O processamento de celulose em moinho de bolas de porcelana produz um pó no qual se detecta a presença de radicais livres, por Ressonância Paramagnética Eletrônica. O espectro obtido e complexo e pode ser decomposto em pelo menos dois sinais: uma linha instável, eliminada apôs alguns dias de exposição ao ar, e outra estável, que decai lentamente por aquecimento a 400-500ºC, e desaparece a 900ºC. A moagem simultânea de celulose com amido, acrilamida, azul de dextrana e sacarose produz celulose quimicamente modificada. Por exemplo, no caso da acrilamida, dosagem pelo método kjeldahl revela a presença de ate 0,65% de nitrogênio no material obtido apôs lavagens exaustivas. A celulose moída na presença de vários reagentes foi submetida a ensaios de hidrólise e em alguns casos, mostrou-se significativamente mais suscetível ao ataque enzimático do que a celulose simplesmente moída. Os resultados deste trabalho mostram que a conversão enzimática de celulose em açucares redutores e sensível a uma pequena modificação no pré-tratamento mecanoquímico. / Cellulose processing on porcelain ball mill produce a powder in which one can detect free radicals by means of Electronic Paramagnetic Ressonance. The spectrum attained is complex and it may be decomposed in at least two signals: an unstable line that is eliminated after some days of exposition tc air and another stable line, which slowly decays due to heating at 400-500ºC and disapears at 900ºC. Cellulose simultaneously milled with starch, acrylamide, dextran blue and saccharose produce chemically modified cellulose. For instance, when using acrylamide one can detect, by means of the Kjeldhal method, the existence of nitrogen up to 0.65% in the material obtained after exhaustive washings. In some cases cellulose milled with several reactants seemed to be significantly more susceptible to the enzymatic attack during hydrolysis than cellulose milled without any reactant. The results of this work show that the enzymatic conversion of cellulose into reducible sugars is sensible to a little change in the mechano-chemical pre-treatment.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-10T16:58:11Z No. of bitstreams: 1 2017_GuilhermeBentoSperandio.pdf: 4590164 bytes, checksum: 08bd686ada6b96e58af9f6c50907a0f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-29T20:09:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_GuilhermeBentoSperandio.pdf: 4590164 bytes, checksum: 08bd686ada6b96e58af9f6c50907a0f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-29T20:09:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_GuilhermeBentoSperandio.pdf: 4590164 bytes, checksum: 08bd686ada6b96e58af9f6c50907a0f2 (MD5) Previous issue date: 2018-05-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF). / A crescente demanda energética global e a necessidade ambiental de se afastar do modelo econômico linear baseado na indústria petroquímica são incentivos para o aprimoramento das biorrefinarias lignocelulósicas. Enzimas hidrolíticas ainda são uma porção considerável dos custos de funcionamento das biorrefinarias. Neste trabalho propõem-se a análise do potencial de co-cultivos fúngicos na produção de enzimas hidrolíticas atuantes em material lignocelulósico. Foram realizadas co-culturas do fungo Trichoderma reesei RUT-C30 com Aspergillus niger, Aspergillus tamarii e Phanerochaete chrysosporium em fermentação submersa (SmF) utilizando bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. Também foi avaliado o co-cultivo de T. reesei QM 9414 com A. niger nas mesmas condições. Ao serem cultivados com A. niger, T. reesei RUT-C30 e QM 9414 apresentaram um aumento de 142% e 140% na atividade de β-glicosidase, respectivamente. O perfil enzimático total variou significativamente em cada combinação, com determinadas atividades sendo aumentadas e outras sendo diminuídas pelos co-cultivos. O aumento das atividades enzimáticas individuais como β-glicosidase, por exemplo, não se refletiu em maior atividade de celulases totais (FPAse) e nem em maior eficiência na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar, sendo o monocultivo de T. reesei RUT-C30 o que liberou mais açúcares redutores em ambos os ensaios. / The growing global energy demand and the environmental need to move away from the linear economic model based on the petrochemical industry are incentives for the improvement of lignocellulosic biorefineries. Hydrolytic enzymes are still a considerable portion of the running costs of biorefineries. In this work we propose the analysis of the potential of fungal cocultures in the production of hydrolytic enzymes active on lignocellulosic material. Cocultures of the fungus Trichoderma reesei RUT-C30 with Aspergillus niger, Aspergillus tamarii and Phanerochaete chrysosporium were carried out in submerged fermentation (SmF) using sugarcane bagasse as carbon source. Co-cultivation of T. reesei QM 9414 with A. niger under the same conditions was also evaluated. When cultivated with A. niger, T. reesei RUT-C30 and QM 9414 presented a 142% and 140% increase in β-glucosidase activity, respectively. The total enzymatic profile varied significantly in each combination, with certain activities being increased and others being decreased by the cocultures. The increase in individual enzymatic activities such as βglycosidase, for example, was not reflected in higher total cellulase activity (FPAse) or in higher efficiency in the hydrolysis of sugarcane bagasse, with monocultures of T. reesei RUT -C30 releasing more reducing sugars in both assays.

