. No intuito de se conhecer mais sobre as funções desse microrganismo no ecossistema, esse trabalho teve por objetivos: (i) detectar a atividade killer do precipitado proteico de S. koalae, (ii) caracterizar bioquimicamente e funcionalmente o precipitado proteico S. koalae, (iii) purificar parcialmente a toxina killer produzida por S. koalae e, finalmente, (iv) verificar sua ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum, patógenos que ocorrem na póscolheita de citros. Pelos resultados obtidos neste trabalho, foi possível detectar a presença de atividade killer no precipitado proteico da levedura S. koalae contra células sensíveis da levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. O precipitado proteico da levedura apresenta várias proteínas com diferentes tamanhos moleculares e, parte dessas proteínas é positiva para atividade de β1,3-glucanase, quitinase e protease, podendo ser uma dessas enzimas ou, o sinergismo entre elas, o responsável pelo fator killer da levedura. A funcionalidade de suas proteínas para atividade killer aumenta em pH 4.9 e em uma faixa de temperatura de 22 °C a 27 °C e, o melhor agente precipitante das proteínas da levedura foi o etanol 80%. A purificação parcial das proteínas, que constituem o precipitado proteico de S. koalae, mostrou a existência de aproximadamente quatro bandas proteicas em uma das frações de purificação, Fração 1, com tamanhos aproximados que variaram de 8 a 65 kDa. A atividade killer, presente no precipitado proteico da levedura S. koalae, não apresenta ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum. / The killer phenomenon is characterized by yeasts that produce and excrete proteins or glycoproteins that are inhibitors of sensitive microbial cells. The stability and activity of killer toxins are highly sensitive to the factors such as pH, the temperature of incubation of yeasts, composition and physical-chemical properties of the medium and concentration of sensitive cells. Sporobolomyces koalae is a new species of yeast with potential for killer toxin production. In order to know more about the functions of this microorganism in the ecosystem, this work had as objectives: (i) to detect the killer activity of the S. koalae protein precipitate, (ii) to characterize biochemically and functionally the S. koalae protein precipitate, (iii) to partially purify the killer toxin produced by S. koalae, and, finally, (iv) to verify its antagonistic action on Geotrichum citri-aurantii and Penicillium digitatum, pathogens that occur in the postharvest of citrus. By the results obtained in this work, it was possible to detect the presence of killer activity in the protein precipitate of S. koalae against sensitive cells of Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. The protein precipitate from yeast has several proteins with different molecular sizes and some of these proteins are positive for β1,3-glucanase, chitinase and protease activity. It may be one of these enzymes or synergism between them, the responsible for the killer factor. The functionality of their proteins for killer activity increases at pH 4.9 and a temperature range of 22 oC to 27 oC and the best precipitant of protein from yeast was ethanol (80%). Partial purification of the proteins showed the existence of approximately 4 protein bands in one of the purification fractions, Fraction 1, with approximate sizes ranging from 8 to 65 kDa. The killer activity, present in the protein precipitate of yeast S. koalae, did not present antagonistic action on G. citri-aurantii and P. digitatum. / FAPESP: 14/25067-3

Tesis por compendio / [ES] Los péptidos antimicrobianos (AMP) son una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos antifúngicos que puedan sustituir a los fungicidas usados en agricultura. Sin embargo, el alto coste de la síntesis química y la dificultad para su producción a gran escala han limitado su aplicación. Las proteínas antifúngicas (AFP) son AMP naturales, pequeñas, catiónicas, secretadas y ricas en cisteína con gran potencial para el control de hongos fitopatógenos. Las AFPs se encuentran en hongos filamentosos, son estables y pueden producirse en grandes cantidades. Sin embargo, el papel biológico en su hongo productor no se conoce en profundidad. En esta tesis, se estudió la diversidad de AFPs en genomas de hongos ascomicetos y se propuso una nueva clasificación en tres clases (A, B y C). Penicillium digitatum es el principal patógeno postcosecha de cítricos y codifica solo una AFP en su genoma de clase B (AfpB), mientras que Penicillium expansum, el principal patógeno postcosecha de manzana, codifica una AFP de cada clase (AfpA, AfpB y AfpC). En este trabajo describimos la producción biotecnológica y la caracterización de estas cuatro AFPs. Se ha caracterizado el papel biológico del gen afpB en P. digitatum mediante estudios de expresión génica y generación de mutantes nulos y de expresión constitutiva. Los resultados indicaron que afpB es prescindible para la biología y el ciclo vital del hongo, aunque la expresión del gen afpB bajo el promotor constitutivo gpdA de Aspergillus nidulans es perjudicial para su crecimiento y virulencia. Sorprendentemente, ni la cepa parental ni las cepas constitutivas produjeron cantidades detectables de AfpB a pesar de la alta expresión del gen codificante. El modelado molecular y el diseño racional permitieron predecir la estructura terciaria de AfpB y diseñar péptidos sintéticos para mapear motivos antifúngicos en su secuencia primaria. Confirmamos que los bucles catiónicos L2 y L3 mostraron actividad antifúngica moderada y que pueden actuar sinergísticamente. Con el objetivo de producir AfpB mediante biotecnología, usamos un casete de expresión de AFPs basado en las regiones promotora y terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, hongo que produce naturalmente grandes cantidades de su propia proteína PAF. Este casete funcionó en P. digitatum y permitió la producción homóloga de AfpB. Los datos también mostraron que las secuencias del péptido señal (SP) y el pro-péptido de la SP-Pro-AfpB no determinan la producción de proteína. También demostramos la estabilidad térmica y la resistencia a la proteólisis de AfpB, y aportamos datos que sugieren que la estructura terciaria no es necesaria para la actividad antifúngica. Similar a lo descrito en P. digitatum, ninguna de las tres AFPs se detectó en los sobrenadantes de cultivo en medio rico de P. expansum. Sin embargo, AfpA se produjo en grandes cantidades en cultivos de medio mínimo de P. expansum. Para completar el repertorio de AFPs, produjimos las tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB y AfpC) en P. chrysogenum con el casete paf. Las tres proteínas de P. expansum se produjeron, purificaron y caracterizaron con éxito. Ninguna de las AFPs producidas en este trabajo fue citotóxica frente a eritrocitos de mamíferos. AfpA de P. expansum seguida de AfpB de P. digitatum fueron las AFPs más activas contra hongos filamentosos, incluyendo patógenos de plantas y humanos, productores de micotoxinas y sus propios hongos productores, una característica previamente no descrita en las AFPs. Además, la AfpA de P. expansum y la AfpB de P. digitatum protegieron frente a la infección causada por el hongo Botrytis cinerea en plantas de tomate, y AfpA de P. expansum protegió frente a P. digitatum en frutos de naranja. Estos resultados confirman nuestra hipótesis de que las AFPs son buenas candidatas para el desarrollo de nuevos antifúngicos en protección vegetal y conservación postcosecha, pero ta / [CA] Els pèptids antimicrobians (AMP) són una alternativa prometedora per al desenvolupament de nous antifúngics que puguen substituir als fungicides utilitzats en agricultura. No obstant això, l'alt cost de la síntesi química i la dificultat per a la producció biotecnològica a gran escala han limitat la seua aplicació. Les proteïnes antifúngiques (AFP) són AMPs naturals, xicotetes, catiòniques, secretades i riques en cisteína que oferixen un gran potencial per al control de fongs fitopatogens. Les AFPs estan presents de en fongs filamentosos, són molt estables i poden produir-se en grans quantitats. No obstant això, el paper biològic d'estes AFPs en el seu fong productor encara no està clar. En esta tesi es va estudiar la diversitat d'AFPs en genomes de fongs ascomicets i es va proposar una nova classificació en tres clases (A, B i C). Penicillium digitatum, el principal patogen postcollita de cítrics, codifica només una AFP en el seu genoma de classe B (AfpB). Penicillium expansum, el principal patogen postcollita de poma, codifica una AFP de cada classe (AfpA, AfpB i AfpC). En este treball presentem la producció biotecnològica i la caracterització d'estes quatre AFPs. Hem caracteritzat el paper biològic del gen afpB en P. digitatum mitjançant estudis d'expressió gènica i la generació de mutants nuls i d'expressió constitutiva. Els resultats van indicar que afpB és prescindible per a la biologia i el cicle de vida d'este fong, encara que l'expressió del gen afpB davall el promotor constitutiu gpdA d'Aspergillus nidulans és perjudicial per al seu creixement i virulència sobre fruits cítrics. Sorprenentment, ni el cep parental ni els ceps constitutius van produir quantitats detectables d'AfpB malgrat l'alta expressió del gen afpB. El modelatge molecular i el disseny racional van permetre predir l'estructura terciària d'AfpB i dissenyar pèptids sintètics per a identificar motius antifúngics dins de la seqüència primària. Confirmarem que les estructures catiòniques L2 i L3 mostren activitat antifúngica i que poden actuar de forma sinèrgica. Amb l'objectiu de la producció biotecnològica d'AfpB, utilitzarem un casset d'expressió d'AFPs basat en les regions promotora i terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, el qual produïx naturalment grans quantitats de la seua pròpia proteïna PAF. Este casset va funcionar en P. digitatum i va permetre la producció homòloga d'AfpB. Les dades també van mostrar que les seqüències del pèptid señal (SP) i el propèptid de la SP-Pro-AfpB no determinaren la producció de proteïna. També demostrarem l'extrema estabilitat tèrmica i la resistència proteolítica d'AfpB, i proporcionem dades que suggerixen que l'estructura terciària no és necessària per a l'activitat antifúngica. Semblant a P. digitatum, cap de les tres AFPs es van detectar en els sobrenadants de medi de cultiu ric de P. expansum. Al contrari, AfpA es va produir en grans quantitats en cultius de P. expansum en medi mínim. Per a completar el repertori d'AFPs, vam produir les tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB i AfpC) en P. chrysogenum mitjançant l'ús del casset paf. Així, les tres proteïnes de P. expansum es van produir, purificar i caracteritzar amb èxit. Cap de les AFPs produïdes en este treball va ser citotóxica front eritròcits de mamífer. AfpA de P. expansum seguida d'AfpB de P. digitatum van ser les AFPs més actives contra fongs filamentosos, incloent patògens de plantes i humans, productors de micotoxines i els seus propis productors, una característica prèviament no descrita per a les AFPs. A més, AfpA de P. expansum i AfpB de P. digitatum van protegir front la infecció causada pel fong Botrytis cinerea en plantes de tomaca, i l'AfpA de P. expansum va protegir front P. digitatum en fruits de taronja. Estos resultats confirmen la nostra hipòtesi anterior de que les AFPs són bones candidates per al desenvolupament d'antifúngics en protecció / [EN] Antimicrobial peptides (AMPs) are promising antifungal alternatives to the fungicides used in agriculture. However, the high cost of chemical synthesis and the difficulties of large-scale production have limited their application. Antifungal proteins (AFPs) are a group of natural, small, cationic, secreted, cysteine-rich AMPs that offer a great potential to develop new biomolecules for the control of phytopathogenic fungi. AFPs are naturally present in filamentous fungi, are very stable, and can be produced in large amounts. However, the biological role of these AFPs in their producer fungus is still unclear. In this thesis, we first studied the diversity of AFPs in ascomycetous genomes and proposed a new classification in three different classes (A, B and C). Penicillium digitatum is the main citrus postharvest pathogen and encodes only one AFP from class B in its genome (AfpB), while Penicillium expansum is the main pome postharvest pathogen and encodes one AFP from each class (AfpA, AfpB and AfpC). In this work, we report the identification, efficient biotechnological production and characterization of these four AFPs. We characterized the biological role of the afpB gene in P. digitatum by the study of its gene expression pattern and the generation of null and constitutive expression mutants. Results indicated that afpB is dispensable for the biology and life cycle of this fungus, although expression of the afpB gene under the constitutive Aspergillus nidulans gpdA promoter is detrimental to growth and virulence to citrus. Surprisingly, neither the wild type nor the constitutive strains produced detectable amounts of AfpB in spite of the high afpB gene expression. Molecular modeling and rational design allowed us to predict the AfpB tertiary structure and design synthetic peptides to map antifungal motifs within the AfpB primary sequence. We confirmed that the cationic exposed loops L2 and L3 showed moderate antifungal activity and that they can act synergistically. With the objective of the biotechnological production of AfpB, we used an AFP expression cassette based on the promoter and terminator regions of the well-studied paf gene from Penicillium chrysogenum, which naturally produces high amounts of its own protein PAF. This paf cassette worked efficiently in P. digitatum and allowed the homologous production of AfpB. Data also showed that the signal peptide (SP) and pro-peptide sequences of the translated SP-Pro-AfpB do not determine protein production. We also demonstrated the thermal stability and resistance to proteolytic cleavage of the P. digitatum AfpB, and provided data that suggest that tertiary structure is not required for antifungal activity. Similar to P. digitatum, none of the three AFPs were detected in supernatants of cultures of P. expansum in rich medium. By contrast, AfpA was produced with very high yields in P. expansum cultures in minimal medium. To complete the repertoire of AFPs from P. expansum we produced the three AFPs from P. expansum (AfpA, AfpB and AfpC) in P. chrysogenum with the use of the paf cassette. With this combined approach, the three P. expansum proteins were successfully produced, purified and characterized. None of the four AFPs produced in this work were cytotoxic against mammal erythrocytes. The P. expansum AfpA followed by the P. digitatum AfpB were the most active AFPs against filamentous fungi, including plant and human pathogens, mycotoxin-producer fungi, and their own producers, a feature that had not been previously described for AFPs. Moreover, AfpA from P. expansum and AfpB from P. digitatum protected against fungal infection caused by Botrytis cinerea in tomato plants, and additionally the P. expansum AfpA protected against P. digitatum in orange fruits. These results confirm our previous hypothesis that AFPs are good candidates for the development of antifungals in plant protection and postharvest conservation, but also in clinic or food preservation. / Garrigues Cubells, SM. (2018). Producción y utilización Biotecnológica de nuevas proteínas antifúngicas de hongos filamentosos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/113162 / Compendio

[EN] In modern agriculture, the widespread use of chemicals is common, but the possible presence of residues in food is an issue of increasing importance for public health opinion. The germicidal effect of UV-C irradiation has been successfully tested in different foods but not at an industrial scale as a method for surface disinfection at room temperature of fresh citrus fruit without leaving residues on the product, which is considered a good alternative for food preservation. Postharvest diseases affect the fruit from harvest to the consumer table, and cause significant economic losses to the citrus industry. Losses from disease are highly variable and depend on the production area, species, cultivar, age and condition of the trees; weather conditions throughout the season, the time and method of harvest, postharvest handling of the fruit, storage conditions and destination market. At the global level, important economic losses are caused by strict wound pathogens such as Penicillium digitatum (Pers.: Fr.) Sacc, and Penicillium italicum Wehmer that cause, respectively, citrus postharvest green and blue molds. UV-C irradiation has a maximum emission peak at 254 nm and has been found that this wavelength provides the greatest germicidal action, which has been extensively studied in various plant tissues. Depending on the intensity and wavelength, UV irradiation can induce a biological stress in plants and activate some defense mechanisms of plant tissues, with the consequent production of phytoalexins. Irradiation with UV-C is considered a potential additional tool in CINCEP strategies for the control of citrus decay, although UV-C alone cannot achieve the high efficacy of the fungicides used nowadays for disease control. The results obtained with the prototypes, showed that the best prototype is number III, in which the UV light is applied over rotating rollers. The results indicate that UV light has an indirect hormetic effect on the fruit in preventive trials. The combination with hot water also improves the results when applied in the sequence of hot water followed by application of UV-C in the rotating UV-C applicator prototype III, but not vice versa. Fruit ripening conditions along the season influence the efficacy of the applied dose of UV-C and higher doses can cause undesirable phytotoxic, which can be minimized by the combination with hot water. The studied doses that have been more effective for mandarins and oranges at different ripening stages are: 2.5kJ/m2 on fruit at commercial maturity and subjected to degreening, and the range 5 to 10kJ/m2 on fruit that has reached physiological maturity, which varies depending on the characteristics of the fruit along the season and always in combination with hot water. / [ES] En una agricultura moderna, difícilmente se puede prescindir del uso de productos químicos, pero la posible presencia de residuos en los alimentos es una cuestión que, cada vez, por mínima que ésta sea, preocupa más a la opinión pública, si resulta desfavorable