Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el interés de aportar mayor información respecto de la toxocarosis humana, se realizó la infección experimental de ratones hembras BALB/c, de dos meses de edad con 1.000 huevos larvados de Toxocara canis provenientes de 3 zonas diferentes del país (norte, centro y sur). Para ello se utilizaron 36 ratones por cada zona, los cuales fueron infectados intraesofágicamente. Un tercio de estos se fueron eutanasiando a los 7, 14 y 30 días post infección. De cada ratón se obtuvo muestras de suero antes de la infección experimental, y luego semanalmente. De cada animal fueron extraídos separadamente el cerebro con los ojos, el hígado más el bazo, los pulmones, los riñones, el corazón, la musculatura de la cabeza y la carcasa (resto del tejido muscular). Los órganos se pesaron y se digirieron con pepsina. Posteriormente se realizó el recuento microscópico de larvas en cada uno de ellos. Este resultado fue expresado como larvas por gramo de tejido. El mayor número de larvas fue recuperado de órganos de ratones infectados con larvas provenientes de la zona central del país y mayoritariamente de cerebro, carcasa y cabeza. A su vez la menor cantidad de larvas se obtuvo de ratones infectados con larvas provenientes de la zona sur del país, lo cual podría estar indicando la existencia de cepas con diferentes grados de patogenicidad. Sin embargo estadísticamente esta diferencia por zona sólo fue significativa en carcasa y cerebro entre las zonas centro y sur; y en riñón entre la zona centro con respecto a la sur y norte (p<0,05). En relación al tiempo de infección el único órgano en que se pudo observar una cinética de distribución fue en cerebro, ya que se encontró más larvas/gramo a los 30 días versus los 7 días post infección (p<0,05). Desde el punto de vista inmune humoral se identificó a 2 polipéptidos, ambos sólo Inmunoglobulina G reactivos, uno de ellos de alrededor de 14 kDa que fue reconocido específicamente por todos los sueros de los animales infectados y otro de alrededor de 35kDa, que fue reconocido en forma inespecífica. A la vista de los resultados obtenidos fue posible concluir la existencia de cierta predilección de las larvas de todas las zonas del país por el cerebro, además de un mayor grado de migración del aislado de la zona centro versus el aislado de la zona sur / Financiamiento: proyecto DID TNAC 24-02/01

Doctor en ciencias con mención en Microbiología / Doctor en Ciencias con mención en Microbiología / El género Vibrio incluye un alto número de especies indígenas de agua de mar, algunas de las cuales pueden causar importantes enfermedades en humanos aún en ausencia de contaminación antropogénica (V. cholerae, V. vulnificus y V. parahemolyticus). Aunque la infección por estos vibrios se ha observado en Chile con baja frecuencia, el surgimiento de brotes es una amenaza constante a la salud humana y a la producción y explotación acuícola. En esta tesis se estudió el polimorfismo intra-cromosómico de los genes repetidos del rRNA 16S de bacterias del género Vibrio, y se exploró la presencia de genes relacionados con patogenicidad en aislados ambientales de estas bacterias. En este proyecto el análisis de los rDNAs 16S obtenidos de una sola colonia de cepas tipo o cepas ambientales del género Vibrio reveló la presencia de polimorfismo en cada una de las cepas analizadas. El polimorfismo se detectó por la visualización de heterodupletes que se generan después de la amplificación por PCR del rDNA 16S, un procedimiento que permite examinar un gran número de aislados. El amplificado del rDNA 16S obtenido tanto de V. parahaemolyticus como de una cepa ambiental fueron clonados. Las secuencias nucleotídicas revelaron diferencias de hasta un 2% entre genes repetidos del rDNA 16S de una misma cepa. Los sitios polimorfos se encontraron concentrados en una región del gen rRNA 16S bacteriano que forma un lazo y una horquilla. En algunas cepas esta región concentraba hasta un 83% del total de sitios polimorfos. La acumulación de muchos cambios compensatorios en la región de lazo y horquilla implican que la divergencia de las diferentes versiones de este lazo y horquilla es relativamente muy antigua. Esta divergencia podría ser el resultado de un proceso de selección o transferencia lateral de genes o regiones de genes que evolucionaron independientemente en otras bacterias. El polimorfismo también se observó en el rRNA después de ser amplificado por RTPCR, indicando que algunos de los genes diferentes eran expresados. La exploración por genes relacionados con la patogenicidad de diferentes especies de Vibrio en aislados ambientales mostró sólo un gen relacionado con un aislado. Se exploró la presencia de tdh, trh y gyrB relacionados con la patogenicidad en V. parahaemolyticus; vvhA relacionado a V. vulnificus; y ctxA, tcpA y el espaciador de los genes rRNA 16 y 23S relacionados con V. cholerae. Este aislado, llamado C1, contiene el gen gyrB, relacionado al V. parahaemolyticus. La caracterización detallada mostró corresponder a un V. parahaemolyticus, pero con algunas características de V. alginolyticus. Este aislado no contiene todo el conjunto de genes considerados necesarios en una especie realmente patógena. Sin embargo, este aislado alberga un fago de amplio espectro de huésped que puede infectar tanto V. alginolyticus como V. parahaemolyticus. Aunque es posible aislar bacterias con genes asociados a vibrios patógenos en las aguas costeras chilenas, éstas no parecen ser cepas realmente virulentas. / The genus Vibrio includes a number of bacterial species that in spite of being indigenous of the sea (V. parahaemolyticus and V. vulnificus) with the exception of V. cholerae, which is terrestrial, may infect humans with serious consequences. In this work we explore the commonness polymorphism and the extent of sequence dissimilarity among repeated 16S rRNA genes, in type strains of genus Vibrio and environmental isolates. Analysis of the 16S rDNAs obtained from cultures of single colonies of either type collection strains or environmental strains of the