O processamento de celulose em moinho de bolas de porcelana produz um pó no qual se detecta a presença de radicais livres, por Ressonância Paramagnética Eletrônica. O espectro obtido e complexo e pode ser decomposto em pelo menos dois sinais: uma linha instável, eliminada apôs alguns dias de exposição ao ar, e outra estável, que decai lentamente por aquecimento a 400-500ºC, e desaparece a 900ºC. A moagem simultânea de celulose com amido, acrilamida, azul de dextrana e sacarose produz celulose quimicamente modificada. Por exemplo, no caso da acrilamida, dosagem pelo método kjeldahl revela a presença de ate 0,65% de nitrogênio no material obtido apôs lavagens exaustivas. A celulose moída na presença de vários reagentes foi submetida a ensaios de hidrólise e em alguns casos, mostrou-se significativamente mais suscetível ao ataque enzimático do que a celulose simplesmente moída. Os resultados deste trabalho mostram que a conversão enzimática de celulose em açucares redutores e sensível a uma pequena modificação no pré-tratamento mecanoquímico. / Cellulose processing on porcelain ball mill produce a powder in which one can detect free radicals by means of Electronic Paramagnetic Ressonance. The spectrum attained is complex and it may be decomposed in at least two signals: an unstable line that is eliminated after some days of exposition tc air and another stable line, which slowly decays due to heating at 400-500ºC and disapears at 900ºC. Cellulose simultaneously milled with starch, acrylamide, dextran blue and saccharose produce chemically modified cellulose. For instance, when using acrylamide one can detect, by means of the Kjeldhal method, the existence of nitrogen up to 0.65% in the material obtained after exhaustive washings. In some cases cellulose milled with several reactants seemed to be significantly more susceptible to the enzymatic attack during hydrolysis than cellulose milled without any reactant. The results of this work show that the enzymatic conversion of cellulose into reducible sugars is sensible to a little change in the mechano-chemical pre-treatment.