para su salud. El efecto germicida de la irradiación UV-C se ha ensayado con éxito en diferentes alimentos, pero no a escala industrial en la manipulación de cítricos, como un método de desinfección superficial a temperatura ambiente que no deja residuos en el producto, por lo que se considera una buena alternativa para la conservación de alimentos. Las enfermedades de postcosecha, es decir, aquellas enfermedades que afectan a los frutos desde que son recolectados hasta que llegan al consumidor, provocan pérdidas económicas importantes al sector citrícola. Las pérdidas provocadas por las enfermedades son muy variables y dependen del área productora, la especie, el cultivar, la edad y condición de los árboles; las condiciones climatológicas durante toda la campaña, la época y forma de recolección; el manejo de los frutos en postcosecha, las condiciones de almacenamiento y el mercado de destino. En el ámbito mundial destacan las pérdidas producidas por patógenos de herida estrictos como Penicillium digitatum (Pers.:Fr.) Sacc. o Penicillium italicum Wehmer, causantes, respectivamente, de las podredumbres verde y azul. La irradiación UV-C tiene su máximo pico de emisión a 254 nm y se ha comprobado que es en esta longitud de onda donde presenta su mayor acción germicida, por lo que ha sido ampliamente estudiada en varios tejidos vegetales. En función de la intensidad y longitud de onda, la irradiación UV puede inducir un estrés biológico en plantas y activar algunos mecanismos de defensa de los tejidos vegetales, con la consecuente producción de fitoalexinas. La irradiación con UV-C se considera una potencial herramienta adicional en la estrategia de tratamientos combinados para el control del podrido de los cítricos, aunque la radiación UV-C por sí mismo no puede alcanzar la alta eficiencia de control del podrido de los fungicidas utilizados en la actualidad. De los resultados obtenidos en los distintos prototipos, el que ha proporcionado mejores resultados ha sido el prototipo número III , en el que se aplica la UV-C sobre la rulada en movimiento. Los resultados obtenidos indican que el efecto de la UV produce un efecto de hormesis indirecto sobre el fruto en ensayos preventivos. La combinación con agua caliente mejora también los resultados en la estrategia combinada de agua caliente seguida de aplicación de UV-C, en el aplicador de UV sobre rulada (prototipo número III), y no viceversa. Las condiciones de maduración a lo largo de la campaña influyen en los resultados de las dosis aplicadas. A dosis más altas la UV puede provocar efectos no deseados, minimizando los daños con la aplicación combinada de agua caliente. Las dosis estudiadas que han dado buenos resultados en las distintas épocas de la maduración de las variedades de mandarina y naranja son las siguientes: 2,5 kJ/m2 en fruta con la madurez comercial, sometida a desverdización, y en un rango entre 5 y 10 kJ/m2 cuando el fruto alcanza la maduración fisiológica, que varía en función de las características de fruto a lo largo de la campaña, y siempre en combinación con agua caliente. / [CAT] En una agricultura moderna, difícilment es pot prescindir de l'ús de productes químics, però la possible presència de residus en els aliments és una qüestió que, cada vegada, per mínima que aquesta siga, preocupa més a l'opinió pública, si resulta desfavorable per a la seua salut. L'efecte germicida de la irradiació UV-C s'ha assajat amb èxit en diferents aliments, però no a escala industrial en la manipulació de cítrics, com un mètode de desinfecció superficial a temperatura ambient que no deixa residus en el producte, per la qual cosa es considera una bona alternativa per a la conservació d'aliments.Les malalties de postcollita, és a dir, aquelles malalties que afecten als fruits des que són recol·lectats fins que arriben al consumidor, provoquen pèrdues econòmiques importants al sector citrícola. Les pèrdues provocades per les malalties són molt variables i depenen de l'àrea productora, l'espècie, el cultivar, l'edat i condició dels arbres; les condicions climatològiques durant tota la campanya, l'època i forma de recol·lecció; la manipulació dels fruits en postcollita, les condicions d'emmagatzematge i el mercat de destí. En l'àmbit mundial destaquen les pèrdues produïdes per patògens de ferida estrictes com Penicillium digitatum (Pers.:Fr.) Sacc. o Penicillium italicum Wehmer, causants, respectivament, de les podridures verda i blava. La irradiació UV-C té el seu màxim pic d'emissió a 254 nm i s'ha comprovat que és en aquesta longitud d'ona on presenta la seua major acció germicida, per la qual cosa ha sigut àmpliament estudiada en diversos teixits vegetals. En funció de la intensitat i longitud d'ona, la irradiació UV pot induir un estrès biològic en plantes i activar alguns mecanismes de defensa dels teixits vegetals, amb la consequ¿ent producció de fitoalexinas. La irradiació amb UV-C es considera una potencial eina addicional en l'estratègia de tractaments combinats per al control del podrit dels cítrics, encara que la radiació UV-C per si mateix no pot aconseguir l'alta eficiència de control del podrit dels fungicides utilitzats en l'actualitat. Dels resultats obtinguts en els diferents prototips, el que ha proporcionat millors resultats ha sigut el prototip número III, en el qual s'aplica la UV-C sobre rodets en moviment. Els resultats obtinguts indiquen que l'efecte de la UV produeix un efecte de hormesis indirecte sobre el fruit en assajos preventius. La combinació amb aigua calenta millora també els resultats en l'estratègia combinada d'aigua calenta seguida d'aplicació d'UV-C, en l'aplicador d'UV sobre rodets (prototip número III), i no viceversa. Les condicions de maduració al llarg de la campanya influeixen en els resultats de les dosis aplicades. A dosis més altes la UV pot provocar efectes no desitjats,minimitzants els danys amb l'aplicació combinada d'aigua calenta. Les dosis estudiades que han donat bons resultats en les diferents èpoques de maduració de les varietats de mandarina i taronja són les següents: 2,5 kJ/m2 en fruta amb maduresa comercial sotmesa a desverdització, i en un rang entre 5 i 10 kJ/m2 quan el fruit aconsegueix la maduració fisiològica, que varia en funció de les característiques de fruit al llarg de la campanya, i sempre en combinació amb aigua calenta. / Ibiza Mauri, S. (2016). DESARROLLO DE PROTOTIPOS PARA EL TRATAMIENTO POSTCOSECHA DE CÍTRICOS CON RADIACIÓN UV-C Y AGUA CALIENTE PARA EL CONTROL DE LA PODREDUMBRE VERDE CAUSADA POR PENICILLIUN DIGITATUM [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62169 / TESIS

