O gênero Nocardia é composto por bactérias gram-positivas e filamentosas, que normalmente só causam doença em indivíduos imunocomprometidos. No entanto, certo número de infecções por nocardia têm sido relatados em pacientes imunocompetentes. Nos últimos anos, observou-se um aumento da frequência de infecções por Nocardia spp. e, com o aumento do número de espécies descritas, a identificação correta tem sido de difícil obtenção mas de grande importância para a aplicação do tratamento correto e elucidação epidemiológica. O objetivo deste estudo foi caracterizar, por métodos fenotípicos e moleculares, 72 isolados de Nocardia spp. de interesse médico, avaliando as metodologias para elaborar um algoritmo de identificação. Os isolados foram provenientes da Micoteca do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo e da rotina do Núcleo de Tuberculose e Micobacterioses do Instituto Adolfo Lutz. Os isolados foram identificados por testes fenotípicos, identificação molecular por análise de restrição (PRA-hsp65), sequenciamento dos genes hsp65 e 16S rRNA e MALDI-TOF MS (Matrix-associated laser desorption time of flight mass spectrometry). O perfil de suscetibilidade foi analisado pelo método de Concentração Inibitória Mínima (MIC) e disco difusão (DD), com os fármacos: amicacina, ciprofloxacina, minociclina, tobramicina, amoxacilina+ácido clavulânico, imipenem e sulfametoxazol+trimetoprim. Os resultados revelaram que a identificação fenotípica foi insuficiente para definir as espécies. Apenas 24 (33,4%) isolados tiveram identificação fenotípica concordante com o sequenciamento do gene 16S rRNA. Na analise feita pela técnica de PRA-hsp65 foram observados 20 (27,8%) N. brasiliensis, seis (8,3%) isolados de outras espécies de nocardias e 38 (52,8%) foram considerados novos padrões (NP). Foi detectado um isolado misto e em cinco isolados não foi obtido produto de amplificação. O sequenciamento do gene hsp65 proporcionou a identificação de 51 isolados como Nocardia, 14 foram identificados como pertencentes a outros gêneros, dos quais, um apresentou mistura de nocardia e micobactéria, sendo identificado como Mycobacterium abscessus no gene hsp65 (análise in silico) e N. otitidiscaviarum no gene 16S rRNA. Sete isolados não foram sequenciados devido à ausência de amplificação do fragmento. Os isolados analisados através do sequenciamento do gene 16S rRNA, foram identificados como Nocardia (57-79,2%), Gordonia (7-9,7%), Rhodoccocus (3-4,2%), Tsukamurella (2-2,8%), Mycobacterium (2-2,8%) e Streptomyces (1-1,3%). Para a análise de MALDI-TOF MS foi observado que, dos 72 isolados estudados, 49 foram identificados como Nocardia, 11 como pertencentes a outros gêneros e 12 amostras não puderam ser identificadas devido aos valores de leitura não serem adequados para análise. Pela primeira vez o corante resazurina foi utilizado para leitura de MIC de Nocardia sp. Entre os fármacos testados através do MIC, os que apresentaram maior sensibilidade foram amicacina (100%) e tobramicina (84%). As maiores resistências foram encontradas com os fármacos sulfametoxazol+trimetoprim (76%) e imipenem (54%). Devido à ausência de critérios interpretativos de disco difusão para o gênero Nocardia, foi elaborado um critério para o presente estudo. Os resultados obtidos no teste de DD mostraram 100% de sensibilidade para os fármacos amicacina, minociclina e sulfametoxazol+trimetroprim. Os isolados apresentaram a maior porcentagem de resistência ao fármaco ciprofloxacina (64%). Comparando os resultados de DD com os obtidos no MIC, observamos que os fármacos ciprofloxacina, imipenem e sulfametoxazol+trimetoprim apresentaram porcentagem de discordância acima de 20%. O fármaco sulfametoxazol+trimetoprim teve a maior discordância (>75%), com elevada porcentagem de isolados resistentes na MIC, mas baixa porcentagem de resistência em DD. O único fármaco com 100% de concordância entre os resultados foi amicacina. Foi elaborado um algoritmo de identificação que utiliza técnicas fenotípicas para triagem para diferenciar nocardias de outros gêneros. A identificação por PRA-hsp65 será útil na rotina de laboratório de micobactérias como identificação presuntiva. A identificação definitiva das espécies deve ser obtida pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. / The genus Nocardia comprises filamentous gram-positive bacteria that usually cause disease only in immunocompromised individuals. However, a number of Nocardia infections have been reported in immunocompetent patients. Overall, it has been reported in the recent years an increased frequency of infections caused by Nocardia spp. due to an also increasing number of species, making the correct identification of the species more difficult. Correct identification assumes a major importance with respect to antimicrobial treatment\'s choice as well a for epidemiological investigation purposes. The objective of this study was to characterize by phenotypic and molecular methods 72 isolates of Nocardia spp. of medical interest, designing the methodologies for an identification algorithm. The isolates were obtained from the fungal collection of the Tropical Medicine Institute of São Paulo and the routine service of the Tuberculosis and Mycobacteriosis Center of the Adolfo Lutz Institute. The isolates were identified by phenotypic testing, molecular identification by restriction analysis (PRA-hsp65), hsp65 and 16S rRNA genes sequencing, and MALDI-TOF MS (matrix-associated laser desorption time-of-flight mass spectrometry). The susceptibility profile was analyzed by the Minimum Inhibitory Concentration method (MIC) and disk diffusion (DD), with the following drugs: amikacin, ciprofloxacin, minocycline, tobramycin, amoxicillin+ clavulanic acid, imipenem and sulfamethoxazole trimethoprim. The results showed that the phenotypic identification was insufficient to define the species. Only 24 (33.4%) of the isolates had phenotype identification that was concordant with the 16S rRNA gene sequencing. In the analysis made with the PRA-hsp65 technique were observed 20 (27.8%) N. brasiliensis and six (8.3%) isolates from other species of Nocardia spp., while 38 isolates (52.8%) were considered as new standards (NP). Also by this technique a mixed isolate was detected and an amplification product was not obtained in five isolates. The hsp65 gene sequencing provided identification of 51 isolates as Nocardia, 14 were identified as belonging to other genera, one of them being identified either as Mycobacterium abscessus by in silico analysis of the hsp65 gene and as N. otitidiscaviarum by the 16S rRNA gene sequencing. Seven isolates were not sequenced due to the absence of the amplified fragment. The isolates analyzed by 16S rRNA gene sequencing were identified as Nocardia (57 to 79.2%), Gordonia (7 to 9.7%), Rhodoccocus (3 to 4.2%), Tsukamurella (2-2, 8%), Mycobacterium (2 to 2.8%) and Streptomyces (1-1.3%). By MALDI-TOF MS analysis of the 72 isolates, 49 were identified as Nocardia, 11 were identified as belonging to other genera and 12 isolates could not be identified because the samples provided reading values that were inadequate for analysis. For the first time, to our knowledge, the resazurin dye was used to determine the MICs of Nocardia sp. Among the drugs tested, the most sensitives were amikacin (100%) and tobramycin (84%). The higher resistances were found with trimethoprim-sulfamethoxazole (76%) and imipenem (54%). Due to the absence of establishe criteria for the interpretation of the disk diffusion assay with Nocardia, we designed a specific criterion for this study. The results obtained in the DD test showed 100% sensitivity for the drugs amikacin, minocycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. The isolates showed the highest percentage of resistance to ciprofloxacin drug (64%). Comparing the results with those obtained with DD and MIC, we observed that ciprofloxacin, imipenem and sulfamethoxazole-trimethoprim showed a percentage of disagreement above 20%. The sulfamethoxazole-trimethoprim drug had the highest discrepancy (> 75%), with high percentage of resistant isolates with MIC but low percentage of resistance in DD. The only drug with 100% agreement between the both results was amikacin. We designed a recognition algorithm using phenotyping techniques to screen and differentiate nocardias from other genera. The identification by PRA-hsp65 will be useful in routine mycobacteria laboratory as a presumptive identification tool. The final identification of the species should be obtained by sequencing the 16S rRNA gene.

As enzimas lipolíticas vêm atraindo atenção no mercado global devido ao enorme potencial biotecnológico, como: na formulação de detergentes; na indústria de couro; produção de cosméticos, fármacos, aromas, biodiesel, etc. O objetivo deste trabalho foi prospectar genes codificadores de enzimas lipolíticas em biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel. A seleção foi feita pela atividade lipolítica através do cultivo dos clones em placa de petri e a avaliação foi pela observação de halo ao redor da colônia, sendo positiva para 30 clones dentre os quais dois se destacaram. Estes dois clones foram selecionados e subclonados. Os DNAs das sub-bibliotecas foram sequenciados, gerando um contig completo para cada clone. Através do ORF Finder foi identificado cinco ORFs de esterase/lipase, dentre as quais uma alcançou 58% de identidade com uma bactéria não cultivável. As árvores filogenéticas indicam que duas ORFs são similares à família IV das enzimas lipolíticas, enquanto que as outras três ORFs à família V. / Lipolytic enzymes have been attracting global market attention because they show enormous biotechnological potential. The present work was done as an attempt to find genes which codify lipolytic enzymes in a metagenomic library composed of diesel oil degradation microbe consortia. Clones were selected according to lipolytic activity and were then evaluated after cultivation in Petri dishes by observation of halo formation around the colonies. 30 clones produced halo formations and were identified as positives, two of which showed prominent results. These two were then selected and sub cloned. DNA from the sub libraries was sequenced, generating a complete contig for each clone. Using the ORF Finder five esterase/lipase ORFs were identified, with one of these attaining 58% of identity to a non cultivatable bacteria species. Assessment of the cladograms showed that two ORFs were similar to lipolytic enzyme family IV, while the other three ORFs were similar to family V.

Espécies microbianas, em especial as leveduras, são de grande importância para a produção de xilitol. A produção de xilitol envolve uma complicada regulação metabólica, incluindo o transporte de D-xilose, produção de enzimas fundamentais e cofator de regeneração. Assim, a triagem de microorganismos que consomem naturalmente D-xilose se torna uma maneira viável e eficaz para se obter organismos com possível aplicação industrial para a produção de xilitol. Neste trabalho foram isoladas vinte e oito leveduras provenientes do ambiente industrial da produção de etanol (torta de filtro) com habilidade de consumir D-xilose. O seqüenciamento e a identificação pela análise da região D1/D2 do gene do rDNA 26S demonstraram que todas pertencem ao gênero Candida, sendo 24 linhagens (85.71%) C. tropicalis e 4 linhagens (14.29%) C. rugosa. Das 28 linhagens isoladas, cinco linhagens de leveduras foram escolhidas aleatóriamente para o ensaio de bioconversão de D-xilose em xilitol devido ao fato das mesmas apresentarem velocidade de crescimento em D-xilose semelhantes. As linhagens selecionadas para o ensaio foram: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, pois representam bem a amostragem. Três leveduras pertencentes à coleção do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ / USP (kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 e Candida guilliermondii FTI 20037) foram utlizadas nos ensaios para obtenção de xilitol a partir da bioconversão da D-xilose como controle positivo. Para a formação de xilitol em meio sintético utilizando D-xilose como única fonte de carbono. Foram realizados ensaios da cinética de crescimento durante 96 horas de fermentação. Na primeira triagem, para a avaliação da melhor condição nutricional para o ensaio, as leveduras foram cultivadas em três meios quimicamente definidos: YNB 6.7 g L-1, UPX (uréia 2.3 g L-1 e peptona 6.6 g L-1) MCX (KH2PO4 0,62 g L-1; K2HPO4 2,0 g L-1; (NH4)2SO4 1,0 g L-1 MgSO4 1,1 g L-1, extrato de levedura 0.5 g L-1) acrescidos de 20 g L-1 de D-xilose, a 30°C e 120 rpm. O meio UPX apresentou o melhor rendimento, com uma produtividade volumetrica (Qp) entre 0,004 a 0,09, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) entre 0,23 a 0,28 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) entre 0.20 a 0.24 g g-1, com uma eficiência de 10 conversão (h) entre 21% a 26%.As leveduras C. tropicalis MVP 03; C. tropicalis MVP 16; C. rugosa MVP 17; C. rugosa MVP 21; C. tropicalis MVP 40 foram avaliadas em uma triagem, em meio UPX, com padronização do inóculo inicial. Para os cinco isolados, a produção de xilitol variou de 5,76 a 32,97 g L-1, a partir de 50 g L-1 de D-xilose com produtividade (Qp) de 0,06 a 0,35 g L-1 h-1, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) de 0,14 a 0,65 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) de 0,08 a 0,29 g g-1 e a eficiência de conversão (h) entre 6% e 61% que foi calculado segundo Barbosa et al 1988. Destacou-se a levedura C. tropicalis 16, produzindo 32,97 g L-1 de xilitol com um Qp de 0,35 g L-1 h-1, Yp/s de 0,65 g g-1, Y x/s de 0,11 g g-1 e eficiência de conversão (h) de 61 %. / Microbial species, particularly yeast, are of great importance for the production of xylitol. The xylitol production involves complicated metabolic regulation, including the transport of D-xylose, production of key enzymes and cofactor regeneration. Thus, screening of microorganisms that consume D-xylose naturally becomes a viable and effective way to obtain organisms with industrial application for the production of xylitol. In this work we isolated twenty-eight yeasts from the environment of the industrial production of ethanol (filter cake) with capacity to consume D-xylose. The sequencing and identification by analysis of the D1/D2 region of 26S rDNA gene showed that all belong to the genus Candida, and 24 strains (85.71%) C. tropicalis and 4 strains (14.29%) C. rugosa. Of the 28 isolates, five strains of yeast were selected randomly to test the bioconversion of D-xylose to xylitol due to the fact that they present rate of growth in D-xylose similar. The lines selected for testing were: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, and they represent a sampling. Three yeasts from the collection of the Department of Biological Sciences, ESALQ / USP (Kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 and Candida guilliermondii FTI 20037), used were the tests to obtain xylitol from the bioconversion of D-xylose as positive control, for the formation of xylitol in a synthetic medium using D-xylose as sole carbon source. Assays were performed in the kinetics of growth during 