genus Vibrio revealed the presence of polymorphism in almost every one of the strains examined. Polymorphism was detected by visualization of heteroduplexes produced after 16S rDNA PCR amplification, a procedure that allows for the screening of a large number of isolates. Amplified 16S rDNAs obtained from both V. parahaemolyticus and an environmental strain were cloned. Their nucleotide sequences revealed differences of up to 2% among 16S rDNAs from the same strain. Polymorphic sites were concentrated in a recognized variable stem loop of bacterial 16S rRNA that contained in some cases up to 83% of the total mismatches observed. Most of the substitutions present in the stem loop region showed compensating base covariation. The accumulation of so many compensating changes in the stem loop region implies that the divergence of the different versions of this stem loop is relatively ancient. This divergence could be the result of either a selection process or a lateral transference of independently evolved genes. Polymorphism was also observable in the rRNA when this was amplified by RT-PCR, indicating the expression of at least some of the different genes. In this work we also explored the presence of putative pathogenic vibrio strains, carrying amplicons related to pathogenic species of this genus, isolated in coastal waters of the Southern Pacific Ocean (Chile). A search for bacteria of this genus containing genes related with virulence was conducted and isolates of the genus Vibrio were grouped according to the size pattern of their 16-23S rDNA spacer regions. One isolate from each of 20 different groups was then tested by PCR amplification for the presence of the following genes, related with pathogenicity: tdh , trh, and the girB related to pathogenic V. parahaemolyticus; vvhA related to V. vulnificus; and ctxA, tcpA and the 16-23S rDNA spacer region related to V. cholerae. Only a single Vibrio isolate carrying a pathogenicity associated gene was detected. Further characterization of this isolate suggested, however, that it lacked additional properties to be virulent. The results indicated that this strain belong to the species V. parahaemolyticus but contains many properties more closely related to V. alginolyticus. This strain can host a phage present in the Chilean coastal waters.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp. es una bacteria Gram-negativa y agente etiológico de la salmonelosis, enfermedad transmitida por los alimentos (ETA). Es el principal agente bacteriano causante de enfermedad gastrointestinal en nuestro país. El objetivo de este estudio fue verificar el método analítico VIDAS® Easy Salmonella, para la detección de Salmonella spp. en diferentes matrices de alimentos, dentro del Laboratorio de Salud Pública Ambiental y Laboral de la SEREMI de Salud Región Metropolitana. Se analizaron 60 muestras correspondientes a cinco matrices de alimentos. Para cada matriz se analizaron 12 muestras, diez de las cuales fueron contaminadas artificialmente con una cepa de Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC® 14028 y dos fueron analizadas sin contaminar (control). Siguiendo el protocolo descrito por el fabricante, las muestras fueron pre-enriquecidas, enriquecidas y sometidas a detección inmunoenzimática presuntiva mediante el kit VIDAS® Easy Salmonella. Las muestras positivas y negativas, fueron sembradas en agar selectivo XLD y confirmadas a través del kit API 20E®. El criterio de aceptación de la verificación del método alternativo en cada matriz, fue la detección positiva del 100 % de las muestras contaminadas artificialmente. Para determinar la concordancia existente entre el método alternativo y la siembra en agar XLD, se utilizó el coeficiente estadístico Kappa (κ). Los datos obtenidos en todas las muestras (hortalizas (10/10), cecinas (10/10), mariscos (10/10), carne de ave (10/10) y mayonesas envasadas (10/10)), arrojaron un 100% de concordancia (κ = 1) entre el método alternativo y la siembra en agar XLD. Los resultados sugieren que el método alternativo VIDAS® Easy Salmonella, puede ser utilizado como método de screening en las matrices analizadas, dentro del Laboratorio de Salud Pública Ambiental y Laboral de la Secretaría Regional Ministerial de Salud Región Metropolitana

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas se encuentra presente en el continente americano desde hace más de 9.000 años. En Chile la zona endémica se extiende desde la Región de Arica y Parinacota hasta la Región de O’Higgins. Cualquier mamífero es susceptible a la infección, siendo los perros uno de los principales reservorios domésticos de la enfermedad. El objetivo de este estudio fue caracterizar la tasa de infección por Trypanosoma cruzi en caninos domésticos de 8 localidades rurales de la Región de Coquimbo. Para ello se obtuvieron 380 muestras sanguíneas de perros durante los primeros meses del año 2015, a las cuales se les realizó la extracción del ADN mediante un kit comercial y analizadas mediante ensayos de PCR tiempo real. Se detectaron 162 muestras positivas a T. cruzi, representando una tasa de infección del 42,6%. Peralillo y Gualliguaica demostraron presentar una mayor cantidad de perros infectados en comparación con las demás localidades. No se encontraron diferencias significativas según edad, sexo, condición corporal ni cantidad de caninos presentes en las viviendas con el estatus de infección en los perros. Es evidente que el ciclo de transmisión peridoméstico persiste, representando un riesgo de infección hacia los pobladores. / The Chagas disease has been present in the Americas for more than 9,000 years. In Chile, the endemic zone extends from Arica and Parinacota Region to O'Higgins Region. Any mammal is susceptible to infection, and dogs are one of the main domestic reservoirs of this disease. The objective of this study was to characterize the rate of infection by Trypanosoma cruzi in domestic canines from 8 rural localities in the Coquimbo Region. For this purpose, 380 blood samples of dogs were obtained during the first months of 2015, and the DNA were extracted with a commercial kit and analyzed by real-time PCR assays. A total of 162 T. cruzi positive samples were detected, representing an infection rate of 42.6%. Peralillo and Gualliguaica showed a higher number of infected dogs compared to the other localities. No significant differences were found between age, sex, body condition or number of canines present in the houses with the infection status in dogs. It is evident that the peridomestic transmission cycle persists, representing a risk of infection to these habitants. / Fondecyt Nro. 1140650