[EN] Citrus spp. (Rutaceae) are the most widely produced fruits and they are grown in over a hundred countries. During postharvest, major losses are caused by fungal diseases, that for decades have been controlled by treatments with synthetic fungicides. However, their use is continuously more restricted by distributors and supermarket chains, which lower the Maximum Residue Level (MRL) to one third of the authorized or even ban the use of certain fungicides. This has loss of efficacy of treatments and development of resistant strains of pathogens. Alternatives are necessary to substitute or combine the use of synthetic fungicides. The objective of the present work was to evaluate alternative treatments against green and blue molds, caused by Penicillium digitatum (Pers.: Fr.) Sacc. and Penicillium italicum Wehmer, respectively. Food additives and GRAS substances were tested in in vivo preliminary tests against green and blue molds. Potassium sorbate (PS) (Chapter 2) and sodium benzoate (SB) (Chapter 1) were the most effective. 60-s dips in 3% (w/v) SB above 50°C reduced by 90% green and blue mold incidence on 'Valencia' oranges after 7 days at 20°C. This treatment was also effective on 'Lanelate' oranges, 'Fino' lemons and 'Ortanique' mandarins, but not on 'Clemenules' mandarins. Heated solutions combining SB with low doses of imazalil (IMZ) were synergistic. In semi-commercial trials with 'Marisol' Clementine mandarins, the combination PS+IMZ at 20°C allowed a significant reduction of the IMZ doses still controlling green mold. A new colorimetric method that employed extraction of PS from macerated fruit, followed by reaction with 2-thiobarbituric acid (Chapter 3) showed that in oranges treated with PS and stored at 15°C, residues declined initially rapidly and later more slowly, until residues stopped declining after 6 d. A brief double-dip rinse in tap water, immediately after immersion of lemons in a 2% (w/v) PS, removed more than 90% of PS residue. Exposure at 33ºC with 15 kPa CO2 for 24 h or 30 kPa O2 for 48 h effectively controlled both green and blue molds after 7 days of incubation at 20ºC, but control of both diseases lowered after 15 days (Chapter 4). Combining PS dip treatments with gas exposure showed a synergistic effect, that maintained the efficacy of combined treatments during 15 days. In cold storage, after 14, 28, and 42 days, green mold incidence on 'Clemenules' and 'Ortanique' mandarins treated with PS dips and 30kPa O2 for 48h was reduced by 100, 96 and 68%, and 100, 97 and 79%, respectively. Again, a synergistic effect between treatments was observed (Chapter 5). Postharvest green mold and blue molds were effectively controlled by fumigation of lemons and oranges for 6 h at 22ºC with two applied dosages of 3000 ¿L L-1 of ammonia that was injected initially and again 2 h later (Chapter 6). Ammonia fumigation controlled an IMZ-resistant isolate of P. digitatum. When fruit were first immersed in 10 or 30 mg L-1 IMZ (about 10% of typical commercial rates) before ammonia fumigation, a single fumigation with 1500 ¿L L-1 of ammonia was adequate to control both diseases and the increase in effectiveness was additive or synergistic. All these treatments, at different degrees, could replace synthetic fungicides or augment IMZ performance in citrus postharvest decay management. The development of green and blue molds on the most commercially important citrus species and cultivars was assessed for four consecutive harvest seasons and associated with fruit quality parameters (Chapter 7). Fruit susceptibility of the cultivars to green mold in increasing order was Nova, Sanguinelli, Ortanique, Lanelate, Navelate, Fortune, Clemenules, Valencia, W. Navel, Oronules, Clemenpons, Marisol, Salustiana, Hernandina, and Nadorcott. Peel characteristics were the most influencing quality parameters on the susceptibility of citrus fruit to green and blue molds. / [ES] Los cítricos (Citrus spp. fam. Rutaceae) son la fruta más consumida a nivel mundial y se cultivan en más de un centenar de países. Durante el manejo en poscosecha, la mayor parte de las pérdidas se deben a enfermedades fúngicas, que durante décadas se han controlado mediante tratamientos con fungicidas de síntesis. Sin embargo, su uso está continuamente más restringido por parte de los distribuidores y cadenas de supermercados, que reducen el Límite Máximo de Residuos (LMR) a un tercio del establecido o incluso prohíben el uso de ciertos fungicidas. Esto ha provocado la pérdida de eficacia de los tratamientos y el desarrollo de cepas de patógenos resistentes a los fungicidas. Se necesitan pues alternativas para sustituir o combinar con el uso de fungicidas de síntesis. El objetivo de este trabajo fue evaluar tratamientos alternativos contra las podredumbres verde y azul, causadas por Penicillium digitatum (Pers.: Fr.) Sacc. y Penicillium italicum Wehmer, respectivamente. Aditivos alimentarios y sustancias GRAS se probaron en test in vivo preliminaries contra los mohos verde y azul. El benzoato sódico (BS; Capítulo 1) y el sorbato potásico (SP; Capítulo 2) fueron los más eficaces. Baños de 60 s en 3% (p/v) BS sobre 50°C redujeron en un 90% la incidencia de las podredumbres verde y azul en naranjas 'Valencia Late' tras 7 días a 20°C. Estos tratamientos fueron también efectivos en naranjas 'Lanelate', limones 'Fino' y mandarinas híbridas 'Ortanique', pero no en mandarinas 'Clemenules'. La combinación de baños calientes de BS con dosis bajas de imazalil (IMZ) fueron sinérgicas. Un nuevo método colorimétrico que empleó la extracción del SP de la fruta macerada, seguido de una reacción con ácido 2-tiobabitúrico (Capítulo 3) mostró que en naranjas tratadas con SP almacenadas a 15°C, los residuos descendieron rápidamente al inicio y lentamente más tarde, hasta que dejaron de descender tras 6 días. Un doble aclarado rápido con