96 hours of fermentation. In the first evaluation, the evaluation of the best nutritional condition in the test, yeast cells were grown in three chemically defined media: YNB 6.7 g L-1, UPX (urea 2.3 g L-1 peptone and 6.6 g L-1) MCX ( KH2PO4 0.62 g L-1, K2HPO4 2.0 g L-1, (NH4)2SO4 1.0 g L-1 MgSO4 1.1 g L-1, yeast extract 0.5 g L-1) plus 20 g L-1 D-xylose at 30°C and 120 rpm. Mean UPX showed the best performance with a volumetric productivity (Qp) from 0.004 to 0.09, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) between 0,23 to 0,28 g g-1 conversion factor D-xylose in biomass (Yx/s) between 0.20 to 0.24 g g-1 Yeasts 0,20 to 0,24 g g-1, with a conversion efficiency (h) between 21% to 26%. C. tropicalis MVP 03, C. tropicalis MVP 16, C. rugosa MVP 17, C. rugosa MVP 21, C. tropicalis MVP 40 were evaluated in a screening, in media UPX, with standardization of initial inoculation. For 12 five isolates, the production of xylitol varied from 5.76 to 32.97 g L-1, from 50 g L-1 Dxylose with productivity (Qp) of 0.06 to 0,35 g L-1 h-1, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) 0.14 to 0.65 g g-1, the conversion factor of D-xylose in biomass (Yx/s) from 0.08 to 0.29 g g-1 and conversion efficiency (h) between 6% and 61% which was calculated according to Barbosa et al 1988. They outlined the yeast C. tropicalis MVP16, yielding 32.97 g L-1 of xylitol with a Qp of 0.35 g L-1 h-1, Yp/s to 0.65 g g-1, Y x/s of 0.11 g g -1 and conversion efficiency (h) of 61%.

Enzimas lipolíticas possuem enorme potencial biotecnológico. O objetivo foi prospectar genes para a codificação de enzimas lipolíticas em biblioteca metagenômica com 4224 clones. A atividade lipolítica foi avaliada pela formação de halo ao redor das colônias através do cultivo dos clones em meio de cultura suplementado com tributirina, sendo positiva para 30 clones, e dois foram selecionados e tiveram o DNA sub-clonado. Os DNAs das sub-bibliotecas foram sequenciados, gerando um contig completo para o clone PL28.F10, que foi comparado com as sequências do banco NCBI. Uma ORF codificadora de esterase/lipase de 303 aminoácidos e 61% de identidade com micro-organismo não cultivável foi encontrada. Árvores filogenéticas indicam que o clone possui a ORF15 mais próxima da família IV das esterases/lipases. Foi possível identificar os sítios ativos representativos da família, confirmando o resultado das árvores filogenéticas. Com sequências já patenteadas, a ORF15 é um grupo irmão das sequências de esterases/lipases da BASF e de uma proteína não identificada da CAMBIA. / Lipolytic enzymes have show enormous biotechnological potential. The work was done to find genes which codify lipolytic enzymes in a metagenomic library with 4224 clones. Clones were selected according to lipolytic activity and were assessed by cultivation in medium supplemented with tributyrin. Assessment was done by observation of halos formed around the colonies, with 30 clones producing halos. Of these, two were selected. DNA from the sub libraries was sequenced, generating a complete contig for clone PL28.F10 that was compared to sequences from the NCBI. An ORF of 303 amino acids with 61% of identity with uncunturable microorganism were found. The clone presented the ORF15 similar to that of lipolytic enzyme family IV. The alignments made possible the identification of active sites which represent the family, confirming the results obtained with the construction of the cladograms. The ORF15 showed similarities to patented BASF esterase/lipase and an unnamed protein of CAMBIA.

O guaraná, Paullinia cupana var. sorbilis, espécie nativa do Brasil é uma cultura de relevância para o país, principalmente nos estados da Bahia e Amazonas. O fruto contém substâncias estimulantes, como a cafeína, que conferem ao guaraná um grande potencial exploratório, visto que esta é uma das substâncias estimulantes mais consumidas no mundo. Apesar de sua importância, a cultura do guaraná é pouco estudada, portanto pouco se sabe sobre sua genética e as interações microbianas existentes, tanto em relação aos microrganismos endofíticos e epifíticos, quanto em relação aos patógenos. De tal forma que a cultura do guaraná na região Amazônica vem sendo afetada por condições fitossanitárias desfavoráveis, como a presença do fungo do gênero Colletotrichum, causador da antracnose, doença considerada uma ameaça à produção comercial do guaraná. Assim, visando compreender a dinâmica envolvida na interação planta - microrganismos e o possível controle da antracnose, o presente trabalho acessou a comunidade bacteriana associada às folhas com e sem sintomas de antracnose, de forma independente e dependente de cultivo; bem como, investigou o potencial biotecnológico e de biocontrole dos isolados bacterianos. A comunidade bacteriana acessada de forma dependente e independente de cultivo apresentaram similaridades, como maior valor de riqueza e menor diversidade bacteriana em folhas assintomáticas, quando comparadas com folhas sintomáticas, e com relação ao filo Proteobacteria, mais abundantemente acessado nas duas comunidades. Comparações realizadas com isolados bacterianos acessados epi e endofiticamente de folhas com e sem sintoma da antracnose apontaram que o aparecimento da doença antracnose na folha pareceu ser o fator que mais influenciou na estrutura da comunidade bacteriana. Com relação às diferenças entre tecidos sintomáticos e assintomáticos, foi possível identificar alguns gêneros abundantes mais frequentemente acessados em plantas sintomáticas, sendo que os gêneros Pseudomonas, Stenotrophomonas e Pantoea foram acessados em grande frequência tanto de forma dependente como independente de cultivo. Porém, de forma independente de cultivo foram acessados outros táxons abundantes que diferiram significativamente entre as plantas, sendo que folhas sintomáticas apresentaram Acinetobacter, Acidobacter_GP1 e Sphingobacteria, e em folhas assintomáticas foram acessados os táxons Methylobacterium, Beijerinckia, Bacilli e um grupo de Rhizobiales não classificados. Além disto, os microrganismos endofíticos e epifíticos cultivados foram testados com o fitopatógeno Colletotrichum sp. em ensaios de antagonismos, sendo que isolados do gênero Bacillus, Stenotrophomonas, Pantoea, Erwinia, Entereobacter, Pseudomonas, entre outros, apresentaram inibição do crescimento do fungo fitopatogênico. As bactérias cultivadas ainda foram testadas quanto ao potencial biotecnológico de produção de enzimas hidrolíticas e sideróforo. Muitos isolados apresentaram produção de protease e sideróforo. Foi possível também correlacionar a produção das enzimas amilase, lipase e poligalacturanase