El uso de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas tiene un alto potencial biotecnológico, debido principalmente a que permiten la reducción de costos energéticos en los procesos biotecnológicos. Las proteasas son enzimas proteolíticas de gran utilidad en la industria biotecnológica. Sus aplicaciones industriales involucran principalmente a la industria alimenticia, de detergentes y de cuero. En este trabajo se aisló bacterias de origen marino antártico que producen enzimas proteolíticas extracelulares con alta actividad a bajas temperaturas. El DNA genómico de las mejores cepas se utilizó para realizar búsquedas de genes que codificaran para proteasas tipo subtilisinas, utilizando partidores híbridos consenso-degenerados de oligonucleótidos (CODEHOP). Esto permitió clonar y secuenciar fragmentos de DNA que codificaban para regiones internas de tres proteasas tipo subtilisinas diferentes. A partir de estos fragmentos se determinó la secuencia de los extremos 3’ y 5’ de los genes, mediante una técnica de “genome walking” desarrollada para este trabajo. Se encontraron tres marcos de lectura abiertos (ORF) de 2.253 pb (P4), 2.124 pb (P6) y 1608 pb (P7), que codificaban para proteasas tipo subtilisina. Estos genes se expresaron con el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(D3E), mediante inducción con IPTG. Las proteasas se produjeron fusionadas a una cola de histidina en el extremo C-terminal, permitiendo su purificación por cromatografía de afinidad a níquel. La proteasa P6 presentó mayor actividad catalítica que la subtilisina comercial Carlsberg a bajas temperaturas (5-25°C). Por otro lado, el sobrenandante del cultivo de la cepa antártica p13/1-4, correspondiente a la mejor productora de proteasa, se utilizó para purificar la enzima proteolítica mediante cromatografía. La proteasa se llamó T8, y se clonó un fragmento del gen de esta proteasa, mediante una estrategia que incluía un análisis de espectrometría de masa y diseño de partidores degenerados. La secuencia completa del gen se obtuvo mediante la técnica mejorada de “genome walking”, desarrollada en este trabajo. Actualmente, esta proteína tipo-subtilisina se encuentra en etapa de expresión recombinante. Adicionalmente a este trabajo, se aisló el gen de una xilanasa adaptada a bajas temperaturas utilizando partidores CODEHOP y la técnica de genome walking. Este gen se expresó en el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(DE3), produciendo la xilanasa L activa en el sobrenandante. Esta xilanasa recombinante se utilizó para desarrollar métodos de evolución dirigida tales como PCR propenso a error (error-prone PCR) y recombinación al azar (DNA shuffling). Esto permitió la obtención de una nueva variante de xilanasa con una constante catalítica (kcat) tres veces mayor que la xilanasa L original. Durante este trabajo de tesis se desarrolló diferentes estrategias que permitieron la clonación, producción recombinante y evolución dirigida de diferentes enzimas hidrolíticas adaptadas a bajas temperaturas.

Enzimas lipolíticas possuem enorme potencial biotecnológico. O objetivo foi prospectar genes para a codificação de enzimas lipolíticas em biblioteca metagenômica com 4224 clones. A atividade lipolítica foi avaliada pela formação de halo ao redor das colônias através do cultivo dos clones em meio de cultura suplementado com tributirina, sendo positiva para 30 clones, e dois foram selecionados e tiveram o DNA sub-clonado. Os DNAs das sub-bibliotecas foram sequenciados, gerando um contig completo para o clone PL28.F10, que foi comparado com as sequências do banco NCBI. Uma ORF codificadora de esterase/lipase de 303 aminoácidos e 61% de identidade com micro-organismo não cultivável foi encontrada. Árvores filogenéticas indicam que o clone possui a ORF15 mais próxima da família IV das esterases/lipases. Foi possível identificar os sítios ativos representativos da família, confirmando o resultado das árvores filogenéticas. Com sequências já patenteadas, a ORF15 é um grupo irmão das sequências de esterases/lipases da BASF e de uma proteína não identificada da CAMBIA. / Lipolytic enzymes have show enormous biotechnological potential. The work was done to find genes which codify lipolytic enzymes in a metagenomic library with 4224 clones. Clones were selected according to lipolytic activity and were assessed by cultivation in medium supplemented with tributyrin. Assessment was done by observation of halos formed around the colonies, with 30 clones producing halos. Of these, two were selected. DNA from the sub libraries was sequenced, generating a complete contig for clone PL28.F10 that was compared to sequences from the NCBI. An ORF of 303 amino acids with 61% of identity with uncunturable microorganism were found. The clone presented the ORF15 similar to that of lipolytic enzyme family IV. The alignments made possible the identification of active sites which represent the family, confirming the results obtained with the construction of the cladograms. The ORF15 showed similarities to patented BASF esterase/lipase and an unnamed protein of CAMBIA.

A banana é considerada um bom modelo de estudo para a transformação amido-sacarose, já que acumula um teor alto de amido durante o desenvolvimento, que é degradado durante o amadurecimento. Já foram detectadas em polpa de banana atividade e proteína relativa a várias enzimas supostamente envolvidas no processo de degradação do amido. Entre elas, a α-amilase, a β-amilase, a amido fosforilase e as glucano-água-diquinases (GWD). Estas enzimas estão envolvidas em dois processos distintos de degradação de amido em plantas: o dependente da ação inicial da α-amilase e o dependente da fosforilação do grânulo pela GWD e PWD e posterior ação da β-amilase. A dificuldade do estabelecimento da participação efetiva de cada enzima no processo de degradação do amido está associada a muitos fatores, entre eles a não-correlação entre atividade e real envolvimento em um processo, e a acessibilidade da enzima ao seu substrato. Aliado ao estudo da morfologia do grânulo de amido e suas modificações sofridas durante o processo de degradação que ocorre durante o amadurecimento do fruto, estudos in vitro que simulem a ação da enzima sobre o seu substrato poderiam ser mais efetivos no estabelecimento da real ação de dada enzima sobre o suposto substrato. Tentativas no sentido de obter as proteínas relativa à degradação não foram bem sucedidas. Assim, os ensaios de grânulos de amido isolados versus enzimas foram feitos com α-amilase e β-amilase comerciais. O grau de fosforilação da amilopectina nas posições Glic-6 e Glic-3 foi determinado, condição necessária para o início da degradação do grânulo pela β-amilase. Os resultados mostraram que os grânulos de amido isolados de bananas recém colhidas, ou verdes, já estão fosforilados e as enzimas responsáveis por esta fosforilação estão associadas aos grânulos. Após 72 h de incubação dos grânulos de amido com as enzimas hidrolítica, os grânulos foram separados do tampão contendo as enzimas e os produtos de hidrólise. Os sobrenadantes foram analisados por cromatografia líquida acoplada a detector amperométrico e os grânulos por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e microscopia de força atômica (MFA). Os resultados mostraram que a α-amilase hidrolisa preferencialmente regiões amorfas dos grânulos, com predominância de amilose, expondo as regiões mais cristalinas dos anéis de crescimento, enquanto que a β-amilase parece atuar preferencialmente nas regiões cristalinas dos grânulos, degradando os bloquetes, que são formados por amilopectina. Pode-se concluir que ambas as enzimas parecem ser importantes no processo de degradação do amido da banana, com diferentes especificidades. / Banana is considered a good model to study the starch-sucrose metabolism, since it accumulates a high starch content during development, which is degraded during fruit ripening. It have been detected in banana pulp some proteins and activities of several enzymes supposedly involved in starch degradation process. Among them, α-amylase, β-amylase, starch phosphorylase and glucan-water-diquinases (GWD). These enzymes are involved in two separate processes of starch degradation in plants: the initial action of α-amylase dependent, and the starch granule phosphorylation by GWD and PWD enzymes and subsequent action of β-amylase. The difficulty of establishing the effective participation of each enzyme in the starch degradation process is associated with many factors, including the lack of correlation between real activity and involvement in the process, and accessibility of the enzyme to its substrate. Allied to study the morphology of the starch granule and its modifications suffered during the process of degradation, which occurs during the fruit ripening, in vitro studies that simulate the action of the enzyme on its substrate could be more effective in establishing the real action of a given enzyme on the argued substrate. However, attempts to obtain the proteins related to the degradation process were unsuccessful. Thus, assays of isolated starch granules versus enzymes were made with commercial α-amylase and β-amylase enzymes. The degree of phosphorylation of amylopectin in the Gluc-6 and Gluc-3 positions was determined, a necessary condition for the start of degradation by β-amylase enzyme. The results showed that the starch granules isolated from freshly harvested bananas, or green, are already phosphorylated and the enzymes responsible for this phosphorylation is associated with the starch granules surface. After 72 h incubation of the starch granules with the hydrolytic enzymes, the granules were separated from the buffer containing the enzymes and the hydrolysis products. The supernatants were analyzed by liquid chromatography coupled with amperometric detector and the granules were visualized by scanning electron microscopy (SEM) and atomic force microscopy (AFM). The results showed that the α-amylase preferentially hydrolyzes amorphous regions of the granule, especially amylose, exposing more crystalline regions of the growth rings, whereas β-amylase appears to act preferentially on crystalline regions of the granule, degrading blocklets that consist of amylopectin. It can be concluded that both enzymes appear to be important in the banana starch degradation process, with different specificities.