agua corriente inmediatamente después de la inmersión de limones en SP al 2% (p/v), eliminó más del 90% del residuo de SP. Los choques gaseosos a 33ºC y 15kPa CO2 durante 24 h o 30 kPa O2 durante 48 h controlaron de manera eficaz las podredumbres verde y azul tras 7 días de incubación a 20ºC, pero el control de las dos podredumbres descendió tras 15 días (Capítulo 4). En almacenamiento en frío, tras 14, 28 y 42 días, la incidencia de moho verde en mandarinas 'Clemenules' y 'Ortanique' tratadas con baños con SP y 30kPa O2 durante 48h se redujo en un 100, 96 y 68%, y 100, 97 y 79%, respectivamente. De nuevo, una fuerte sinergia se observó entre los tratamientos (Capítulo 5). Las podredumbres verde y azul se controlaron eficazmente mediante la fumigación de limones y naranjas durante 6 h a 22ºC con dos dosis de 3000 ¿L L-1 amoniaco, inyectadas al inicio del tratamiento y 2 h después (Capítulo 6). El tratamiento con amoniaco controló una cepa de P. digitatum resistente a IMZ. Cuando la fruta se bañó en 10 o 30 mg L-1 IMZ (un 10% de la dosis comercial) antes de la fumigación con amoniaco, una sola aplicación con 1500 ¿L L-1 amoniaco fue suficiente para controlar las dos podredumbres, y el incremento en la eficacia fue aditivo o sinérgico. Todos estos tratamientos, a diferentes niveles, podrían sustituir a los fungicidas de síntesis o aumentar la eficacia de los tratamientos con IMZ en el manejo poscosecha de los cítricos. El desarrollo de las podredumbres verde y azul en las especies y variedades de cítricos más importantes comercialmente se evaluó durante cuatro campañas consecutivas y se relacionó con los parámetros de calidad de la fruta (Capítulo 7). La susceptibilidad de los cultivares en orden creciente fue Nova, Sanguinelli, Ortanique, Lanelate, Navelate, Fortune, Clemenules, Valencia, W. Navel, Oronules, Clemenpons, Marisol, Salustiana, Hernandina, y Nadorcott. Las características de la corteza fueron los parámetros de calidad / [CAT] Els cítrics (Citrus spp. fam. Rutaceae) son la fruita més consumida a nivell mundial i es cultiven en un centenar de països. Durant la poscollita, la major part de les pèrdues es deuen a malalties fúngiques, que durant dècades s'han controlat mitjançant tractaments amb fungicides de síntesi. No obstant, l'ús d'aquestes pràctiques està contínuament més restringit per part dels distribuïdors y cadenes de supermercats, que redueixen el Límit Màxim de Residus (LMR) a un terç del permès per la legislació o inclús prohibeixen l'ús d'alguns fungicides. Açò ha provocat la minora de l'eficàcia dels tractaments poscollita i el desenvolupament de soques dels patògens resistents als fungicides. Es necessari per lo tant trobar i implementar alternatives per a substituir o combinar l'ús de fungicides de síntesi. L'objectiu d'aquest treball ha sigut avaluar tractaments alternatius contra les podridures verda i blava, causades per Penicillium digitatum (Pers.: Fr.) Sacc. i Penicillium italicum Wehmer, respectivament. Additius alimentaris i substàncies GRAS es provaren en test in vivo preliminars contra les podridures verda i blava. El benzoat sòdic (BS; Capítol 1) i el sorbat potàsic (SP; Capítol 2) foren els més eficaços. Solucions calentes de BS combinades amb baixes dosis d'imazalil (IMZ) foren sinèrgiques. Esta combinació va reduir l'incidència de les podridures verda i blava en quasi el 100% en taronges 'Valencia Late' després de 8 setmanes a 5°C i 7 dies a 20°C. En assajos semicomercials mandarines 'Marisol', la combinació SP+IMZ a 20°C va permetre una baixada significativa de la dosis de IMZ sense perdre eficàcia contra la podridura verda. Un nou mètode colorimètric que inclou l'extracció del SP de la fruita macerada, seguit d'una reacció amb àcid 2-tiobabitúric (Capítol 3) mostrà que en taronges tractades amb SP conservades a 15°C, els residus descendiren ràpidament al inici i lentament mes tard, fins que deixaren de descendir després de 6 dies. Un doble rentat ràpid amb aigua corrent immediatament després de d'immersió de llimones en SP al 2% (p/v), eliminà més del 90% del residu de SP. Els xocs gasosos a 33ºC i 15kPa CO2 durant 24 h o 30 kPa O2 durant 48 h controlaren de manera eficaç les podridures verda i blava després de 7 dies d'incubació a 20ºC, però el control de les dos podridures descendí després de 15 dies (Capítol 4). La combinació de banys amb SP i xocs gasosos mostrà un efecte sinèrgic, que mantingué l'eficàcia dels tractaments combinats durant 15 dies. En conservacions en fred, després de 14, 28 i 42 dies, d'incidència de podridura verda en mandarines 'Clemenules' i 'Ortanique' tractades en banys amb SP i 30kPa O2 durant 48h es reduí en un 100, 96 i 68%, i 100, 97 i 79%, respectivament. De nou, una forta sinergia s'observà entre els tractaments (Capítol 5). Les podridures verda i blava es controlaren eficaçment mitjançant la fumigació de llimones i taronges durant 6 h a 22ºC amb dos dosis de 3000 ¿L L-1 amoníac, injectades al inici del tractament i 2 h després (Capítol 6). El tractament amb amoníac controlà una soca de P. digitatum amb un alt nivell de resistència a IMZ. Tots estos tractaments, a diferents nivells, podrien substituir als fungicides de síntesis o augmentar l'eficàcia dels tractaments amb IMZ en el maneig poscollita dels cítrics. El desenvolupament de les podridures verda i blava en les especies y varietats de cítrics més importants comercialment s'avaluà durant quatre campanyes consecutives i es relacionà amb els paràmetres de qualitat de la fruita (Capítol 7). La susceptibilitat dels distints cultivars en ordre creixent fon Nova, Sanguinelli, Ortanique, Lanelate, Navelate, Fortune, Clemenules, Valencia, W. Navel, Oronules, Clemenpons, Marisol, Salustiana, Hernandina, i Nadorcott. Les característiques de la pell foren els paràmetres de qualitat més influents en la susceptibilitat dels cítrics a les pod / Montesinos Herrero, CI. (2016). Evaluation of alternatives to synthetic fungicides to control citrus postharvest diseases [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63662 / TESIS

[ES] El empleo de organismos vivos como biofactorías ha ganado una atención significativa en la industria debido a la creciente demanda de sistemas de producción sostenibles y la escasez de recursos. Entre sus muchas aplicaciones, las biofactorías pueden ser diseñadas para producir feromonas de insectos, las cuales sirven como alternativa ecológica a los pesticidas para el control de plagas en la agricultura. Como prueba de concepto, en esta tesis doctoral se caracterizaron plantas de Nicotiana benthamiana modificadas genéticamente con una ruta multigénica para producir las feromonas de polillas (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) y (Z)-11-hexadecenil acetato (Z11-16OAc). Las plantas resultantes produjeron cantidades moderadas de ambas feromonas (111.4 µg g-1 FW y 11.8 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente), y tasas de emisión diarias de ~10 ng g-1 FW para cada feromona. La producción de feromonas afectó negativamente al desarrollo de las plantas, probablemente debido a la sustancial carga metabólica y posible toxicidad de estos productos. Una estrategia para superar estas limitaciones es diseñar un sistema de expresión condicional que permita a las plantas crecer con normalidad antes de inducir la producción de feromonas. Para ello desarrollamos un conjunto de promotores sintéticos personalizables, llamados GB_SynP, activables con dCasEV2.1, un activador transcripcional potente y programable desarrollado recientemente para la inducción de genes en plantas. Los promotores GB_SynP permitieron una regulación precisa de los transgenes, con unos niveles de transcripción robustos y modulables en el estado "encendido" (presencia de dCasEV2.1 y la correspondiente guía de ARN), y una expresión mínima en el estado "apagado". Para implementar el sistema de producción condicional de feromonas en plantas se generó una nueva ruta multigénica para la biosíntesis de feromonas de polilla bajo el control de los promotores GB_SynP. Paralelamente, el activador dCasEV2.1 se reguló transcripcionalmente mediante el módulo CUP2:GAL4 sensible a sulfato de cobre, un inductor químico ampliamente utilizado en la agricultura. La funcionalidad del sistema se probó mediante expresión transitoria en N. benthamiana, resultando en unos rendimientos en el estado "encendido" de 32.7 µg g-1 FW y 25 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente, y unos niveles insignificantes en ausencia de cobre. Sin embargo, la expresión en estable de esta ruta en N. benthamiana produjo unos niveles de expresión de los transgenes significativamente menores y una marcada disminución en la producción de feromonas. Esto supone que el sistema en su forma actual resulte inviable como biofactoría de feromonas en términos prácticos. La optimización de este sistema debe centrarse en mejorar la cascada de activación, en el uso de especies de plantas alternativas con mayor biomasa, y/o en incrementar las tasas de emisión en planta. Como alternativa a la producción de feromonas en plantas, la intercambiabilidad de piezas génicas entre plantas y hongos filamentosos puede aprovecharse para crear biofactorías fúngicas de feromonas. En este sentido, nuestro grupo adaptó previamente el sistema GoldenBraid a hongos filamentosos, llamado FungalBraid. En esta tesis ampliamos la colección de FungalBraid incorporando 27 piezas nuevas que incluyen diferentes marcadores de selección y promotores constitutivos e inducibles, los cuales se caracterizaron funcionalmente en Penicillium digitatum y P. chrysogenum. Además, se expresaron con éxito los promotores GB_SynP en P. digitatum, en combinación con el sistema de dCas9 activadora contenido en el vector pAMA18. Aunque los niveles de expresión de GB_SynP en hongos filamentosos fueron menores que los observados previamente en plantas, ésta y otras herramientas disponibles en la colección FungalBraid pueden utilizarse en el futuro para el desarrollo de biofactorías fúngicas que produzcan feromonas de insectos y otras biomoléculas de alto valor. / [CA] L'ús d'organismes vius com biofàbriques ha guanyat una atenció significativa a la indústria a causa de la creixent demanda de sistemes de producció sostenible i l'escassetat de recursos. Entre les seues moltes aplicacions, les biofàbriques poden ser dissenyades per a produir feromones d'insectes, les quals serveixen com a alternativa ecològica als pesticides per al control de plagues a l'agricultura. Com a prova d'aquest concepte, en aquesta tesi doctoral es van caracteritzar plantes de Nicotiana benthamiana modificades genèticament plantes de amb una ruta multigènica per a produir les feromones d'arnes (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) i (Z)-11-hexadecenil acetat (Z11-16OAc). Les plantes resultants van produir quantitats moderades de totes dues feromones (111.4 µg g-1 FW i 11.8 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament), i taxes d'emissió diàries d'aproximadament 10 ng g-1 FW per a cada feromona. La producció de feromones en aquestes plantes va afectar negativament el seu desenvolupament, probablement a causa de la substancial càrrega metabòlica i possible toxicitat d'aquests productes. Una estratègia per superar aquestes limitacions és dissenyar un sistema d'expressió condicional que permeta a les plantes créixer amb normalitat abans d'induir la producció de feromones. Per això hem desenvolupat un conjunt de promotors sintètics personalitzables, anomenats GB_SynP, activables amb dCasEV2.1, un activador transcripcional potent i programable desenvolupat recentment per a la inducció de gens en plantes. Els promotors GB_SynP van permetre una regulació precisa des transgens, amb uns nivells de transcripció robustos i modulables a l'estat "encès" (presència de dCasEV2.1 i la corresponent guia d'ARN), i una expressió mínima a l'estat "apagat". Per implementar el sistema de producció condicional de feromones en plantes es va generar una nova ruta multigènica per a la biosíntesi de feromones d'arna sota el control dels promotors GB_SynP. Paral·lelament, l'activador dCasEV2.1 es va regular transcripcionalment al mòdul CUP2:GAL4 sensible al sulfat de coure, un inductor químic àmpliament utilitzat en l'agricultura. La funcionalitat del sistema es va provar mitjançant expressió transitòria en N. benthamiana, resultant en uns rendiments a l'estat "encès" de 32.7 g-1 FW i 25 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament, i uns