com os isolados provenientes de tecidos sintomáticos. / Guarana, Paullinia cupana var. sorbilis, is a native culture of Brazil that has relevance to the country, mainly in the states of Bahia and Amazonas. The fruit contains stimulants substances, such as caffeine, that gives a high exploration potential to the culture, since this is one of the most consumed stimulant substance in the world. Despite its importance, the culture of guarana hasnt gotten much of attention, and little is known about its genetics and microbial interactions with both epiphytic and endophytic microorganisms, and in relation to pathogens. So, the guarana culture in the Amazon region has been affected by bad phytosanitary conditions, such as the presence of the fungi Colletotrichum, which causes anthracnose disease thats considered a threat to guarana commercial production. Thus, to understand the dynamics involved in the interaction plant-microorganism and the possible control of anthracnose, this study accessed the bacterial community associated to leaves with and without anthracnose symptoms, combining culture-dependent and -independent methodologies and also investigated the biotechnology potential and biocontrol of culture-dependent bacteria. The bacterial community accessed by culture-dependent and -independent manner presented similarities, both presented higher bacterial richness but lower bacterial diversity in asymptomatic leaves when compared with symptomatic leaves, and both communities presented the Proteobacteria phylum as the most abundant one. Comparisons between the endophytic and epiphytic bacterial isolates associated with leaves with and without anthracnose symptoms showed that the onset of anthracnose disease on leaf seemed to be the most important factor that modified the bacterial community structure. Regarding the differences between symptomatic and asymptomatic tissue it was possible to identify some genera most frequently accessed in symptomatic plants such as Pseudomonas, Stenotrophomonas and Pantoea accessed in both culture-dependent and independent methodologies. However, the cultureindependent approach of bacterial accessed others abundants taxa that differed significantly between plants. Symptomatic leaves showed Acinetobacter, Acidobacter_GP1 and Sphingobacteria and asymptomatic leaves presented taxa Methylobacterium, Beijerinckia, group Bacilli and a group of unclassified Rhizobiales. In addition, endophytic and epiphytic isolates microorganisms were tested with the pathogen Colletotrichum sp. in antagonism assays, and isolates from the genus Bacillus, Stenotrophomonas, Pantoea, Erwinia, Entereobacter, Pseudomonas, and others, showed inhibition of growth of the fungus. The bacterial isolates were also tested for production of hydrolytic enzymes and siderophore. Many isolates showed protease and siderophore production. It was possible to correlate the production of amylase, lipase and poligalacturanase with isolates from symptomatic tissue.

Espécies microbianas, em especial as leveduras, são de grande importância para a produção de xilitol. A produção de xilitol envolve uma complicada regulação metabólica, incluindo o transporte de D-xilose, produção de enzimas fundamentais e cofator de regeneração. Assim, a triagem de microorganismos que consomem naturalmente D-xilose se torna uma maneira viável e eficaz para se obter organismos com possível aplicação industrial para a produção de xilitol. Neste trabalho foram isoladas vinte e oito leveduras provenientes do ambiente industrial da produção de etanol (torta de filtro) com habilidade de consumir D-xilose. O seqüenciamento e a identificação pela análise da região D1/D2 do gene do rDNA 26S demonstraram que todas pertencem ao gênero Candida, sendo 24 linhagens (85.71%) C. tropicalis e 4 linhagens (14.29%) C. rugosa. Das 28 linhagens isoladas, cinco linhagens de leveduras foram escolhidas aleatóriamente para o ensaio de bioconversão de D-xilose em xilitol devido ao fato das mesmas apresentarem velocidade de crescimento em D-xilose semelhantes. As linhagens selecionadas para o ensaio foram: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, pois representam bem a amostragem. Três leveduras pertencentes à coleção do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ / USP (kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 e Candida guilliermondii FTI 20037) foram utlizadas nos ensaios para obtenção de xilitol a partir da bioconversão da D-xilose como controle positivo. Para a formação de xilitol em meio sintético utilizando D-xilose como única fonte de carbono. Foram realizados ensaios da cinética de crescimento durante 96 horas de fermentação. Na primeira triagem, para a avaliação da melhor condição nutricional para o ensaio, as leveduras foram cultivadas em três meios quimicamente definidos: YNB 6.7 g L-1, UPX (uréia 2.3 g L-1 e peptona 6.6 g L-1) MCX (KH2PO4 0,62 g L-1; K2HPO4 2,0 g L-1; (NH4)2SO4 1,0 g L-1 MgSO4 1,1 g L-1, extrato de levedura 0.5 g L-1) acrescidos de 20 g L-1 de D-xilose, a 30°C e 120 rpm. O meio UPX apresentou o melhor rendimento, com uma produtividade volumetrica (Qp) entre 0,004 a 0,09, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) entre 0,23 a 0,28 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) entre 0.20 a 0.24 g g-1, com uma eficiência de 10 conversão (h) entre 21% a 26%.As leveduras C. tropicalis MVP 03; C. tropicalis MVP 16; C. rugosa MVP 17; C. rugosa MVP 21; C. tropicalis MVP 40 foram avaliadas em uma triagem, em meio UPX, com padronização do inóculo inicial. Para os cinco isolados, a produção de xilitol variou de 5,76 a 32,97 g L-1, a partir de 50 g L-1 de D-xilose com produtividade (Qp) de 0,06 a 0,35 g L-1 h-1, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) de 0,14 a 0,65 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) de 0,08 a 0,29 g g-1 e a eficiência de conversão (h) entre 6% e 61% que foi calculado segundo Barbosa et al 1988. Destacou-se a levedura C. tropicalis 16, produzindo 32,97 g L-1 de xilitol com um Qp de 0,35 g L-1 h-1, Yp/s de 0,65 g g-1, Y x/s de 0,11 g g-1 e eficiência de conversão (h) de 61 %. / Microbial species, particularly yeast, are of great importance for the production of xylitol. The xylitol production involves complicated metabolic regulation, including the transport of D-xylose, production of key enzymes and cofactor regeneration. Thus, screening of microorganisms that consume D-xylose naturally becomes a viable and effective way to obtain organisms with industrial application for the production of xylitol. In this work we isolated twenty-eight yeasts from the environment of the industrial production