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Nuevas funciones de Gcn2p en respuesta a estrés ácido y genotóxico.

Aparicio Sanchis, Rafael 03 March 2014 (has links)
El control traduccional y la traducción selectiva de algunos mRNA representan un mecanismo regulador de las células para adaptarse a diversas condiciones fisiológicas y de estrés ambiental. En Saccharomyces cerevisiae la activación de la ruta de control traduccional GCN, cuyo transductor principal es la quinasa Gcn2p, favorece la adaptación a situaciones de estrés por falta de nutrientes. Gcn2p es activada por tRNA descargados durante condiciones de ayuno de aminoácidos. Gcn2p fosforila eIF2¿ (Sui2p) en ser51 y esto inhibe la traducción general de los mRNA, al mismo tiempo que permite la traducción selectiva de determinados mRNA que son necesarios para la supervivencia celular. Uno de ellos es el mRNA de GCN4, un factor de transcripción que regula genes de biosíntesis de amino ácidos entre otros. El pH intracelular modula la actividad de muchos sistemas celulares, pero los mecanismos de regulación y de percepción son en su mayoría desconocidos. Previamente en el grupo se ha identificado dos genes de S. cerevisiae importantes para la tolerancia a la acidificación intracelular causada por ácidos débiles permeables: LEU2 y GCN2. En la presente tesis se ha comprobado que LEU2, funciona eliminando la dependencia de la absorción de leucina extracelular en cepas con auxotrofia para este aminoácido. Además, se ha profundizado en los mecanismos moleculares por los cuales Gcn2p responde a pH ácido intracelular. La acidificación intracelular activa Gcn2p probablemente por la inhibición de las aminoacil-tRNA sintetasas porque se observa la acumulación de tRNAleu descargados en condiciones sin ayuno de leucina. Gcn2p es requerida para el transporte de leucina y un mutante nulo gcn2¿ es sensible al estrés ácido sí es auxótrofo para leucina y Gcn4p no se requiere para la tolerancia a ácido. Además un mutante ser51>ala en eIF2¿ es sensible a ácido, lo que sugiere que Gcn2p, mediante la fosforilación de eIF2¿, puede activar la traducción de un regulador desconocido de transportadores de aminoácidos distinto de Gcn4p. En relación al estrés genotóxico, evidencias previas muestran que Gcn2p está implicado en el control del ciclo celular en respuesta a daño al DNA regulando la transición de fase G1-S. Pero, ¿cómo ocurre esta respuesta de Gcn2p y qué efectores están implicados? Hemos descubierto que distintos agentes lesionantes del DNA activan la quinasa Gcn2p, entre ellos el agente alquilante MMS. Todos ellos de algún modo generan estrés replicativo. La caracterización genética con los mutantes de la ruta GCN muestra que Gcn1p/Gcn20p están implicados en la fosforilación de eIF2¿ por Gcn2p en respuesta a MMS. Además Gcn1p y Gcn2p puede tener un papel relacionado con la toxicidad por MMS independientemente del control traduccional. El rastreo de diversas proteínas de control de daño y/o de reparación del DNA muestra que las proteínas Xrs2p, Tel1p y Mag1p se requieren para la activación de Gcn2p provocada por MMS. Las dos primeras, actúan en una ruta de señalización y control de daño donde el complejo MRX es independiente del control traduccional. La activación de Gcn2p también es dependiente de la proteína de reparación codificada por MAG1 (3-metiladenina DNA glicosilasa), la cuál es necesaria para la reparación del DNA debido a daño causado por agentes alquilantes como MMS. En la respuesta a MMS mediada por el control traduccional parece estar implicado el complejo epistático RAD52. Por lo tanto, Gcn2p está conectado funcionalmente con la maquinaria de reparación y/o control de daño en el DNA. La activación de Gcn2p por MMS está mediada por la inhibición de ciertas aminoacil-tRNA sintetasas. De ellas, parece tener un papel relevante Frs2p, la subunidad ¿ de la fenilalanil-tRNA sintetasa citosólica. / Aparicio Sanchis, R. (2014). Nuevas funciones de Gcn2p en respuesta a estrés ácido y genotóxico [Tesis doctoral]. Editorial Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36067 / Alfresco
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Molecular and genetic analyses of the PP2C-ABA receptor interaction in the abscisic acid signaling pathway

Antoni Alandes, Regina 17 June 2013 (has links)
La fitohormona ácido abscísico (ABA) juega un papel crucial en el control de la respuesta a estrés y en la regulación del crecimiento y desarrollo de la planta. La unión del ABA a los receptores intracelulares PYR/PYL/RCAR conlleva la inhibición de las PP2Cs del clado A tales como ABI1 o HAB1, causando la activación de la ruta de señalización del ABA. Para obtener más información en la señalización del ABA nos hemos centrado en la caracterización de miembros de estas dos familias proteicas. Hemos generado una versión mutada de HAB1 que contiene una mutación en el Trp-385, residuo clave para la interacción con los receptores y con la molécula de ABA. Como resultado, hab1W385A se mostró refractaria a la inhibición por los receptores PYR/PYL/RCAR. Así, en ensayos de actividad quinasa in vitro encontramos que hab1W385A era capaz de desfosforilar a OST1 incluso en presencia de ABA y de los receptores. hab1W385A y hab1G246D pueden ser clasificadas como mutaciones dominantes hipermórficas. Mientras que hab1G246D posee una actividad fosfatasa reducida, el nuevo alelo dominante muestra una actividad idéntica al genotipo salvaje. Líneas transgénicas de Arabidopsis sobreexpresando hab1W385A mostraron una fuerte insensibilidad al ABA. También hemos analizado el papel de las PP2Cs del clado A pertenecientes a la rama representada por PP2CA. La generación de un mutante doble pp2ca-1hai1-1, que muestra mayor sensibilidad a la hormona en comparación con el genotipo salvaje y con los mutantes sencillos, reveló que HAI1 es un regulador negativo de la ruta de señalización del ABA. El análisis de la localización subcelular mostró que tanto HAI1 como PP2CA se localizan en el núcleo, aunque también están presentes en el citosol y en la fracción microsomal. Tres miembros de la rama de PP2CA i.e.: PP2CA, AHG1 y HAI1, mostraron una inhibición selectiva por los receptores PYR/PYL/RCAR. Estos resultados sugieren que estos receptores pueden discriminar entre miembros del clado A de las PP2Cs. pyl8 es el único mutante sencillo que muestra sensibilidad reducida al ABA en ensayos de crecimiento de raíz. Análisis usando el gen reportero GUS mostraron que PYL8 estaba presente en la estela, en la epidermis de la raíz y en la caliptra, y la cuantificación de la actividad beta-glucuronidasa en raíz mostró que PYL8 es uno de los receptores con mayor nivel de expresión. La caliptra juega un papel crucial en la respuesta hidrotrópica. El estudio de esta respuesta en mutantes múltiples de las PP2Cs y de los PYR/PYL/RCAR reforzó la idea de que el ABA regula este proceso. Así, mientras el mutante séxtuple pyr/pyl112458 presentó una curvatura menor al aplicársele un gradiente de humedad, el mutante cuádruple de las PP2Cs (Qabi2-2) mostró una curvatura más pronunciada en estas condiciones, evitando las zonas con menor potencial hídrico. Finalmente, en la última parte de este trabajo se utilizaron abordajes genético-químicos para aumentar la resistencia a la sequía. Hemos llevado a cabo un rastreo con compuestos químicos para aislar nuevos agonistas del ABA. Basado en datos estructurales de los receptores, se seleccionaron 500 compuestos que fueron ensayados en Arabidopsis. De estos, el compuesto 2C06 inhibió el crecimiento de raíz en plantas salvajes más que en mutantes pyr/pyl/rcar insensibles a ABA y produjo resultados prometedores in vitro al inhibir a las PP2Cs e interaccionar con éstas en ensayos de doble híbrido. / Antoni Alandes, R. (2013). Molecular and genetic analyses of the PP2C-ABA receptor interaction in the abscisic acid signaling pathway [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/29756 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales
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DESIGN OF GENETIC ELEMENTS AND SOFTWARE TOOLS FOR PLANT SYNTHETIC BIOLOGY

Vázquez Vilar, Marta 01 September 2016 (has links)
Tesis por compendio / [EN] Synthetic Biology is an emerging interdisciplinary field that aims to apply the engineering principles of modularity, abstraction and standardization to genetic engineering. The nascent branch of Synthetic Biology devoted to plants, Plant Synthetic Biology (PSB), offers new breeding possibilities for crops, potentially leading to enhanced resistance, higher yield, or increased nutritional quality. To this end, the molecular tools in the PSB toolbox need to be adapted accordingly, to become modular, standardized and more precise. Thus, the overall objective of this Thesis was to adapt, expand and refine DNA assembly tools for PSB to enable the incorporation of functional specifications to the description of standard genetic elements (phytobricks) and to facilitate the construction of increasingly complex and precise multigenic devices, including genome editing tools. The starting point of this Thesis was the modular DNA assembly method known as GoldenBraid (GB), based on type IIS restriction enzymes. To further optimize the GB construct-making process and to better catalog the phytobricks collection, a database and a set of software-tools were developed as described in Chapter 1. The final webbased software package, released as GB2.0, was made publicly available at www.gbcloning.upv.es. A detailed description of the functioning of GB2.0, exemplified with the building of a multigene construct for anthocyanin overproduction was also provided in Chapter 1. As the number and complexity of GB constructs increased, the next step forward consisted in the refinement of the standards with the incorporation of experimental information associated to each genetic element (described in Chapter 2). To this end, the GB package was reshaped into an improved version (GB3.0), which is a self-contained, fully traceable assembly system where the experimental data describing the functionality of each DNA element is displayed in the form of a standard datasheet. The utility of the technical specifications to anticipate the behavior of composite devices was exemplified with the combination of a chemical switch with a prototype of an anthocyanin overproduction module equivalent to the one described in Chapter 1, resulting in a dexamethasone-responsive anthocyanin device. Furthermore, Chapter 3 describes the adaptation and functional characterization of CRISPR/Cas9 genome engineering tools to the GB technology. The performance of the adapted tools for gene editing, transcriptional activation and repression was successfully validated by transient expression in N. benthamiana. Finally, Chapter 4 presents a practical implementation of GB technology for precision plant breeding. An intragenic construct comprising an intragenic selectable marker and a master regulator of the flavonoid biosynthesis was stably transformed in tomato resulting in fruits enhanced in flavonol content. All together, this Thesis shows the implementation of increasingly complex and precise genetic designs in plants using standard elements and modular tools following the principles of Synthetic Biology. / [ES] La Biología Sintética es un campo emergente de carácter interdisciplinar que se fundamenta en la aplicación de los principios ingenieriles de modularidad, abstracción y estandarización a la ingeniería genética. Una nueva vertiente de la Biología Sintética aplicada a las plantas, la Biología Sintética Vegetal (BSV), ofrece nuevas posibilidades de mejora de cultivos que podrían llevar a una mejora de la resistencia, a una mayor productividad, o a un aumento de la calidad nutricional. Sin embargo, para alcanzar este fin las herramientas moleculares disponibles en estos momentos para BSV deben ser adaptadas para convertirse en modulares, estándares y más precisas. Por ello se planteó como objetivo general de esta Tesis adaptar, expandir y refinar las herramientas de ensamblaje de DNA de la BSV para permitir la incorporación de especificaciones funcionales en la descripción de elementos genéticos estándar (fitobricks) y facilitar la construcción de estructuras multigénicas cada vez más complejas y precisas, incluyendo herramientas de editado genético. El punto de partida de esta Tesis fue el método de ensamblaje modular de ADN GoldenBraid (GB) basado en enzimas de restricción tipo IIS. Para optimizar el proceso de ensamblaje y catalogar la colección de fitobricks generados se desarrollaron una base de datos y un conjunto de herramientas software, tal y como se describe en el Capítulo 1. El paquete final de software se presentó en formato web como GB2.0, haciéndolo accesible al público a través de www.gbcloning.upv.es. El Capítulo 1 también proporciona una descripción detallada del funcionamiento de GB2.0 ejemplificando su uso con el ensamblaje de una construcción multigénica para la producción de antocianinas. Con el aumento en número y complejidad de las construcciones GB, el siguiente paso necesario fue el refinamiento de los estándar con la incorporación de la información experimental asociada a cada elemento genético (se describe en el Capítulo 2). Para este fin, el paquete de software de GB se reformuló en una nueva versión (GB3.0), un sistema de ensamblaje auto-contenido y completamente trazable en el que los datos experimentales que describen la funcionalidad de cada elemento genético se muestran en forma de una hoja de datos estándar. La utilidad de las especificaciones técnicas para anticipar el comportamiento de dispositivos biológicos compuestos se ejemplificó con la combinación de un interruptor químico y un prototipo de un módulo de sobreproducción de antocianinas equivalente al descrito en el Capítulo 1, resultando en un dispositivo de producción de antocianinas con respuesta a dexametasona. