Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T18:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MachucaHerrera_AngelaElena_D.pdf: 8160555 bytes, checksum: a51de738a15ce680819592e7da08a4a0 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: No presente trabalho estudou-se a produção de extratos com atividade fenoloxidásica (FOx) pelo fungo termófilo lhermoasclls aurantiacus. Foram determinadas as melhores condições de cultivo para produção da atividade FOx em meio líquido. A adição de substratos polissacarídicos induziu altos teores de atividade, quando comparado com cultura contendo somente glicose. Farelo de trigo foi o melhor substrato, e em concentração de 1,5% (m/v) induziu níveis entre 1 a 2 UI/mL de atividade. O tipo e tamanho do inóculo afetaram significativamente a produção de atividade, porém a agitação e a oxigenação das culturas não tiveram efeitos significativos. Um pH inicial do meio de cultura entre 6 e 8 favoreceu a produção de atividade FOx. Quando substratos polissacarídicos foram adicionados à cultura, diversas atividades enzimáticas relacionadas à degradação de lignina, em menor ou maior grau, foram detectadas: lacase, peroxidase, manganês-peroxidase, celobiose-quinona oxidoreductase e álcool veratrílico-oxidase. Nas mesmas condições não foi detectada atividade lignina-peroxidase. Após estabelecer as melhores condições para produção de atividade FOx pelo Taurantiacus, foram produzidos extratos com alta atividade para estudos de caracterização cinética. A atividade FOx presente no extrato bruto apresentou características semelhantes às fenoloxidases do tipo lacase. O extrato bruto oxidou uma variedade de substratos típicos de fenoloxidases, na ausência de H202. As maiores atividades foram alcançadas com ácido 2,2'azino-bis-(3 etil benzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), 2,6-dimetóxifenol (2,6-DMF) e odianisidina. Azida sódica e ácido tioglicólico foram os mais potentes inibidores da reação de oxidação catalizada pelo extrato bruto, ambos típicos inibidores de oxidases que contêm metal. O pH ótimo da reação de oxidação de o-dianisidina foi de 2,8, porém a estabilidade neste pH foi rapidamente perdida após 5 horas de incubação. A temperatura ótima de reação foi observada entre 70 e 80°C, e a estabilidade térmica do extrato bruto foi extremamente elevada, conservando mais de 50% da atividade após 5 horas de incubação à 100°C. Todas as características apresentadas pelo extrato bruto foram semelhantes às da maioria das fenoloxidases de tipo lacase, exceto a elevada temperatura ótima e termoestabilidade, nunca descritas para fenoloxidases de fungos mesófilos ou termófilos. Na intenção de desvendar a natureza responsável pela atividade FOx, procedeu-se à purificação de uma fração contendo tal atividade, a partir das culturas de Tauralltiacus. O trabalho teve que ser redirecionado devido ao inesperado resultado desta etapa, uma vez que a fração com atividade FOx atravessou uma membrana de ultrafiltração de 1,0 kDa e eluiu de uma coluna de Sephadex G-l0 em um volume correspondente a uma massa molecular £ 700 Da. Este resultado, junto com a elevada estabilidade térmica, descartou a possibilidade da existência de uma lacase ou alguma outra enzima, como responsável pela atividade FOx. A fração com alta atividade FOx (fração FOx), parcialmente purificada por Sephadex G10, foi caracterizada quanto às propriedades cinéticas e estruturais. As propriedades de pH e temperatura ótimos de atividade e estabilidade, foram semelhantes às do extrato bruto. A fração FOx oxidou os mesmos substratos que o extrato bruto, porém com maiores velocidades. Somente o efeito de inibidores foi diferente, observando-se uma diminuição do efeito inibitório em relação ao extrato bruto. A suspeita da presença de um sideróforo (complexante de Fe de baixa massa molecular), responsável pela atividade FOx, presente no extrato bruto e na fração, levou à procura destes compostos nas culturas de T.aurantiacus, utilizando o reagente universal Chromo azurol S (CAS). Através deste método foi possível confirmar a produção de sideróforos pelo fungo, em meio sólido e líquido, sendo que em meio líquido a máxima produção de atividade FOx coincidiu com uma mínima reação CASo Porém, apesar dos resultados positivos em meio de cultura, a fração FOx não reagiu com CASo. A caracterização estrutural da fração FOx revelou uma estrutura tipo hidroxamato com uma massa molecular aproximada de 530 Da, aparentemente sem aminoácidos, e com alguns metais (Ca, Mg, Fe) participando desta estrutura. Todos os resultados de caracterização estrutural sugeriram que o composto responsável pela atividade FOx, era um sideróforo pertencente à classe dos hidroxamatos. Estes resultados e outros preliminares, sugerem um mecanismo de ação para a fração FOx, onde o Fe presente na fração seria o responsável pelo potencial de oxidação de diversos substratos. Resultados preliminares indicam também que o F e participante na reação de oxidação de o-dianisidina é Fe (II). Assim, parece que a fração FOx complexa Fe (III) e, posteriormente, quando necessário esse Fe (III) seria reduzido para Fe (II) pela própria fração. Visando a aplicação biotecnológica dos extratos com alta atividade FOx de T. aurantiacus, estes foram utilizados no tratamento de uma polpa Kraft de Eucalipto e de um efluente, resultante do processo Kraft. Os extratos ativos mostraram-se eficientes no tratamento das polpas, obtendo-se 39% de deslignificação após 60 minutos à 500C e pH 3,0, porém nestas condições uma redução da viscosidade foi observada. A adição de ABTS, como um mediador redox, não aumentou a eficiência de deslignificação observada na sua ausência. Os efluentes, após 72 horas de tratamento com o extrato ativo de J:aurantiacus, à 250C e pH 4,0, apresentaram 60 a 70% de redução de fenóis, dependendo das condições de incubação. Sob condições estacionárias, obteve-se 67% de despolimerização e 5% de mineralização das cloroligninas de elevada massa molecular. Ao mesmo tempo, sob condições agitadas obteve-se 47% de mineralização. A redução da cor variou de 61 a 35%, sob condições agitadas ou estacionárias, respectivamente / Abstract: This work involves the phenoloxidase activity (POx) production by the thermophilic fungus Thermoascus auralltiacus. The best conditions for POx activity production in liquid culture were determined. The addition of lignocellulosic and polyssacharides substrates to culture induced high leveI POx activity. The best substrate was the wheat bran which induced between 1-2 UI/mL, when utilized in concentration of 1.5% (w/v). The type and size of inoculum influenced the activity production, however the agitation and oxygenation of cultures did not affect it significantly. The initial pH between 6-8 supported the higher POx activity production. Different enzymatic activities related to lignin degradation such as laccase, peroxidase, Mn-peroxidase, cellobiose-quinone oxidoreductase and veratryl alcohol oxidase, but no ligninperoxidase, were detected in the cultures containing polyssacharides substrates. After the best conditions to POx activity production by Taurantiacus were established, crude extracts with high POx activity were utilized in the kinetic characterization. The POx activity showed similar characteristics to phenoloxidases laccase type. The crude extracts oxidized various typical substrates of phenoloxidases, in the absence of H202. The higher activities were produced with ABTS, 2,6-DMP and o-dianisidine. Typical inhibitors of oxidases containing metal, such as sodic azide and thioglycollic acid, were the most potent inhibitors of POx activity. The optimal pH for o-dianisidina oxidation was 2.8, but in this pH the stability was rapidly lost after 5 hours of incubation. The optimal temperature was found between 70 and 800C, and the crude extract showed an high thermostability, keeping more than 50% of activity after 5 hours of incubation at 100°C. All the characteristics of the crude extract were similar to phenoloxidases laccase type, except the high optimal temperature and thermostability, never report for phenoloxidases of mesophilic and thermophilic fungi. To elucidate the responsible nature for POx activity, the purification of an active fraction from Taurantiacus was conducted. The unexpected results of the purfication stage redirected this study. Because of that fraction with POx activity crossed over a 1 kDa ultrafiltration membrane, eluted from Sephadex G-10 column in a elution volume correponding with molecular mass of £ 700 Da, as well as presented high thermostability. The possibility of a laccase or some other enzyme to be responsible by POx activity was excluded. The kinetic and structural properties of the fraction partially purified by Sephadex G-10 with high POx activity, were studied. The properties of optimum pH and temperature for activity and stability were similar to those of the crude extract. The POx fraction oxidized the same substrates than the crude extract, but with higher rates. Unlike of the crude extract a decrease of inhibition was observed with POx fraction. The presence of a siderophore type compound (low-molecular mass Fe chelators) responsible by POx activity in the crude extracts as well in the partially purified fraction was then considered, and led to search for these compounds in the T.aurantiacus cultures, using the universal CAS reactive. Through this method the siderophore production by the fungus, in solid and liquid medium, was confirmed. The maximum production of POx activity in liquid medium coincided with a minimum CAS reaction. However, in spite of the positive results in culture medium, the POx fraction partially purified was not reactive with CAS. The structural characterization of partially purified POx fraction revealed a structure hydroxamate type with approximate molecular mass of 530 Da, apparently lacking aminoacids, and some metais (Ca, Mg, Fe) present in the structure. Thus, the existence of a siderophore hydroxamate type, responsible by POx activity, was suggested through of structural characterization. With these results an mechanism of substrate oxidation by POx fraction was proposed, in which Fe would be responsible by the oxidation of different substrates. Preliminary results showed that Fe is involved in the o-dianisidina oxidation as Fe(II). Apparently, the fraction possessed the ability to both chelate Fe(III) and reduce it to Fe(II), when necessary. The extracts with high POx activity fTom T.aurantiacus were used in biotechnological processes such as treatment of Eucalyptus Kraft pulps and effiuent result of Kraft processo The active extracts showed efficience on pulp biobleaching, with a 39% deslignification after 60 minutes at 500C and pH 3, however a viscosity reduction also was observed. The ABTS addition, as a redox mediator, it not increase the deslignification. After 72 hours of treatment with active extracts at 250C and pH 4, the effiuents showed between 60-70% phenol reduction, depending of incubation conditions. Under static conditions a 67% despolimerization and a 5% mineralization of chlorolignins high-molecular mass were observed. Under agitation conditions a 47% mineralization was observed. A colour reduction effiuent of61 or 35% was obtained under agitation or static conditions, respectively / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2012-10-21T04:03:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 197063.pdf: 4739712 bytes, checksum: ef93770211c4a688cb5a68d5034bb2c0 (MD5) / Estudou-se o cultivo em estado sólido de Thermoascus aurantiacus ATCC 204492, visando a produção de xilanases, a partir de dois resíduos agroindustriais: bagaço de mandioca e farelo de arroz. Na primeira etapa, o cultivo foi realizado em frascos e, posteriormente, no sistema de reatores de coluna denominado Sistema de Raimbault. Foram determinadas a melhor composição de resíduos e as melhores condições operacionais do sistema fermentativo. Avaliou-se, em todas as etapas, além da atividade de xilanases, as atividades das celulases carboximeticelulase e avicelase e das proteases totais. Na etapa final, alguns parâmetros cinéticos, relativos ao crescimento de Thermoascus aurantiacus e à produção de xilanases, em cultivo em estado sólido, foram determinados. A biomassa microbiana foi obtida pela medida do conteúdo de glicosamina, que foi padronizada com dados de massa micelial seca proveniente de um cultivo submerso. A partir destes dados, e da atividade da enzima, determinou-se os valores das velocidades específicas de crescimento celular e de formação do produto, mXMAX e mPMAX, respectivamente. Com os dados da biomassa e da velocidade de consumo de oxigênio (OUR) determinou-se os valores da velocidade específica de consumo de oxigênio (QO2), ao longo do tempo, além do fator de conversão oxigênio em célula, YX/O e do coeficiente de manutenção celular, mO.

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de β-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de β-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma β-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and β-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of β-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a β-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

A proposta desse trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas hidrolíticas pelo fungo termófilo Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 quando cultivado em resíduos agroindustriais e utilizá-las nas formas bruta ou purificada na hidrólise da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto, estudou-se a cinética de produção de xilanases e celulases em fermentação sólida, utilizando quatro diferentes tipos de resíduos agrícolas: bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo e sabugo de milho. Os extratos obtidos foram investigados quanto ao teor de xilanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase. A palha de cana-de-açúcar induziu as maiores atividades de xilanase em 9 dias (1679,8 UI/g) e de β-glicosidase em 6 dias (29,9 UI/g). Em sabugo de milho, o fungo produziu 46,0 UI/g de exoglucanase e 5,2 UI/g de β-xilosidase, em 17 dias. A maior produção de endoglucanase ocorreu em bagaço de cana-de-açúcar em 9 dias (108,9 UI/g). A carga inicial de inóculo foi avaliada para o meio preparado com bagaço e verificou-se que o aumento de 104 vezes no número de ascósporos influenciou somente a produção de exoglucanase, que teve sua atividade aumentada em 10 vezes. Após a determinação das atividades enzimáticas, o extrato de sabugo de milho foi aplicado em uma coluna trocadora de ânions, DEAE Sepharose CL6B, equilibrada em pH 3,5 e 6,0; a fim de se obter as enzimas em sua forma purificada. Pôde-se isolar uma xilanase, uma endoglucanase e uma β-glicosidase de massas molares 31,5 kDa, 32,4 kDa e 76,6 kDa, respectivamente. Os extratos enzimáticos do T. aurantiacus foram aplicados no bagaço de cana-de-açúcar in natura e na polpa celulósica do bagaço, obtendo 15 % de conversão enzimática da celulose (CEC), para ambos os substratos. Sendo assim, a polpa do bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratada com (1) proteases isoladas do abacaxi; (2) xilanase purificada de T. aurantiacus ou (3) ácido sulfúrico diluído. Em seguida foi feita a hidrólise do material pré-tratado com o extrato bruto de T. aurantiacus. O pré-tratamento com protease não teve efeito hidrolítico na polpa de bagaço, porém aumentou a CEC com as enzimas de T. aurantiacus de 9,4 % para 20,7 %. O pré-tratamento com a xilanase pura também não liberou açúcares redutores, contudo foi capaz de aumentar a CEC da polpa de bagaço para 30,0 %. O pré-tratamento com ácido diluído foi capaz de remover até 50 % da hemicelulose presente na polpa do bagaço, porém a remoção deste polissacarídeo não aumentou a CEC do bagaço com as enzimas de T. aurantiacus, mantendo o mesmo valor de CEC (15 %). / The purpose of this work was to study the production profile of hydrolytic enzymes of the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus ATCC 204492 when cultivated in agroindustrial residues and to use them in the forms crude or purified for the hydrolysis of the cellulosic pulp of the sugarcane bagasse. For so much, it was studied the kinetics of xylanases and cellulases production on solid fermentation, using four different types of agricultural residues: sugarcane bagasse, sugarcane straw, wheat straw and corn cob. The extracts obtained were investigated for xylanase, endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase and β-xylosidase activities. Sugarcane straw induced the highest level of xylanase at 9 days (1679.8 UI/g) and β-glicosidase (29.9 UI/g) at 6 days. With corn cob, the fungus produced 46.0 UI/g of exoglucanase and 5.2 UI/g of β-xylosidase at 17 days. The highest endoglucanase production occurred on sugarcane pulp (108.9 UI/g) at 9 days. The initial load of inocullum was evaluated for sugarcane bagasse medium and it was verified that the 10000 times increase of ascospores had influence only in the exoglucanase production, showing a 10 fold increase of its activity. The corn cob extracts were applied in an ion exchange column, DEAE Sepharose CL6B, in order to purify cellulases and hemicellulases presents in the extracts. It could be isolated a xylanase, an endoglucanase and a β-glucosidase of 31.5 kDa, 32.4 kDa and 76.3 kDa, respectively. The enzymatic extracts of T. aurantiacus were tested on sugarcane bagasse in natura and on sugarcane bagasse pulp and 15 % of enzymatic conversion of the cellulose (CEC) was obtained from both substrates. A pretreatment of sugarcane bagasse pulp with (1) proteases isolated from pineapple; (2) xylanase purified of T. aurantiacus and (3) diluted sulfuric acid was performed. The pretreatment with protease did not present any hydrolytic effect on the sugarcane bagasse pulp, however it increased the final CEC with the enzymes of T. aurantiacus from 9.4 % to 20.7 %. The pretreatment with pure xylanase did not release sugars from pulp bagasse, however it was capable to increase the yield of the enzymatic hydrolysis of the pulp to 30.0 %. The pretreatment with diluted acid was capable to remove up to 50 % of the hemicellulose from the pulp, but CEC was maintained on 15 %.

Hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foi hidrolisada por enzimas de Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei e Aspergilus niger para obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOs). A hemicelulose foi extraída com hidróxido de sódio na presença de antraquinona, sulfito de sódio ou peróxido de hidrogênio. O uso de antraquinona ou sulfito aumentou o rendimento de extração, porém a hemicelulose apresentou baixa solubilidade em água, propriedade inadequada para a hidrólise enzimática. A extração da hemicellulose com peróxido de hidrogênio em meio alcalino foi otimizada através de um planejamento fatorial completo 24 variando-se a concentração de H2O2 de 2 a 6% (m/v), tempo de reação de 4 a 16 h, temperatura de 20 a 60°C e presença ou não de 0,5% de sulfato de magnésio. No ponto central o rendimento de extração de hemicelulose foi de 94,5% com remoção de mais que 88% da lignina. Um rendimento de 86% de hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9%) foi obtido em 6% de peróxido de hidrogênio por 4h a 20°C. Nessa condição a hemicelulose apresentou massa molar de 21.000 g/mol, composição aproximada de 81% xilose, 4% de arabinose, 4% de glicose e 3% de ácidos urônicos, alta solubilidade em água (90 % em massa) e coloração amarelo claro. As enzimas usadas na hidrólise dessa hemicelulose foram produzidas pelo cultivo dos fungos em meio sólido contento farelo de trigo. Em todos os extratos foi observada baixa atividade de endoglucanase e β-xilosidase e elevadas atividades de endo-β-1,4-xilanase. A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g), enquanto A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g, em 5 dias de cultivo. O perfil de produção de XOs com enzimas de T. aurantiacus e T. reesei foi semelhante, o principal produto foi xilobiose, seguido por xilose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose, sendo esses XOs de cadeia linear. A hidrólise da hemicelulose com enzimas de A. niger produziu exclusivamente xilose, consequência da presença de elevada atividade de β-xilosidase. A velocidade de conversão da hemicelulose em XOs com as enzimas de T. reesei foi maior no início da reação (6 h), diminuindo a partir de 24 h, período em que inicia a produção de xilose. A influência da concentração de substrato e carga de xilanase na conversão da hemicelulose em XOs foi avaliada através de um planejamento experimental 22 com face centrada. A condição otimizada da hidrólise (2,6% substrato e 60 U/g de endo-β-1,4-xilanase) com o extrato de T. aurantiacus resultou em 42% de conversão em XOs. A otimização da hidrólise da hemicelulose com o extrato de T. reesei resultou em uma conversão máxima de 20%, com ótimo de 3,8 % de substrato e 87,5 U/g de endo-β-1,4-xilanase. A eficiência da hidrólise com enzimas de T. aurantiacus foi maior que a obtida com alguns extratos comerciais testados neste trabalho. Além disso, apresentaram capacidade de degradar hemiceluloses de diferentes fontes: bétula e semente de aveia, com composições variadas. Diferenças na composição de açúcares e teor de lignina não interferiram na ação dessas enzimas. A hidrólise enzimática mostrou-se mais apropriada para a produção de XOs do que a auto-hidrólise, que gerou predominantemente xilose e houve formação de furfural. Apesar do curto tempo de reação, a produção de XOs foi menor e há necessidade de purificação para obtenção de um produto final com características desejáveis. / Hemicellulose extracted from sugarcane bagasse was hydrolyzed by enzymes from Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei and Aspergilus niger to cause the degradation of xylan to xylooligosaccharides (XOs). Hemicellulose was extracted with hydrogen peroxide in the presence of antraquinone, sodium sulphite or hydrogen peroxide. Hemicelluloses extracted with antraquinone or sulphite presented low solubility in water, which is not appropriated to enzymatic hydrolysis. To maximize the hemicellulose yields several extraction conditions were examined applying the 24 factorial design: H2O2 concentration from 2 to 6% (w/v), reaction time from 4 to 16 h, temperature from 20 to 60°C, and magnesium sulfate absence or presence (0.5%, w/v). This approach allowed selection of conditions for the extraction of low and high lignin content hemicellulose. At midpoint the yield of hemicellulose was 94.5% with more than 88% of lignin removed. Hemicellulose in 86% yield with low lignin content (5.9%) was obtained with 6% H2O2 treatment for 4 h and 20°C. This hemicellulose is much lighter in color than samples obtained at the midpoint condition and was found suitable for subsequent enzymatic hydrolysis. The molecular weight of hemicellulose was 21,000 g/mol with composition of aproximately 81% xylose, 4% arabinose, 4% glucose and 3% uronic acids, high water solubility (90 %). Enzymes for hemicellulose hydrolysis were produced by the fungi on wheat bran. Cellulases and hemicellulases were present in all extracts especially the endo-β-1,4-xylanase. The profile of production of XOs obtained on hydrolysis with enzymes from T. aurantiacus and T. reesei was similar, with the main product xylobiose, followed by xylose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose, and these XOs showed linear chain. The hydrolysis of hemicellulose with enzymes of A. niger produced exclusively xylose, a consequence of β-xylosidase content. The rate of conversion of hemicellulose in XOs with enzymes of T. reesei was higher at the beginning of the reaction (6 h), decreasing from 24 h, when starts the production of xylose. The influence of substrate concentration and loading of xylanase in conversion of hemicellulose to XOs was evaluated by an 22 full factorial design with centered face. Optimization of hydrolysis (2.6% substrate and 60 U/g endo-β-1,4-xylanase) with the extract of T. aurantiacus resulted in 42 % conversion XOs. The optimization with the extract of T. reesei resulted in a conversion of hemicellulose up to 20%, with optimal substrate 3.8% and 87.5 U/g endo-β-1,4-xylanase. The efficiency of hydrolysis by enzymes from T. aurantiacus was superior to commercial extracts, and showed ability to degrade hemicelluloses of different compositions (birchwood and oat spelt). The structural differences, such as branches and lignin content did not affect the action of these enzymes. The differences in the efficiency and extent of enzymatic hydrolysis by enzymes of these fungi might have occurred in function of differences in physicochemical properties and specific activity. The enzymatic hydrolysis was more appropriate for production of XOs than autohydrolysis, which generated predominantly xylose and formation of furfural. Despite of short reaction time, the production of XOs was low and purification is needed in order to obtain a final product with desirable characteristics.

Hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foi hidrolisada por enzimas de Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei e Aspergilus niger para obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOs). A hemicelulose foi extraída com hidróxido de sódio na presença de antraquinona, sulfito de sódio ou peróxido de hidrogênio. O uso de antraquinona ou sulfito aumentou o rendimento de extração, porém a hemicelulose apresentou baixa solubilidade em água, propriedade inadequada para a hidrólise enzimática. A extração da hemicellulose com peróxido de hidrogênio em meio alcalino foi otimizada através de um planejamento fatorial completo 24 variando-se a concentração de H2O2 de 2 a 6% (m/v), tempo de reação de 4 a 16 h, temperatura de 20 a 60°C e presença ou não de 0,5% de sulfato de magnésio. No ponto central o rendimento de extração de hemicelulose foi de 94,5% com remoção de mais que 88% da lignina. Um rendimento de 86% de hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9%) foi obtido em 6% de peróxido de hidrogênio por 4h a 20°C. Nessa condição a hemicelulose apresentou massa molar de 21.000 g/mol, composição aproximada de 81% xilose, 4% de arabinose, 4% de glicose e 3% de ácidos urônicos, alta solubilidade em água (90 % em massa) e coloração amarelo claro. As enzimas usadas na hidrólise dessa hemicelulose foram produzidas pelo cultivo dos fungos em meio sólido contento farelo de trigo. Em todos os extratos foi observada baixa atividade de endoglucanase e β-xilosidase e elevadas atividades de endo-β-1,4-xilanase. A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g), enquanto A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g, em 5 dias de cultivo. O perfil de produção de XOs com enzimas de T. aurantiacus e T. reesei foi semelhante, o principal produto foi xilobiose, seguido por xilose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose, sendo esses XOs de cadeia linear. A hidrólise da hemicelulose com enzimas de A. niger produziu exclusivamente xilose, consequência da presença de elevada atividade de β-xilosidase. A velocidade de conversão da hemicelulose em XOs com as enzimas de T. reesei foi maior no início da reação (6 h), diminuindo a partir de 24 h, período em que inicia a produção de xilose. A influência da concentração de substrato e carga de xilanase na conversão da hemicelulose em XOs foi avaliada através de um planejamento experimental 22 com face centrada. A condição otimizada da hidrólise (2,6% substrato e 60 U/g de endo-β-1,4-xilanase) com o extrato de T. aurantiacus resultou em 42% de conversão em XOs. A otimização da hidrólise da hemicelulose com o extrato de T. reesei resultou em uma conversão máxima de 20%, com ótimo de 3,8 % de substrato e 87,5 U/g de endo-β-1,4-xilanase. A eficiência da hidrólise com enzimas de T. aurantiacus foi maior que a obtida com alguns extratos comerciais testados neste trabalho. Além disso, apresentaram capacidade de degradar hemiceluloses de diferentes fontes: bétula e semente de aveia, com composições variadas. Diferenças na composição de açúcares e teor de lignina não interferiram na ação dessas enzimas. A hidrólise enzimática mostrou-se mais apropriada para a produção de XOs do que a auto-hidrólise, que gerou predominantemente xilose e houve formação de furfural. Apesar do curto tempo de reação, a produção de XOs foi menor e há necessidade de purificação para obtenção de um produto final com características desejáveis. / Hemicellulose extracted from sugarcane bagasse was hydrolyzed by enzymes from Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei and Aspergilus niger to cause the degradation of xylan to xylooligosaccharides (XOs). Hemicellulose was extracted with hydrogen peroxide in the presence of antraquinone, sodium sulphite or hydrogen peroxide. Hemicelluloses extracted with antraquinone or sulphite presented low solubility in water, which is not appropriated to enzymatic hydrolysis. To maximize the hemicellulose yields several extraction conditions were examined applying the 24 factorial design: H2O2 concentration from 2 to 6% (w/v), reaction time from 4 to 16 h, temperature from 20 to 60°C, and magnesium sulfate absence or presence (0.5%, w/v). This approach allowed selection of conditions for the extraction of low and high lignin content hemicellulose. At midpoint the yield of hemicellulose was 94.5% with more than 88% of lignin removed. Hemicellulose in 86% yield with low lignin content (5.9%) was obtained with 6% H2O2 treatment for 4 h and 20°C. This hemicellulose is much lighter in color than samples obtained at the midpoint condition and was found suitable for subsequent enzymatic hydrolysis. The molecular weight of hemicellulose was 21,000 g/mol with composition of aproximately 81% xylose, 4% arabinose, 4% glucose and 3% uronic acids, high water solubility (90 %). Enzymes for hemicellulose hydrolysis were produced by the fungi on wheat bran. Cellulases and hemicellulases were present in all extracts especially the endo-β-1,4-xylanase. The profile of production of XOs obtained on hydrolysis with enzymes from T. aurantiacus and T. reesei was similar, with the main product xylobiose, followed by xylose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose, and these XOs showed linear chain. The hydrolysis of hemicellulose with enzymes of A. niger produced exclusively xylose, a consequence of β-xylosidase content. The rate of conversion of hemicellulose in XOs with enzymes of T. reesei was higher at the beginning of the reaction (6 h), decreasing from 24 h, when starts the production of xylose. The influence of substrate concentration and loading of xylanase in conversion of hemicellulose to XOs was evaluated by an 22 full factorial design with centered face. Optimization of hydrolysis (2.6% substrate and 60 U/g endo-β-1,4-xylanase) with the extract of T. aurantiacus resulted in 42 % conversion XOs. The optimization with the extract of T. reesei resulted in a conversion of hemicellulose up to 20%, with optimal substrate 3.8% and 87.5 U/g endo-β-1,4-xylanase. The efficiency of hydrolysis by enzymes from T. aurantiacus was superior to commercial extracts, and showed ability to degrade hemicelluloses of different compositions (birchwood and oat spelt). The structural differences, such as branches and lignin content did not affect the action of these enzymes. The differences in the efficiency and extent of enzymatic hydrolysis by enzymes of these fungi might have occurred in function of differences in physicochemical properties and specific activity. The enzymatic hydrolysis was more appropriate for production of XOs than autohydrolysis, which generated predominantly xylose and formation of furfural. Despite of short reaction time, the production of XOs was low and purification is needed in order to obtain a final product with desirable characteristics.