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es un protozoo hemoflagelado llamado Trypanosoma cruzi, el cual es transmitido principalmente por vectores conocidos como vinchucas. En Chile, el ciclo de transmisión silvestre está mediado por vinchucas del género Mepraia, las cuales se encuentran parasitadas en distintas proporciones desde la región de Arica y Parinacota hasta la región del Libertador Bernardo O’Higgins. Para este trabajo, se recolectaron 176 ejemplares Mepraia spinolai en la Reserva Nacional Las Chinchillas durante mayo del 2015. Adultos y ninfas de distintos estadios se alimentaron cinco veces con ratones (Mus musculus) libres de infección por T. cruzi y se sometieron a dos períodos variables de ayuno entre las alimentaciones. Se detectó T. cruzi con DNA extraído de las heces de cada insecto mediante PCR, se genotipificó T. cruzi mediante sondas de DNA pertenecientes a los cuatro linajes más frecuentemente encontrados en Chile y se evaluó la sobrevivencia de ninfas y adultos durante el período del experimento. El porcentaje de infección por T. cruzi en M. spinolai silvestre fue de 29,27%. Los valores más elevados se encontraron en ninfas III (61%), lo cual permitió diferenciar infecciones únicas y mixtas con los linajes TcI, TcII y TcV. Además, ninfas III presentaron mayor resistencia a los periodos de ayuno. La sobrevivencia de ninfas no parece verse afectada cuando se encuentran infectadas con T. cruzi. Los resultados obtenidos en los distintos grupos de insectos se discutieron respecto de la patogenicidad de T. cruzi en M. spinolai naturalmente infectados. / The etiological agent of Chagas disease is a hemoflagellate protozoon called Trypanosoma cruzi, which is transmitted mainly by known vectors such as kissing bugs. In Chile, the cycle of wild transmission is mediated by kissing bug of Mepraia genus, which are parasitized in different proportions from Arica and Parinacota region to Libertador Bernardo O’Higgins region. For this work, 176 bugs M. spinolai were collected in Las Chinchillas National Reserve during May 2015. Adults and different nymphs stages were fed five times with T. cruzi free infection mice (Mus musculus) and underwent two variable periods of fasting between feeds. Trypanosoma cruzi was detected by PCR extracting DNA from fecal samples of each insect, T. cruzi was genotyped by DNA probes belonging to the four lineages most frequently found in Chile and survival of nymphs and adults during the period of the experiment was evaluated. Percentage of T. cruzi infection in wild M. spinolai was 29.27%. The highest values were found in the III nymphs (61%), which allowed to differentiate unique and mixed infections with the TcI, TcII and TcV lineages. In addition, nymphs III presented greater resistance to periods of fasting. Survival of nymphs does not seem to be affected when they are infected with T. cruzi. Results with the different groups of insects were discussed regarding the pathogenicity of T. cruzi in M. spinolai naturally infected. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1120122

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se analizó la evolución de la infección con Trypanosoma cruzi en ratones ACA experimentalmente infectados con 2.000 tripomastigotes sanguíneos de las cepas Tulahuén, Munantá y San Antonio del parásito, evaluando la prepatencia, parasitemia y mortalidad acumulada, y su correlación con el número de pseudoquistes y la magnitud del daño inflamatorio en el tejido cardiaco de los individuos infectados. Los ratones infectados con la cepa Tulahuén mostraron una prepatencia sanguínea de 5 días, un máximo de 14,8 x 105 ± 2,21 x 105 parásitos/mL al día 11 post infección (p.i.) y una mortalidad acumulada del 100% al día 21 post infección. Los animales infectados con Munantá mostraron, en cambio, una prepatencia sanguínea de 7 días, un máximo de 40,06 x 105 ± 1,86 x 105 parásitos/mL al día 17 p.i. y una supervivencia cercana al 80% más allá de 6 meses p.i. Mientras que los infectados con San Antonio presentaron una prepatencia sanguínea de 7 días, un máximo de 1,73 x 105 ± 1,86x104 parásitos/mL al día 11 p.i. y una mortalidad acumulada del 100% al día 20 p.i. Los resultados sugieren la existencia de una correlación entre el parasitismo intracelular, magnitud del infiltrado inflamatorio mononuclear, severidad del daño en el tejido cardiaco, y mortalidad acumulada hasta la tercera semana p.i. en los ratones infectados con Tulahuén y San Antonio, situación que no ocurre en los ratones infectados con Munantá, a pesar de su significativamente elevada parasitemia (p<0,001). Estos resultados reafirman la sugerencia que no existe una relación directa entre la parasitemia, la virulencia de la cepa o aislado del parásito y la susceptibilidad a la infección / Proyecto DPA14LIHBAC1314003

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / Staphylococcus spp. son bacterias que forman parte de la microbiota de seres humanos, principalmente en la nariz, y también son reconocidos patógenos resistentes a múltiples antimicrobianos que producen diversas enfermedades. Se transmite entre humanos y mascotas, por lo que el personal médico y técnico veterinario pueden actuar como reservorios y diseminadores de cepas de Staphylococcus spp. multirresistentes, sin embargo su impacto para la salud pública aún no se ha esclarecido del todo. Por lo anterior, este estudio pretende establecer la presencia de cepas de Staphylococcus spp. meticilino resistentes en la nariz del personal médico y técnico asociado a la atención en clínicas de pequeños animales de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Las muestras nasales fueron obtenidas mediante torulado de una fosa nasal, realizando cultivo tradicional en medio selectivo y definiendo las especies aisladas desde la nariz mediante PCR para el gen nuc para las especies S. aureus y S. pseudintermedius. A las cepas aisladas se les hizo antibiograma por Kirby-Bauer de acuerdo al CLSI (2015), incluyendo los siguientes antimicrobianos: amoxicilina (10μg), amoxicilina/ácido clavulánico (30μg), cefoxitin (30μg), cefadroxilo (30μg), ciprofloxacino (5μg), clindamicina (2μg), doxiciclina (30μg), eritromicina (15μg), gentamicina (10μg), mupirocina (30μg). Finalmente, a todas las cepas meticilino resistentes (cefoxitin) se les determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CIM) por un método estándar (CLSI 2015) y la presencia del gen mecA mediante PCR. La portación nasal de Staphylococcus spp. en las 67 personas en estudio fue de 100% y del 51% para Staphylococcus spp. meticilino resistente. Del total de cepas (236) aisladas, 10 correspondieron a Staphylococcus aureus, todas ellas fueron meticilino resistente. El análisis de los antibiogramas del total de cepas de Stpahylococcus spp. permitió la identificación de 56 perfiles de resistencia, donde todas las cepas meticilino resistentes fueron multiresistentes. Los mayores porcentajes de resistencias se presentaron frente a la amoxicilina, clindamicina y eritromicina (28,1%, 19,4% y 16,7% respectivamente). La CIM para la oxacilina varió entre 0,5 y 16 μg/mL en las 56 10 cepas resistentes, logrando identificar la presencia del gen mecA en 47 de las 56 (83,9%) cepas de Staphylococcus spp. meticilino resistentes. Se discuten diferencias de prevalencia según origen de las muestras. Los resultados de este estudio permiten concluir que el personal de la RAV analizado es portador nasal de Staphylococcus spp. meticilino resistentes portadores del gen mecA, situación que, indudablemente, constituye un problema de salud pública que debiera ser abordado de acuerdo a lo recomendado por la OMS, la OIE y FDA / Staphylococcus spp. they are bacteria that are part of the microbiota of humans, mainly in the nose, and are also recognized pathogens resistant to multiple antimicrobials that produce various diseases. It is transmitted between humans and pets, so that medical personnel and veterinary technicians can act as reservoirs and disseminators of strains of Staphylococcus spp. multiresistant, however its impact on public health has not yet been fully clarified. Therefore, this study aims to establish the presence of strains of Staphylococcus spp. resistant methicillin in the nose of medical and technical personnel associated with the care of small animal clinics of the Faculty of Veterinary and Animal Sciences of the University of Chile. The nasal samples were obtained by torulation of a nostril, performing traditional culture in a selective medium and defining the species isolated from the nose by PCR for the nuc gene for S. aureus and S. pseudintermedius species. Isolated strains were tested by Kirby-Bauer according to CLSI (2015), including the following antimicrobials: amoxicillin (10μg), amoxicillin / clavulanic acid (30μg), cefoxitin (30μg), cefadroxil (30μg), ciprofloxacin (5μg), clindamycin (2μg), doxycycline (30μg), erythromycin (15μg), gentamicin (10μg), mupirocin (30μg). Finally, all the methicillin-resistant strains (cefoxitin) were determined the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by a standard method (CLSI 2015) and the presence of the mecA gene by PCR. The nasal portability of Staphylococcus spp. in the 67 people in the study it was 100% and 51% for Staphylococcus spp. methicillin resistant. Of the total strains (236) isolated, 10 corresponded to Staphylococcus aureus, all of them were methicillin resistant. The analysis of the antibiograms of the total strains of Stpahylococcus spp. allowed the identification of 56 resistance profiles, where all the methicillin-resistant strains were multiresistant. The highest percentages of resistance were presented against amoxicillin, clindamycin and erythromycin (28.1%, 19.4% and 16.7% respectively). The MIC for oxacillin varied between 0.5 and 16 μg / mL in the 56 resistant strains, achieving the presence of the mecA gene in 47 of the 56 (83.9%) strains of Staphylococcus spp. methicillin resistant. Differences in prevalence according to the origin of the samples are discussed. The results of 12 this study allow us to conclude that the personnel of the analyzed RAV is a nasal carrier of Staphylococcus spp. methicillin resistant carriers of the mecA gene, a situation that undoubtedly constitutes a public health problem that should be addressed according to the recommendations of WHO, OIE and FDA

Estudios realizados en Atalantia citroides, un género afín de los cítricos, mostraron que estaba infectada con un viroide no descrito hasta el momento. Este nuevo viroide tiene un genoma de 293-294 nucleótidos con una alta proporción de bases GC, una región central conservada que es característica de los miembros del género Apscaviroid, y también la región terminal conservada que tienen este y otros géneros de la familia Pospiviroidae. La estructura secundaria de mínima energía libre predicha para este nuevo viroide es una conformación en forma de varilla con un 68.7% de nucleótidos apareados y con una identidad de secuencia respecto a los otros viroides inferior al 90%, que es el límite convenido para separar las diferentes especies de viroides dentro de un mismo género. Los ensayos de infectividad utilizando el cidro Etrog han mostrado que este nuevo viroide produce síntomas característicos suaves. La co-inoculació de este nuevo viroide con Citrus bent leaf viroid o con Citrus dwarfing viroid, que también son miembros del género Apscaviroid, causa interacciones sinérgicas que se manifiestan induciendo síntomas muy pronunciados en las hojas y un enanismo muy marcado. Este aumento en la intensidad de síntomas no está