of ethanol (filter cake) with capacity to consume D-xylose. The sequencing and identification by analysis of the D1/D2 region of 26S rDNA gene showed that all belong to the genus Candida, and 24 strains (85.71%) C. tropicalis and 4 strains (14.29%) C. rugosa. Of the 28 isolates, five strains of yeast were selected randomly to test the bioconversion of D-xylose to xylitol due to the fact that they present rate of growth in D-xylose similar. The lines selected for testing were: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, and they represent a sampling. Three yeasts from the collection of the Department of Biological Sciences, ESALQ / USP (Kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 and Candida guilliermondii FTI 20037), used were the tests to obtain xylitol from the bioconversion of D-xylose as positive control, for the formation of xylitol in a synthetic medium using D-xylose as sole carbon source. Assays were performed in the kinetics of growth during 96 hours of fermentation. In the first evaluation, the evaluation of the best nutritional condition in the test, yeast cells were grown in three chemically defined media: YNB 6.7 g L-1, UPX (urea 2.3 g L-1 peptone and 6.6 g L-1) MCX ( KH2PO4 0.62 g L-1, K2HPO4 2.0 g L-1, (NH4)2SO4 1.0 g L-1 MgSO4 1.1 g L-1, yeast extract 0.5 g L-1) plus 20 g L-1 D-xylose at 30°C and 120 rpm. Mean UPX showed the best performance with a volumetric productivity (Qp) from 0.004 to 0.09, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) between 0,23 to 0,28 g g-1 conversion factor D-xylose in biomass (Yx/s) between 0.20 to 0.24 g g-1 Yeasts 0,20 to 0,24 g g-1, with a conversion efficiency (h) between 21% to 26%. C. tropicalis MVP 03, C. tropicalis MVP 16, C. rugosa MVP 17, C. rugosa MVP 21, C. tropicalis MVP 40 were evaluated in a screening, in media UPX, with standardization of initial inoculation. For 12 five isolates, the production of xylitol varied from 5.76 to 32.97 g L-1, from 50 g L-1 Dxylose with productivity (Qp) of 0.06 to 0,35 g L-1 h-1, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) 0.14 to 0.65 g g-1, the conversion factor of D-xylose in biomass (Yx/s) from 0.08 to 0.29 g g-1 and conversion efficiency (h) between 6% and 61% which was calculated according to Barbosa et al 1988. They outlined the yeast C. tropicalis MVP16, yielding 32.97 g L-1 of xylitol with a Qp of 0.35 g L-1 h-1, Yp/s to 0.65 g g-1, Y x/s of 0.11 g g -1 and conversion efficiency (h) of 61%.

Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:31:31Z No. of bitstreams: 1 FRANCISCO CAMPELLO DO AMARAL MELLO.pdf: 4429617 bytes, checksum: 52094842a3a3338e4a177971547f3a05 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FRANCISCO CAMPELLO DO AMARAL MELLO.pdf: 4429617 bytes, checksum: 52094842a3a3338e4a177971547f3a05 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Nos últimos anos, dois assuntos relacionados a infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) vêm sendo foco de muitos debates e estudos por pesquisadores ao redor do mundo: o tratamento antiviral contra a hepatite B crônica e a infecção oculta pelo HBV. O estudo da ocorrência de mutações de resistência aos medicamentos antivirais mais potentes, os análogos de núcleos(t)ídeos (NAs), que representa o maior entrave para o sucesso do tratamento, passou a ter fundamental importância para o entendimento da dinâmica da terapia a longo prazo e para soluções para contornar este problema. A hepatite B oculta é um tema que preocupa pesquisadores do mundo inteiro pelo fato de algumas questões pertinentes ainda não tenham sido esclarecidas, como o impacto clínico da infecção oculta e seu papel na transmissão do vírus. A presente tese teve como objetivo realizar a caracterização molecular de isolados do HBV em diversas populações de indivíduos com hepatite B: pacientes com infecção crônica submetidos a diferentes tratamentos antivirais (avaliando os tipos de tratamento antiviral atualmente utilizados no Brasil, a eficiência global de cada tratamento em reduzir os níveis de DNA do HBV e a freqüência de isolados com mutação de resistência aos medicamentos), pacientes com infecção aguda (observando a distribuição de genótipos e analisando a presença de subpopulações virais através do pirosequenciamento), e pacientes com infecção oculta pelo HBV (comparando a prevalência da infecção oculta pelo HBV em pacientes anti-HCV positivo e anti-HCV-negativo submetidos à hemodiálise). Como principais resultados obtidos nos quatro manuscritos produzidos, tivemos (i) a LAM como a terapia antiviral mais comum em uso no Brasil, com mais de 80% dos pacientes analisados estando em tratamento com esta droga seja em monoterapia ou em terapia combinada com outra droga; (ii) o tratamento com IFN-α como o menos eficiente em reduzir o DNA do HBV e, em relação aos NAs, não foi encontrada uma diferença significativa entre a terapia com LAM e a terapia com os demais agentes orais em relação à eficiência em reduzir o DNA do HBV no soro dos pacientes, no entanto, as cargas virais nos pacientes tratados com LAM foram muito mais altas do que nos pacientes tratados com as drogas mais recentes; (iii) uma alta freqüência de isolados com mutações de resistência à LAM em pacientes submetidos à monoterapia (quase 50%) ou à terapia combinada (78%); (iv) uma alta incidência de isolados com a tripla mutação de resistência à LAM (6/27; 22,2%) e uma diferença no perfil dos variantes YMDD entre os principais genótipos do HBV circulando no Brasil; (v) a análise por pirosequeciamento de subpopulações de vírus resistentes em indivíduos com hepatite B aguda mostrou que 45% deles apresentaram subpopulações minoritárias de isolados resistentes à LAM que alcançaram até quase 20% da população total, informação útil caso estes indivíduos venham a necessitar de tratamento; (vi) uma prevalência de 15% de infecção oculta pelo HBV em pacientes em programa regular de hemodiálise, não havendo diferença significativa entre os anti-HCV-negativo e anti-HCV-positivo; (vii) uma alta incidência (4/6; 66,7%) de isolados com mutações de resistência à LAM dentre os pacientes com hepatite oculta apesar de nenhum dos pacientes estudados terem sido previamente tratados para a infecção crônica pelo HBV; (viii) a demonstração que a presença exclusiva da substituição sY100C, potencialmente capaz de alterar a conformação do HBsAg, não diminuiu nem a produção nem a secreção desta proteína em comparação com o HBsAg produzido por vírus selvagens. Em conclusão, a alta freqüência de isolados com mutações de resistência à LAM pode limitar o uso de drogas como o ETV e a LdT para terapia de resgate em função da ocorrência de