nivells insignificants en absència de coure. No obstant això, l'expressió estable d'aquesta ruta a N. benthamiana va produir uns nivells d'expressió dels transgens significativament menors i una marcada disminució en la producció de feromones. Això suposa que el sistema en la seua forma actual resulte inviable com a biofàbrica de feromones en termes pràctics. L'optimització d'aquest sistema ha de centrar-se en millorar la cascada d'activació, en l'ús d'espècies de plantes alternatives amb major biomassa, i/o en incrementar les taxes d'emissió a la planta. Com a alternativa a la producció de feromones en plantes, la intercanviabilitat de peces gèniques entre plantes i fongs filamentosos pot aprofitar-se per crear biofàbriques fúngiques de feromones. En aquest sentit, el nostre grup va adaptar prèviament el sistema GoldenBraid a fongs filamentosos, anomenat FungalBraid. En aquesta tesi, vam ampliar la col·lecció de FungalBraid incorporant 27 peces noves que inclouen diferents marcadors de selecció i promotors constitutius i induïbles, els quals es van caracteritzar funcionalment a Penicillium digitatum i P. chrysogenum. A més, es van expressar amb èxit els promotors GB_SynP en P. digitatum, en combinació amb el sistema de dCas9 activadora contingut en el vector pAMA18. Encara que els nivells d'expressió de GB_SynP en fongs filamentosos van ser menors que els observats prèviament en plantes, aquesta i altres eines disponibles a la col·lecció FungalBraid poden utilitzar-se en el futur per al desenvolupament de biofàbriques fúngiques que produeixin feromones d'insectes i altres biomolècules de gran valor. / [EN] The use of living organisms as biofactories have gained significant attention in the industry due to the increasing demand for sustainable production systems and the shortage of resources. Among their many applications, biofactories can be engineered to produce insect pheromones, which serve as eco-friendly alternatives to pesticides for pest management in agriculture. As a proof of concept, in this thesis we characterized Nicotiana benthamiana plants engineered with a multigene pathway to produce the moth pheromones (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) and (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16OAc). The resulting transgenic plants produced modest amounts of both pheromones (111.4 µg g-1 FW and 11.8 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc, respectively), and daily emission rates of ~10 ng g-1 FW for each pheromone. Pheromone production in these plants significantly affected their fitness, likely due to the substantial metabolic burden and possible toxicity of lipid-derived products. One strategy to address these developmental abnormalities consists of engineering conditional transgene expression systems, thus allowing plants to grow normally before inducing the production of pheromones. To achieve this goal, in this thesis we developed a set of customizable synthetic promoters called GB_SynP, which can be activated by dCasEV2.1, a strong programable transcriptional activator recently developed for plant gene regulation. These GB_SynP promoters enabled tight regulation of single and multiple transgenes, with robust and tunable transcription levels in the ON state (presence of dCasEV2.1 loaded with the corresponding gRNA), and minimal or undetectable expression in the OFF state. To implement a conditional expression system for pheromone production in plants, a newly engineered multigene pathway for the biosynthesis of moth pheromones was constructed under the control of GB_SynP promoters. In parallel, the dCasEV2.1 activator was transcriptionally regulated with the CUP2:GAL4 sensor for copper sulphate, an agronomically-compatible chemical trigger. The functionality of this system was tested transiently in N. benthamiana, resulting in estimated yields of 32.7 µg g-1 FW and 25 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc respectively in the ON state, and negligible levels in the absence of copper. However, stable transformation of the same copper-regulated pheromone pathway in N. benthamiana plants resulted in significantly lower transgene expression levels, which translated into a great reduction of pheromone yields. This makes the system in its current form a non-viable pheromone biofactory in practical terms. Further optimization should focus on the improvement of the activation cascade, the use of alternative plant hosts with more biomass, and/or the enhancement of emission rates in planta. As an alternative to pheromone production in plants, the interchangeability of DNA parts between plants and filamentous fungi could also be exploited to create fungal biofactories for pheromone production. In this regard, our research group previously adapted the GoldenBraid system for filamentous fungi, which we named FungalBraid. In this thesis, we expanded the FungalBraid collection by incorporating 27 new DNA parts, including different selection markers and several constitutive and inducible promoters, all of which were functionally characterized in Penicillium digitatum and P. chrysogenum. Furthermore, we successfully expressed the GB_SynP promoters developed for plants in P. digitatum, in combination with the non-integrative pAMA18-derived vector for the expression of a dCas9-based activator. Although further optimization of GB_SynP in filamentous fungi is required, as expression levels were lower than those previously observed in plants, this and the other tools available in the FungalBraid collection can be effectively employed in the future for the development of fungal biofactories that produce insect pheromones and other high value biomolecules. / Este trabajo ha sido financiado mediante la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario FPU18/02019 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), así como por el proyecto europeo SUSPHIRE (PCI2018-092893, Era- CoBiotech), y los proyectos de Plan Nacional I+D PID2019-108203RB-100 y PID2021-125858OB-100 (Ministerio de Ciencia e Innovación). / Moreno Giménez, E. (2023). Synthetic biology tools for production of insect pheromones in plants and filamentous fungi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201180