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de β-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de β-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma β-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and β-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of β-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a β-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

As enzimas têm papel fundamental em diversos segmentos como, por exemplo, nas indústrias de detergentes, fármacos, têxtil e alimentícia. A identificação de novas fontes microbianas para a produção de enzimas é de grande interesse industrial, bem como a otimização do meio de cultivo para sua produção. A aplicação de abordagens estatísticas envolvendo as metodologias de Plackett-Burman e superfície de resposta são ferramentas úteis para compreensão e otimização das interações entre os diversos parâmetros envolvidos na produção de determinada enzima. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial, como produtoras enzimáticas, de linhagens de leveduras isoladas a partir de cocos de babaçu (Orbignya sp.), buriti (Mauritia flexuosa), tucum (Bactris inundata), inajá (Attalea maripa) e macaúba (Acrocomia aculeata), frutas típicas do Cerrado tocantinense. Foram testadas 142 leveduras quanto a capacidade de produção das enzimas lipase, amilase, protease e pectinase em meios sólidos específicos com tempo de incubação de 21 dias e temperatura de 35 °C. Um total de 61 linhagens apresentaram resultados positivos para lipase, das quais 28 (45,9%) tinham índice enzimático (IE) ≥ 2. Apenas uma levedura apresentou halo indicador de produção de amilase (IE = 1,57), e não houve resultados positivos para pectinase e protease. Posteriormente, a levedura codificada com número 13, que obteve a melhor atividade lipolítica em meio sólido, foi submetida ao cultivo em meio submerso de acordo com um planejamento experimental Plackett-Burman seguido por um delineamento composto central rotacional para otimizar as condições de produção da enzima. A melhor condição encontrada, com atividade lipolítica de 41,45 U.mL-1, foi: 10 g.L-1 de extrato de levedura, 10 g.L-1 de peptona, 30 g.L-1 de (NH4)2SO4, 1 g.L-1 de Tween 20, 1,5 g.L-1 de MgSO4.7H2O, 0,7 g.L-1 de KH2PO4 e 10 g.L-1 de óleo de oliva. Quando comparado com os óleos de buriti e babaçu, o óleo de oliva se mostrou o melhor indutor para a produção de lipase. / Enzymes have an essential role in various segments, for example, in detergents, pharmaceuticals, textile and food industries. The identification of new microbial sources for production of enzymes is of great industrial interest, as well as the optimization of culture medium for production. The application of statistical approaches involving the Plackett- Burman and response surface methodologies are useful tools for understanding and optimizing interactions between the various parameters involved in the production of a particular enzyme. This study aimed to evaluate the enzymatic production potential of yeasts strains from babassu coconuts (Orbignya sp.), buriti palm (Mauritia flexuosa), tucumán (Bactris inundata), inajá (Attalea maripa) and macaúba (Acrocomia aculeata), typical fruits of the Cerrado in Tocantins. A total of 142 yeasts were tested for their ability to produce lipase, amylase, protease and pectinase in specific solid media at incubation time of 21 days at 35 °C. A total of 61 strains were positive for lipase, of which 28 (45.9%) had an enzymatic index (EI) ≥ 2. Only one yeast presented halo indicator of amylase production (EI = 1.57), and there were no positive results for pectinase and protease. Subsequently, the yeast coded with number 13, which obtained the best lipolytic activity on solid medium, was subjected to cultivation in liquid medium according to a Plackett-Burman experimental design followed by a rotational central composite design to optimize the enzyme production conditions. The best condition, with lipase activity of 41.45 U.mL-1, was found to be 10 g.L-1 of yeast extract, 10 g.L-1 peptone, 30 g.L-1 (NH4) 2SO4, 1 g.L-1 Tween 20, 1.5 g.L-1 MgSO4.7H2O, 0.7 g.L-1 KH2PO4 and 10 g.L-1of olive oil. When compared with buriti and babassu oils, the olive oil was the best inducer for the lipase production.

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de β-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de β-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma β-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and β-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of β-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a β-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

Submitted by Luriany Pompeo Ferraz (luriany@hotmail.com) on 2018-05-10T13:54:38Z No. of bitstreams: 1 Tese Luriany Pompeo Ferraz.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) Previous issue date: 2018-04-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fenômeno killler é característico de leveduras que produzem e excretam proteínas ou glicoproteínas que são inibidoras de células microbianas sensíveis. A estabilidade e atividade das toxinas killer são altamente sensíveis a fatores como pH, temperatura de incubação das leveduras, composição e propriedades físico-químicas do meio e concentração de células sensíveis. Sporobolomyces koalae é uma nova espécie de levedura com potencial para produção de toxina killer. No intuito de se conhecer mais sobre as funções desse microrganismo no ecossistema, esse trabalho teve por objetivos: (i) detectar a atividade killer do precipitado proteico de S. koalae, (ii) caracterizar bioquimicamente e funcionalmente o precipitado proteico S. koalae, (iii) purificar parcialmente a toxina killer produzida por S. koalae e, finalmente, (iv) verificar sua ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum, patógenos que ocorrem na póscolheita de citros. Pelos resultados obtidos neste trabalho, foi possível detectar a presença de atividade killer no precipitado proteico da levedura S. koalae contra células sensíveis da levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. O precipitado proteico da levedura apresenta várias proteínas com diferentes tamanhos moleculares e, parte dessas proteínas é positiva para atividade de β1,3-glucanase, quitinase e protease, podendo ser uma dessas enzimas ou, o sinergismo entre elas, o responsável pelo fator killer da levedura. A funcionalidade de suas proteínas para atividade killer aumenta em pH 4.9 e em uma faixa de temperatura de 22 °C a 27 °C e, o melhor agente precipitante das proteínas da levedura foi o etanol 80%. A purificação parcial das proteínas, que constituem o precipitado proteico de S. koalae, mostrou a existência de aproximadamente quatro bandas proteicas em uma das frações de purificação, Fração 1, com tamanhos aproximados que variaram de 8 a 65 kDa. A atividade killer, presente no precipitado proteico da levedura S. koalae, não apresenta ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum. / The killer phenomenon is characterized by yeasts that produce and excrete proteins or glycoproteins that are inhibitors of sensitive microbial cells. The stability and activity of killer toxins are highly sensitive to the factors such as pH, the temperature of incubation of yeasts, composition and physical-chemical properties of the medium and concentration of sensitive cells. Sporobolomyces koalae is a new species of yeast with potential for killer toxin production. In order to know more about the functions of this microorganism in the ecosystem, this work had as objectives: (i) to detect the killer activity of the S. koalae protein precipitate, (ii) to characterize biochemically and functionally the S. koalae protein precipitate, (iii) to partially purify the killer toxin produced by S. koalae, and, finally, (iv) to verify its antagonistic action on Geotrichum citri-aurantii and Penicillium digitatum, pathogens that occur in the postharvest of citrus. By the results obtained in this work, it was possible to detect the presence of killer activity in the protein precipitate of S. koalae against sensitive cells of Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. The protein precipitate from yeast has several proteins with different molecular sizes and some of these proteins are positive for β1,3-glucanase, chitinase and protease activity. It may be one of these enzymes or synergism between them, the responsible for the killer factor. The functionality of their proteins for killer activity increases at pH 4.9 and a temperature range of 22 oC to 27 oC and the best precipitant of protein from yeast was ethanol (80%). Partial purification of the proteins showed the existence of approximately 4 protein bands in one of the purification fractions, Fraction 1, with approximate sizes ranging from 8 to 65 kDa. The killer activity, present in the protein precipitate of yeast S. koalae, did not present antagonistic action on G. citri-aurantii and P. digitatum. / FAPESP: 14/25067-3