resistência cruzada entre essas drogas. As alterações de aminoácidos no HBsAg (sE164D+sI195M) causadas pela tripla mutação de resistência à LAM, conhecidas por reduzir a afinidade de ligação deste antígeno com o anti-HBs, pode representar um sério problema epidemiológico caso esses isolados passem a circular no ambiente disseminados pela população em geral. Tais substituições podem ter contribuído para o caráter oculto da infecção por diminuírem a detecção do HBsAg por testes sorológicos, sugerindo ser esta a causa mais provável da ocorrência de infecção oculta nos pacientes em hemodiálise. / In recent years, two issues related to hepatitis B virus (HBV) infection have been the focus of many discussions and studies by researchers around the world: antiviral therapy against chronic hepatitis B and occult HBV infection. Studies of the occurrence of resistance mutations to the nucleos(t)ide analogue (NAs) drugs, which represents the main hindrance to successful treatment, have been of fundamental importance for understanding the dynamics of long-term therapy and to propose solutions to overcome this problem. The second issue concerns the occult HBV infection. Occult hepatitis B is a subject that worries researchers worldwide. This concern is based on some relevant issues that remain unclear, as the clinical impact of occult infection and its role in transmitting the virus. This thesis aimed to perform the molecular characterization of HBV isolates in patients undergoing antiviral treatments (assessing the types of antiviral treatment currently used in Brazil, the overall efficiency of each treatment in reducing the levels of HBV DNA and the frequency of isolates with drug resistance mutations), to analyze patients with acute infection (determining HBV genotype distribution and the presence of viral subpopulations by pyrosequencing, and in patients with occult HBV infection (comparing the prevalence of occult HBV infection in anti-HCV-positive and anti-HCV-negative patients on hemodialysis). As the main results obtained in the four manuscripts produced, we had (i) LAM as the most common antiviral therapy used in Brazil, with more than 80% of the analyzed patients being treated with this drug either alone or in combination therapy with another drug; (ii) treatment with IFN-α proved to be the least effective in reducing HBV DNA and for the NAs, no significant difference between therapy with LAM and therapy with other oral agents regarding efficiency in reducing HBV DNA in serum of patients was found, however, viral loads in patients treated with LAM were much higher than in patients treated with newer drugs; (iii) a high frequency of isolates with LAM resistance mutations in patients on monotherapy (almost 50%) or combined therapy (78%); (iv) a high incidence of isolates with the triple resistance mutation to LAM (6/27; 22.2%) and a difference in the profile of YMDD variants among the major HBV genotypes circulating in Brazil; (v) pyrosequencing analysis of subpopulations of drugresistant viruses in patients with acute HBV infection showed that 45% of the individuals had minor subpopulations of LAM-resistant, isolates varying from 4 to 17%. The screening of the subpopulations provides a useful information to avoid the occurrence of drug-resistance whether these individuals become chronic carries and need to start an antiviral treatment; (vi) a prevalence of occult HBV infection of 15% in patients on regular hemodialysis program, with no significant difference between anti-HCV-negative and anti-HCV-positive patients; (vii) a high incidence (4/6; 66.7%) of isolates with LAM resistance mutations among patients with occult hepatitis although none of them had been treated for chronic HBV infection; (viii) demonstrated that the exclusive presence of the substitution sY100C, potentially able to alter the conformation of HBsAg, did not reduced neither the production nor the secretion of this protein compared to HBsAg produced by wild-type viruses. In conclusion, the high frequency of LAM-resistant isolates may limit the use of drugs such as ETV and LdT for rescue therapy due to the occurrence of cross resistance between these drugs.The amino acid substitutions in HBsAg (sE164D+sI195M) caused by LAM triple mutation, known to reduce the binding affinity of this antigen to anti-HBs, may represent a serious epidemiological problem if these viruses begin to circulate in the environment and to spread in the general population. Such substitutions may have contributed to the occult status of the infection by decreasing the detection of HBsAg by serological tests, suggesting that this is the most likely cause of the occurrence of occult infection in hemodialysis patients.

O gênero Nocardia é composto por bactérias gram-positivas e filamentosas, que normalmente só causam doença em indivíduos imunocomprometidos. No entanto, certo número de infecções por nocardia têm sido relatados em pacientes imunocompetentes. Nos últimos anos, observou-se um aumento da frequência de infecções por Nocardia spp. e, com o aumento do número de espécies descritas, a identificação correta tem sido de difícil obtenção mas de grande importância para a aplicação do tratamento correto e elucidação epidemiológica. O objetivo deste estudo foi caracterizar, por métodos fenotípicos e moleculares, 72 isolados de Nocardia spp. de interesse médico, avaliando as metodologias para elaborar um algoritmo de identificação. Os isolados foram provenientes da Micoteca do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo e da rotina do Núcleo de Tuberculose e Micobacterioses do Instituto Adolfo Lutz. Os isolados foram identificados por testes fenotípicos, identificação molecular por análise de restrição (PRA-hsp65), sequenciamento dos genes hsp65 e 16S rRNA e MALDI-TOF MS (Matrix-associated laser desorption time of flight mass spectrometry). O perfil de suscetibilidade foi analisado pelo método de Concentração Inibitória Mínima (MIC) e disco difusão (DD), com os fármacos: amicacina, ciprofloxacina, minociclina, tobramicina, amoxacilina+ácido clavulânico, imipenem e sulfametoxazol+trimetoprim. Os resultados revelaram que a identificação fenotípica foi insuficiente para definir as espécies. Apenas 24 (33,4%) isolados tiveram identificação fenotípica concordante com o sequenciamento do gene 16S rRNA. Na analise feita pela técnica de PRA-hsp65 foram observados 20 (27,8%) N. brasiliensis, seis (8,3%) isolados de outras espécies de nocardias e 38 (52,8%) foram considerados novos padrões (NP). Foi detectado um isolado misto e em cinco isolados não foi obtido produto de amplificação. O sequenciamento do gene hsp65 proporcionou a identificação de 51 isolados como Nocardia, 14 foram identificados como pertencentes a outros gêneros, dos quais, um apresentou mistura de nocardia e micobactéria, sendo identificado como Mycobacterium abscessus no gene hsp65 (análise in silico) e N. otitidiscaviarum no gene 16S rRNA. Sete isolados não foram sequenciados devido à ausência de amplificação do fragmento. Os isolados analisados através do sequenciamento do gene 16S rRNA, foram identificados como Nocardia (57-79,2%), Gordonia (7-9,7%), Rhodoccocus (3-4,2%), Tsukamurella (2-2,8%), Mycobacterium (2-2,8%) e Streptomyces (1-1,3%). Para a análise de MALDI-TOF MS foi observado que, dos 72 isolados estudados, 49 foram identificados como Nocardia, 11 como pertencentes a outros gêneros e 12 amostras não puderam ser identificadas devido aos valores de leitura não serem adequados para análise. Pela primeira vez o corante resazurina foi utilizado para leitura de MIC de Nocardia sp. Entre os fármacos testados através do MIC, os que apresentaram maior sensibilidade foram amicacina (100%) e tobramicina (84%). As maiores resistências foram encontradas com os fármacos sulfametoxazol+trimetoprim (76%) e imipenem (54%). Devido à ausência de critérios interpretativos de disco difusão para o gênero Nocardia, foi elaborado um critério para o presente estudo. Os resultados obtidos no teste de DD mostraram 100% de sensibilidade para os fármacos amicacina, minociclina e sulfametoxazol+trimetroprim. Os isolados apresentaram a maior porcentagem de resistência ao fármaco ciprofloxacina (64%). Comparando os resultados de DD com os obtidos no MIC, observamos que os fármacos ciprofloxacina, imipenem e sulfametoxazol+trimetoprim apresentaram porcentagem de discordância acima de 20%. O fármaco sulfametoxazol+trimetoprim teve a maior discordância (>75%), com elevada porcentagem de isolados resistentes na MIC, mas baixa porcentagem de resistência em DD. O único fármaco com 100% de concordância entre os resultados foi amicacina. Foi elaborado um algoritmo de identificação que utiliza técnicas fenotípicas para triagem para diferenciar nocardias de outros gêneros. A identificação por PRA-hsp65 será útil na rotina de laboratório de micobactérias como identificação presuntiva. A identificação definitiva das espécies deve ser obtida pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. / The genus Nocardia comprises filamentous gram-positive bacteria that usually cause disease only in immunocompromised individuals. However, a number of Nocardia infections have been reported in immunocompetent patients. Overall, it has been reported in the recent years an increased frequency of infections caused by Nocardia spp. due to an also increasing number of species, making the correct identification of the species more difficult. Correct identification assumes a major importance with respect to antimicrobial treatment\'s choice as well a for epidemiological investigation purposes. The objective of this study was to characterize by phenotypic and molecular methods 72 isolates of Nocardia spp. of medical interest, designing the methodologies for an identification algorithm. The isolates were obtained from the fungal collection of the Tropical Medicine Institute of São Paulo and the routine service of the Tuberculosis and Mycobacteriosis Center of the Adolfo Lutz Institute. The isolates were identified by phenotypic testing, molecular identification by restriction analysis (PRA-hsp65), hsp65 and 16S rRNA genes sequencing, and MALDI-TOF MS (matrix-associated laser desorption time-of-flight mass spectrometry). The susceptibility profile was analyzed by the Minimum Inhibitory Concentration method (MIC) and disk diffusion (DD), with the following drugs: amikacin, ciprofloxacin, minocycline, tobramycin, amoxicillin+ clavulanic acid, imipenem and sulfamethoxazole trimethoprim. The results showed that the phenotypic identification was insufficient to define the species. Only 24 (33.4%) of the isolates had phenotype identification that was concordant with the 16S rRNA gene sequencing. In the analysis made with the PRA-hsp65 technique were observed 20 (27.8%) N. brasiliensis and six (8.3%) isolates from other species of Nocardia spp., while 38 isolates (52.8%) were considered as new standards (NP). Also by this technique a mixed isolate was detected and an amplification product was not obtained in five isolates. The hsp65 gene sequencing provided identification of 51 isolates as Nocardia, 14 were identified as belonging to other genera, one of them being identified either as Mycobacterium abscessus by in silico analysis of the hsp65 gene and as N. otitidiscaviarum by the 16S rRNA gene sequencing. Seven isolates were not sequenced due to the absence of the amplified fragment. The isolates analyzed by 16S rRNA gene sequencing were identified as Nocardia (57 to 79.2%), Gordonia (7 to 9.7%), Rhodoccocus (3 to 4.2%), Tsukamurella (2-2, 8%), Mycobacterium (2 to 2.8%) and Streptomyces (1-1.3%). By MALDI-TOF MS analysis of the 72 isolates, 49 were identified as Nocardia, 11 were identified as belonging to other genera and 12 isolates could not be identified because the samples provided reading values that were inadequate for analysis. For the first time, to our knowledge, the resazurin dye was used to determine the MICs of Nocardia sp. Among the drugs tested, the most sensitives were amikacin (100%) and tobramycin (84%). The higher resistances were found with trimethoprim-sulfamethoxazole (76%) and imipenem (54%). Due to the absence of establishe criteria for the interpretation of the disk diffusion assay with Nocardia, we designed a specific criterion for this study. The results obtained in the DD test showed 100% sensitivity for the drugs amikacin, minocycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. The isolates showed the highest percentage of resistance to ciprofloxacin drug (64%). Comparing the results with those obtained with DD and MIC, we observed that ciprofloxacin, imipenem and sulfamethoxazole-trimethoprim showed a percentage of disagreement above 20%. The sulfamethoxazole-trimethoprim drug had the highest discrepancy (> 75%), with high percentage of resistant isolates with MIC but low percentage of resistance in DD. The only drug with 100% agreement between the both results was amikacin. We designed a recognition algorithm using phenotyping techniques to screen and differentiate nocardias from other genera. The identification by PRA-hsp65 will be useful in routine mycobacteria laboratory as a presumptive identification tool. The final identification of the species should be obtained by sequencing the 16S rRNA gene.