acompañado por variaciones en la acumulación del viroide en la planta ya que su concentración se mantiene inalterada en plantas co-inoculadas. De acuerdo con estas propiedades moleculares y biológicas, así como por su capacidad por replicarse en A. citroides, este nuevo viroide que tentativamente hemos nombrado Citrus viroid V (CVd-V), ha sido propuesto como una nueva especie del género Apscaviroid. El análisis de 64 muestras provenientes de varias zonas citrícolas ha mostrado que CVd-V está presente en los Estados Unidos, España Nepal, y el Sultanato de Oman. Estos resultados indican que este viroide no ha surgido recientemente y está bastante difundido por diferentes partes del mundo. Los ensayos de transmisión a naranjo, mandarino, híb / Serra Alfonso, P. (2009). Estudios de Patogenicidad de Viroides del Género Apscaviroide y Hostuviroide en cítricos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6028

Citrus tristeza virus (CTV) is a viral species of the Closterovirus genus, having a ¿20 kb single-stranded and positive sense genomic RNA (gRNA) organized into 12 open reading frames (ORFs) potentially coding 17 protein products, some of which of unknown function. CTV proteins p25 and p27 belong to a gene block involved in virion assembly. It has been demonstrated that p25, along with p20 and p23, are RNA silencing suppressors in some species of Nicotiana, being the latter a pathogenesis determinant. CTV host range is very restricted and in nature viral infections are limited to the phloem cells of some citrus species. Consequently, working with this virus-host pathosystem requires an appropriate experimental host and an efficient CTV genetic system. In our laboratory we have developed a new CTV genetic system based on the agroinfection of Nicotiana benthamiana plants, a non-natural host, with infectious clones of the T36 isolate. That infection induces characteristic symptoms, some of which correlate with those caused by the virus in citrus plants. CTV-N. benthamiana interactions are very variable and genotype-dependent, so only some isolates can replicate in this species and T36 is unique causing systemic infections. In this work, we studied the function of CTV p20 and p25 proteins from three different isolates differing in its pathogenic characteristics. Transient expression of p20 and p25 fused to fluorescent proteins showed an identical subcellular localization for both N. benthamiana and citrus. The p20 protein of T36, T318A and T385 isolates localized in cytoplasm and nucleus forming amorphous aggregates associated with perinuclear regions, together with nuclear punctuate inclusions. On the other hand, subcellular localization of p25 differed depending on the CTV isolate. While p25 of T36 and T385 localized in the nucleus, that of T318A did it in cytoplasm. A detailed analysis of the protein regions involved in this subcellular localization unveiled a leucine-rich nuclear export signal (NES) in the N-terminus (Nt) of the protein. The pathogenic ability of CTV p20 and p25 in N. benthamiana was tested through a PVX heterologous viral infection, showing that p25 was not a pathogenicity determinant in this species, albeit p20 it was. Besides, the interactome of p25-T36 was more complex and diverse than that of p25-T318A, involving a greater number of metabolic processes, redox activities, homeostasis and cellular transport, biosynthesis and protein degradation, plastid and nucleic acid protein binding, biotic and oxidative stress, jasmonic-mediated defense, methylation, ROS signalling and HSP proteins. On the other hand, most p25-T318A potential interactors were related to transport/localization and stress response, like apoptosis, pathogenesis-related and HSP proteins, Ca+2-binding proteins and redoxins. Moreover, the experimental evolution of CTV in N. bethamiana was achieved through serial passages. The evolution process showed adaptative traits as the increase of graft survival, infectivity rates and viral titers, and a decreased time for the onset of symptom development in this species. Adaptive characteristics of evolved viral populations in N. bethamiana, were also correlated to their genetic variability and population structure. Two different evolved lineages showed convergent evolution processes reflected also at the molecular level. CTV viruses evolved in N. benthamiana were found to be less infectious at initial stages of infection when they were back-inoculated to citrus plants, and showed a decreased viral titer during the first year post-inoculation. This re-adaptation of N. benthamiana viral populations back to citrus was correlated, at a molecular level, with the progressive loss of the mutations appeared during its evolution process in N. benthamiana. / El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es un closterovirus con un RNA genómico (gRNA) de ssRNA (+) y ¿20 Kb organizado en 12 pautas de lectura abierta (ORFs) que codifican al menos 17 proteínas, algunas de función desconocida. Las proteínas p25 y p27 forman parte de un grupo de genes implicados en el ensamblaje del virión, y se ha demostrado que p25 junto con p20 y p23 son supresores de silenciamiento génico en algunas especies de Nicotiana, y la última es también un determinante de patogénesis. CTV tiene una gama de huéspedes muy restringida y de forma natural sólo infecta el floema de algunas especies de cítricos. Por ello, para trabajar con este patosistema virus-huésped, se requiere un huésped experimental adecuado y un sistema genético eficiente de CTV. Durante los últimos años hemos desarrollado un sistema genético de CTV basado en la agroinfección sistémica de Nicotiana benthamiana, una especie no-natural de este virus, con clones infecciosos del genotipo T36. Dicha infección va acompañada de síntomas característicos, algunos de los cuales son similares a los que el virus induce en cítricos. La interacción CTV-N. benthamiana es muy variable y genotipo-dependiente, sólo algunos aislados se replican en esta especie y únicamente T36 la infecta sistémicamente. En este trabajo, abordamos la función de las proteínas p20 y p25 de tres aislados de CTV que difieren en sus características patogénicas. La expresión transitoria de las p20 y p25 fusionadas a proteínas fluorescentes reveló su idéntica localización subcelular en N. benthamiana y cítricos. La proteína p20 se localizó en el citosol y el núcleo celular en agregados amorfos asociados a regiones perinucleares e inclusiones nucleares puntuales. En cambio, la expresión de la p25 de T36, T318A y T385 de CTV reveló una localización diferencial. Mientras la de T36 y T385 fue nuclear, la de T318A fue citosólica. Un análisis detallado de las regiones implicadas en dicha localización, reveló la existencia de una señal de exportación nuclear NES rica en leucinas en la región Nt de la proteína. Un análisis de la capacidad patogénica de p20 y p25 en N. benthamiana en un contexto de infección viral heterólogo a través de PVX, mostró que p25 no es un determinante de patogenicidad en esta especie, pero p20 sí. Por otra parte, el interactoma de la p25-T36 resultó mucho más complejo y diverso que el de la p25-T318A, interviniendo potencialmente en mayor número de procesos metabólicos de fotosíntesis, actividad redox, homeóstasis y transporte celular, biosíntesis y degradación de proteínas, unión a proteínas de los plastidios y ácidos nucleicos o de respuesta a estrés (biótico y oxidativo) o defensa mediada por la ruta del jasmónico, del ciclo de metilación, señalización por ROS y proteínas HSP. Las interacciones mayoritarias de la p25-T318A se relacionaron con transporte/localización y respuesta a estrés, principalmente con interactores implicados en procesos de apoptosis, patogénenis y proteínas HSP, de unión a calcio o redoxinas. También hemos conseguido la evolución experimental de CTV por pases seriados en N. benthamiana. Dicha evolución conlleva un conjunto de características adaptativas significativas como: el aumento del prendimiento de injertos, de la tasa neta de infectividad, del título viral y del adelanto de los síntomas causados en esta especie herbácea con el aumento de los pases. Las características adaptativas también se reflejaron a nivel molecular en la variabilidad genética y estructura de las poblaciones de los virus evolucionados en dos linajes independientes. Virus evolucionados en N. benthamiana resultaron menos infecciosos inicialmente por inoculación mecánica de regreso a cítricos, y se acumularon menos que el virus parental durante el primer año. Dicha re-adaptación de los virus evolucionados se reflejó a nivel molecular en la pérdida progresiva de las m / El virus de la tristesa dels cítrics (CTV) és un closterovirus amb un RNA genòmic de ssRNA(+) i 20 Kb organitzat en 12 pautes de lectura oberta (ORFs) que codifiquen, al menys, 17 proteïnes, algunes de les quals de funció desconeguda. Les proteïnes p25 i p27 formen part d'un grup de gens implicat en l'assemblatge del virió, i s'ha demostrat que p25, junt a p20 i p23, són supressors de silenciament gènic en algunes espècies de Nicotiana, i la última també és un determinant de patogènesi. La gama d'hostes de CTV és molt restringida i de forma natural sols infecta el floema d'algunes espècies de cítrics. Per això, per a treballar amb aquest patosistema virus-hoste, es requereix un hoste experimental adequat i un sistema genètic eficient de CTV. Durant els últims anys hem desenvolupat un sistema genètic de CTV basat en l'agroinfecció sistèmica de Nicotiana benthamiana, una espècie no-natural d'aquest virus, amb clons infecciosos del genotip T36. Aquesta infecció va acompanyada de símptomes característics, alguns dels quals són similars als que el virus indueix en cítrics. La interacció CTV-N. benthamiana és molt variable i genotip depenent, ja que sols alguns aïllats es repliquen en aquesta espècie i únicament T36 la infecta sistèmicament. En aquest treball hem abordat la funció de les proteïnes p20 i p25 de tres aïllats de CTV que difereixen en les seues característiques patogèniques. L'expressió transitòria de les p20 i p25 fusionades a proteïnes fluorescents va revelar la seua idèntica localització subcel·lular en N. benthamiana i cítrics. La proteïna p20 dels aïllats T36, T318A i T385 es va localitzar al citosol i al nucli cel·lular formant agregats amorfs associats a regions perinuclears, i inclusions nuclears puntuals. En canvi, l'expressió de la p25 de T36, T318A i T385 de CTV va revelar una localització diferencial. Mentre la de T36 i T385 fou nuclear, la de T318A fou citosòlica. Una anàlisi detallada de les regions implicades en eixa localització va revelar l'existència d'una senyal d'exportació nuclear (NES) rica en leucines a la regió Nt de la proteïna. L'anàlisi de la capacitat patogènica de p20 i p25 en N. benthamiana en un context d'infecció viral heteròloga a través de PVX, va mostrar que p25 no és un determinant de patogenicitat en aquesta espècie, però p20 sí. D'altra banda, l'interactoma de p25-T36 va resultar molt més complex i divers que el de p25-T318A, intervenint potencialment en un major nombre de processos metabòlics de fotosíntesi, activitat redox, homeòstasi i transport cel·lular, biosíntesi i degradació de proteïnes, unió a proteïnes dels plastidis i àcids nucleics o de resposta a estrés (biòtic i oxidatiu) o defensa mediada per la ruta del jasmònic, del cicle de metilació, senyalització per ROS i proteïnes HSP. Les interaccions majoritàries de la p25-T318A es relacionaren amb transport/localització i resposta a estrés, principalment amb interactors implicats en processos d'apoptosi, patogènesi i proteïnes HSP, d'unió a calci o redoxines. També hem aconseguit l'evolució experimental de CTV per passes seriats en N. benthamiana. Aquesta evolució comporta un conjunt de característiques adaptatives significatives com: l'augment de la supervivència dels empelts, de la taxa neta d'infectivitat, de la càrrega viral i de l'ajornament dels símptomes causats en aquesta espècie herbàcia amb l'augment dels passes. Les característiques adaptatives també es reflectiren a nivell molecular amb la variabilitat genètica i estructura de les poblacions dels virus evolucionats en dos llinatges independents. Virus evolucionats a N. benthamiana resultaren menys infecciosos inicialment per inoculació mecànica de tornada a cítrics, i s'acumularen menys que el virus parental durant el primer any. Aquesta re-adaptació dels virus evolucionats a N. benthamiana de tornada a cítrics es va reflectir a nivell molecular amb / Navarro López, JA. (2017). Estudio preliminar de las interacciones del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) y su huésped [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90468

Tesis por compendio / [ES] Se desarrolló un ensayo qPCR para la detección y cuantificación de inóculo aéreo de D. amygdali, incluyendo el diseño de un par de cebadores específicos para esta especie. Esta metodología se utilizó para estudiar la dinámica del inóculo de D. amygdali en trampas de esporas colocadas en dos huertos de almendros de diferentes ubicaciones, en dos temporadas de crecimiento. Con los datos climáticos registrados se construyó un modelo Hurdle de dos partes; la primera parte relacionó la presencia o ausencia de ADN de D. amygdali (Bernoulli o cualitativa) y la otra consideró la concentración promedio de ADN del hongo (Gamma o cuantitativa). El efecto de la temperatura estuvo relacionado con la amplitud térmica diaria; los rangos térmicos más amplios redujeron la concentración de ADN, mientras que los rangos térmicos más estrechos aumentaron la detección de ADN. Los días con un promedio de humedad relativa superior al 80% tuvieron un efecto negativo en la concentración de ADN de D. amygdali. Las precipitaciones tuvieron una influencia positiva en ambas partes del modelo, confirmando la contribución de la lluvia en la dispersión del inóculo. Finalmente, la variable velocidad del viento influyó positivamente en ambas partes del modelo, en ambas temporadas de crecimiento. En ensayos de laboratorio, se inocularon ramitas de 25 cultivares de almendro con cuatro aislados de D. amygdali, mientras que las inoculaciones de campo implicaron la inoculación de brotes en crecimiento de cultivares de almendro injertados en el portainjerto 'GF-677', durante cuatro años. En ambos tipos de experimentos, el inóculo consistió en discos de agar con micelio, que se insertaron debajo de la corteza y se midió la longitud de las lesiones causadas por el hongo. Todos los cultivares evaluados mostraron lesiones necróticas en respuesta a D. amygdali, confirmando su susceptibilidad. El análisis de conglomerados clasificó los cultivares como susceptibles o muy susceptibles. Las características agronómicas, como el tiempo de floración y maduración, se vincularon con la susceptibilidad de los cultivares. Los cultivares de floración tardía, muy tardía y de maduración temprana a media, mostraron una alta susceptibilidad. Se realizaron prospecciones entre 2018 y 2020 en seis provincias españolas, para recolectar e identificar oomicetos asociados con síntomas de pudrición de raíz y cuello en almendros. Se obtuvieron un total de 104 aislados de oomicetos procedentes de árboles enfermos, y la secuenciación de la región espaciadora transcrita interna (ITS) identificó especies de diferentes géneros. Phytopythium vexans y Ph. niederhauserii fueron las especies más frecuentes. Las pruebas de patogenicidad en plantas de almendro de un año de edad injertadas en el portainjerto 'Garnem' mostraron síntomas graves, como defoliación, marchitez y muerte regresiva, y algunas plantas murieron cuando se inocularon con Pp. vexans y Ph. niederhauserii. Algunos aislados de Ph. niederhauserii redujeron significativamente el peso seco de las raíces en comparación con el control, pero este efecto no se observó en plantas inoculadas con Pp. vexans. Se evaluó la patogenicidad de 12 especies de oomicetos presentes en el suelo en tres portainjertos híbridos de Prunus utilizados frecuentemente en la cuenca mediterránea. Se realizaron pruebas de patogenicidad con 15 aislados de oomicetos en plantas de portainjertos de 1 año de edad. Noventa días después de la inoculación se evaluaron los síntomas de la enfermedad con una escala de severidad y se calculó el AUDPC y la probabilidad de supervivencia de las plantas inoculadas. Todos los aislados fueron patógenos para las plántulas de los portainjertos y se volvieron a aislar de las lesiones de las raíces. Para cada portainjerto se detectaron grandes diferencias en virulencia entre las diferentes especies de oomicetos y aislados de Ph. niederhauserii. Phytophthora multivora y Pp. helicoides fueron generalmente los más virulentos. / [CA] Es va desenvolupar un assaig qPCR per a la detecció i quantificació d'inòcul aeri de D. amygdali, inclòs el disseny d'un parell d'encebadors específics per a aquesta espècie. Aquesta metodologia es va utilitzar per estudiar la dinàmica de l'inòcul de D. amygdali en trampes d'espores col·locades en dos horts d'ametllers de diferents indrets en dues temporades de creixement. Es va construir un model Hurdle de dues parts amb les dades climàtiques registrades; la primera part relacionava la presència o absència d'ADN de D. amygdali (Bernoulli o qualitatiu) i l'altra considerava la concentració mitjana d'ADN del fong (Gamma o quantitativa). L'efecte de la temperatura estava relacionat amb l'amplitud tèrmica diària; rangs tèrmics més amplis van reduir la concentració d'ADN, mentre que rangs tèrmics més estrets van augmentar la detecció d'ADN. Els dies amb una mitjana d'humitat relativa superior al 80% van tenir un efecte negatiu en la concentració d'ADN de D. amygdali. Les precipitacions van tenir una influència positiva en ambdues parts del model, confirmant la contribució de la pluja en la dispersió de l'inòcul. Finalment, la variable de velocitat del vent va influir positivament en ambdues parts del model, en ambdues temporades de creixement. En proves de laboratori, es van inocular branquetes de 25 cultivars d'ametller amb quatre aïllats de D. amygdali, mentre que les inoculacions de camp van implicar la inoculació de brots en creixement de cultivars d'ametller empeltats al portaempelt 'GF-677' durant quatre anys. En ambdós tipus d'experiments, l'inòcul consistia en discs d'agar amb miceli, que s'introduïen sota l'escorça i es mesuraven les longituds de les lesions provocades pel fong. Tots els cultivars avaluats van mostrar lesions necròtiques en resposta a D. amygdali, confirmant la seva susceptibilitat. L'anàlisi de conglomerats va categoritzar els cultivars com a susceptibles o molt susceptibles. Els trets agronòmics, com ara els temps de floració i maduració, estaven relacionats amb la susceptibilitat del conreu. Els cultivars de floració tardana, molt tardana i de maduració precoç a mitjana van mostrar una alta susceptibilitat. Entre el 2018 i el 2020 s'han realitzat prospeccions a 6 províncies d'Espanya per recollir i identificar oomicets associats a símptomes de podridura de l'arrel i del coll d'ametllers. Es van obtenir un total de 104 aïllats d'oomicets d'arbres malalts i la seqüenciació de la regió de l'espaiador transcrit intern (ITS) va identificar espècies de diferents gèneres. Phytopythium vexans i Ph. niederhauserii eren les espècies més comunes. Les proves de patogenicitat en plàntules d'ametller d'un any empeltades en el portaempelts 'Garnem' van revelar símptomes greus, com ara defoliació, marciment i mort, amb algunes plantes que van morir quan es van inocular amb Pp. vexans i Ph. niederhauserii. Alguns aïllats de Ph. niederhauserii van reduir significativament el pes sec de les arrels en comparació amb el control, però aquest efecte no es va observar en les plàntules inoculades amb Pp. vexans. Es va avaluar la patogenicitat de 12 espècies d'oomicets del sòl en tres portaempelts híbrids de Prunus d'ús habitual a la conca mediterrània. Es van realitzar proves de patogenicitat amb 15 aïllats d'oomicets en plàntules de portaempelt d'un any. Noranta dies després de la inoculació, es van avaluar els símptomes de la malaltia en una escala de gravetat i es va calcular AUDPC i la probabilitat de supervivència de les plàntules inoculades. Tots els aïllats van ser patògens per a les plàntules de portaempelt i es van tornar a aïllar de les lesions de les arrels. Per a cada portaempelt es van detectar grans diferències de virulència entre les diferents espècies d'oomicets i aïllats de Ph. niederhauserii. Phytophthora multivora i Pp. helicoides eren en general els més virulents. / [EN] A qPCR assay for the detection and quantification of aerial inoculum of D. amygdali, including the design of a pair of specific primers for this species, was developed. This methodology was used to study the dynamics of D. amygdali inoculum in spore traps placed at two almond orchards from different locations in two growing seasons. A two-part Hurdle model was built with the recorded climatic data; the first part related the presence or absence of D. amygdali DNA (Bernoulli or qualitative) and the other considered the average concentration of DNA of the fungus (Gamma or quantitative). The temperature effect was related to daily thermal amplitude; wider thermal ranges reduced DNA concentration, while narrower thermal ranges increased DNA detection. The days with average relative humidity higher than 80% had a negative effect on the concentration of D. amygdali DNA. Rainfall had a positive influence on both parts of the model, confirming the contribution of precipitation in the dispersal of inoculum. Finally, wind speed variable positively influenced both parts of the model, in both growing seasons. In laboratory tests, twigs from 25 almond cultivars were inoculated with four isolates of D. amygdali, while field inoculations involved the inoculation of growing shoots of almond cultivars grafted onto 'GF-677' rootstock over four years. In both type of experiments, inoculum consisted of agar plugs with mycelium, which were inserted underneath the bark and the lesion lengths caused by the fungus were measured. All evaluated cultivars showed necrotic lesions in response to D. amygdali, confirming their susceptibility. Cluster analysis categorized cultivars as susceptible or very susceptible. Agronomic traits, such as blooming and ripening times, were linked to cultivar susceptibility. Late blooming, very late blooming, and early to medium ripening cultivars exhibited high susceptibility. Surveys were carried out between 2018 and 2020 in 6 provinces of Spain to collect and identify oomycetes associated with root and crown rot symptoms on almond trees. A total of 104 oomycete isolates were obtained from diseased trees, and sequencing of the internal transcribed spacer (ITS) region identified species from different genera. Phytopythium vexans and Ph. niederhauserii were the most common species. Pathogenicity tests on one-year-old almond seedlings of 'Garnem' rootstock revealed severe symptoms, including defoliation, wilting, and dieback, with some plants dying when inoculated with Pp. vexans and Ph. niederhauserii. Some isolates of Ph. niederhauserii significantly reduced the dry weight of the roots compared with the control, but this effect was not observed in seedlings inoculated with Pp. vexans. Pathogenicity of 12 soil-borne oomycete species on three commonly used Prunus hybrid rootstocks in the Mediterranean Basin was evaluated. Pathogenicity tests with 15 oomycete isolates were conducted on 1-year-old rootstock seedlings. Ninety days after inoculation, disease symptoms were evaluated on a severity scale, and the AUDPC and the survival probability of the inoculated seedlings were calculated. All the isolates were pathogenic to the rootstock seedlings and were re-isolated from root lesions. For each rootstock large differences in virulence were detected among the different oomycete species and isolates of Ph. niederhauserii. Phytophthora multivora and Pp. helicoides were generally the most virulent. / Francisco Beluzán was supported by Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo/Subdirección de Capital Humano/Doctorado Becas Chile en el Extranjero/72200145. / Beluzán Flores, FJ. (2024). Study of Diseases Caused by Diaporthe Amygdali and Oomycetes on Almond Crops [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204445 / Compendio