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-05Bitstream added on 2014-06-13T19:19:58Z : No. of bitstreams: 1 tobal_tm_dr_arafcf.pdf: 1024748 bytes, checksum: 9a431e076fe886b2b80c19c23adb8bde (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Este estudo teve como objetivo aplicar β-glicosidases produzidas por microrganismos taxonomicamente distantes do gênero Saccharomyces na produção de aguardente de cana, visando uma maior liberação de compostos flavorizantes, em especial os monoterpenos para a obtenção de aguardentes com atributo sensorial floral mais intenso. Testes preliminares foram realizados adicionando-se extrato bruto de β-glicosidases do Aureobasidium pullulans ER-16 e do Thermoascus aurantiacus CBMAI-756 no caldo de quatro variedades de cana-de-açúcar, com pH 4.5 e diferentes condições de temperatura, agitação e tempo de hidrólise. O complexo enzimático produzido pelo microrganismo T. aurantiacus foi adicionado anteriormente à inoculação do caldo de cana com a Saccharomyces cerevisiae, e a fermentação padrão com S. cerevisiae foi adotada como referência. A determinação dos efeitos das β-glicosidases na desglicosilação de terpenos foi avaliada utilizando um cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas (GC-MS), com injeção da fase vapor do mosto e dos produtos de destilação no modo head-space com micro extração em fase sólida (HS-SPME), além da aplicação de testes de análise sensorial. Nenhum composto terpênico foi encontrado nos caldos originais, entretanto citronelol, nerol e geraniol foram encontrados nos caldos de cana tratados com β-glicosidases, na faixa de microgramas por litro, exceto para variedade IAC87-3396. Temperatura, tempo de hidrólise e agitação não afetou os valores encontrados, entretanto uma maior eficiência da atividade hidrolítica de β-glicosidases do T. aurantiacus foi encontrada. Não foi observada a presença de linalol e nerol na cahaça controle até o limite de detecção de 5 μg/L, entretanto a presença de linalol e nerol foi confirmada na cachaça tratada... / This research aims to apply β-glucosidase produced by microorganisms taxonomically distant from the genus Saccharomyces to produce Brazilian sugar cane spirit, seeking a greater release of flavor compounds, especially monoterpenes to brandies with obtaining sensory attribute floral more intense. The enzymatic complexe by Aureobasidium pullulans ER-16 and Thermoascus aurantiacus CBMAI-756 were added to the juices from four sugar cane varieties, with pH 4.5 and under different conditions of temperature, agitation and hydrolysis time. The enzyme complexe produced by microorganism Thermoascus aurantiacus, was added before the inoculation of sugarcane juice with Saccharomyces cerevisiae and the fermentation pattern of S. cerevisiae was used as a reference. The determination of the effects of the addition of β-glucosidases in the deglycosylation of terpenes was evaluated by gas chromatography with mass spectrometry (GC-MS), with injection of the vapor of the distillates in order to head-space micro-phase extraction solid (HS-SPME), and sensory evaluation. No terpenic compounds were found in the original juices, but citronellol, nerol and geraniol were found in the treated sugar cane juices in the range of micrograms per liter, except for variety IAC87-3396. Temperature, hydrolysis time and agitation did not show to be significant parameters in this process, however a greater efficiency of the hydrolytic activity of β-glucosidases from the T. aurantiacus was found. Linallol and nerol weren`t detected in the control cachaça at LOD of 5 μg/L, whereas in the enzymatic treated cachaça, the presence of linallol and nerol was confirmed. The concentrations of terpienol and geraniol were significantly increased in treated sugar cane juice spirit, which received higher scores in the sensory evaluation.

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