Orientador: Hildete Prisco Pinheiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Cientifica / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:58:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grandin_LoriCristina_M.pdf: 676646 bytes, checksum: 180775a0f53ffb688d7c1603339ff1b8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O avanço do sequenciamento dos genes tem incentivado o desenvolvimento de novas técnicas estatísticas para analisar dados genéticos. Nesse trabalho, os modelos logísticos regressivos, introduzidos por Bonney (1986), são apresentados primeiramente no contexto de análise de dados de família e posteriormente esses modelos são utilizados para analisar freqüências de códons em seqüências de DNA mitocondrial. Considerar independência entre os nucleotídeos no códon pode ser uma suposição muito forte, ou seja, biologicamente irreal. Por isso, várias estruturas de dependência são apresentadas para analisar as freqüências dos códons. Por exemplo, uma estrutura markoviana de primeira ordem pode ser adequada para explicar a dependência das bases no códon. A função de log-verossimilhança é avaliada e várias comparações são feitas para analisar qual o modelo mais parcimonioso. Aplicações desses modelos são feitas utilizando-se dados reais de seqüências do gene NADH4 do genoma mitocondrial humano / Abstract: The advance of gene sequencing has stimulated the development of new statistical techniques to analyze genetic data. In this work the logistic regressive models, introduced by Bonney (1986), are presented first in the context of analysis of familial data and then they are used to analyze codon frequencies in mitochondrial DNA sequences. The assumption of independence among nucleotide frequencies in a codon can be a very strong one, or biologically unreal. In view of this, several structures of dependence are presented to analyze the codon frequencies. For example, a first order Markovian structure can be appropriate to explain the dependence of the base frequencies in the codon. The log-likelihood function is evaluated and several comparisons are made to analyze which is the most parcimonious model. Applications of these models are made using real data of NADH4 gene sequences of the human mitochondrial genome / Mestrado / Bioestatistica / Mestre em Estatística

O guaraná, Paullinia cupana var. sorbilis, espécie nativa do Brasil é uma cultura de relevância para o país, principalmente nos estados da Bahia e Amazonas. O fruto contém substâncias estimulantes, como a cafeína, que conferem ao guaraná um grande potencial exploratório, visto que esta é uma das substâncias estimulantes mais consumidas no mundo. Apesar de sua importância, a cultura do guaraná é pouco estudada, portanto pouco se sabe sobre sua genética e as interações microbianas existentes, tanto em relação aos microrganismos endofíticos e epifíticos, quanto em relação aos patógenos. De tal forma que a cultura do guaraná na região Amazônica vem sendo afetada por condições fitossanitárias desfavoráveis, como a presença do fungo do gênero Colletotrichum, causador da antracnose, doença considerada uma ameaça à produção comercial do guaraná. Assim, visando compreender a dinâmica envolvida na interação planta - microrganismos e o possível controle da antracnose, o presente trabalho acessou a comunidade bacteriana associada às folhas com e sem sintomas de antracnose, de forma independente e dependente de cultivo; bem como, investigou o potencial biotecnológico e de biocontrole dos isolados bacterianos. A comunidade bacteriana acessada de forma dependente e independente de cultivo apresentaram similaridades, como maior valor de riqueza e menor diversidade bacteriana em folhas assintomáticas, quando comparadas com folhas sintomáticas, e com relação ao filo Proteobacteria, mais abundantemente acessado nas duas comunidades. Comparações realizadas com isolados bacterianos acessados epi e endofiticamente de folhas com e sem sintoma da antracnose apontaram que o aparecimento da doença antracnose na folha pareceu ser o fator que mais influenciou na estrutura da comunidade bacteriana. Com relação às diferenças entre tecidos sintomáticos e assintomáticos, foi possível identificar alguns gêneros abundantes mais frequentemente acessados em plantas sintomáticas, sendo que os gêneros Pseudomonas, Stenotrophomonas e Pantoea foram acessados em grande frequência tanto de forma dependente como independente de cultivo. Porém, de forma independente de cultivo foram acessados outros táxons abundantes que diferiram significativamente entre as plantas, sendo que folhas sintomáticas apresentaram Acinetobacter, Acidobacter_GP1 e Sphingobacteria, e em folhas assintomáticas foram acessados os táxons Methylobacterium, Beijerinckia, Bacilli e um grupo de Rhizobiales não classificados. Além disto, os microrganismos endofíticos e epifíticos cultivados foram testados com o fitopatógeno Colletotrichum sp. em ensaios de antagonismos, sendo que isolados do gênero Bacillus, Stenotrophomonas, Pantoea, Erwinia, Entereobacter, Pseudomonas, entre outros, apresentaram inibição do crescimento do fungo fitopatogênico. As bactérias cultivadas ainda foram testadas quanto ao potencial biotecnológico de produção de enzimas hidrolíticas e sideróforo. Muitos isolados apresentaram produção de protease e sideróforo. Foi possível também correlacionar a produção das enzimas amilase, lipase e poligalacturanase com os isolados provenientes de tecidos sintomáticos. / Guarana, Paullinia cupana var. sorbilis, is a native culture of Brazil that has relevance to the country, mainly in the states of Bahia and Amazonas. The fruit contains stimulants substances, such as caffeine, that gives a high exploration potential to the culture, since this is one of the most consumed stimulant substance in the world. Despite its importance, the culture of guarana hasnt gotten much of attention, and little is known about its genetics and microbial interactions with both epiphytic and endophytic microorganisms, and in relation to pathogens. So, the guarana culture in the Amazon region has been affected by bad phytosanitary conditions, such as the presence of the fungi Colletotrichum, which causes anthracnose disease thats considered a threat to guarana commercial production. Thus, to understand the dynamics involved in the interaction plant-microorganism and the possible control of anthracnose, this study accessed the bacterial community associated to leaves with and without anthracnose symptoms, combining culture-dependent and -independent methodologies and also investigated the biotechnology potential and biocontrol of culture-dependent bacteria. The bacterial community accessed by culture-dependent and -independent manner presented similarities, both presented higher bacterial richness but lower bacterial diversity in asymptomatic leaves when compared with symptomatic leaves, and both communities presented the Proteobacteria phylum as the most abundant one. Comparisons between the endophytic and epiphytic bacterial isolates associated with leaves with and without anthracnose symptoms showed that the onset of anthracnose disease on leaf seemed to be the most important factor that modified the bacterial community structure. Regarding the differences between symptomatic and asymptomatic tissue it was possible to identify some genera most frequently accessed in symptomatic plants such as Pseudomonas, Stenotrophomonas and Pantoea accessed in both culture-dependent and independent methodologies. However, the cultureindependent approach of bacterial accessed others abundants taxa that differed significantly between plants. Symptomatic leaves showed Acinetobacter, Acidobacter_GP1 and Sphingobacteria and asymptomatic leaves presented taxa Methylobacterium, Beijerinckia, group Bacilli and a group of unclassified Rhizobiales. In addition, endophytic and epiphytic isolates microorganisms were tested with the pathogen Colletotrichum sp. in antagonism assays, and isolates from the genus Bacillus, Stenotrophomonas, Pantoea, Erwinia, Entereobacter, Pseudomonas, and others, showed inhibition of growth of the fungus. The bacterial isolates were also tested for production of hydrolytic enzymes and siderophore. Many isolates showed protease and siderophore production. It was possible to correlate the production of amylase, lipase and poligalacturanase with isolates from symptomatic tissue.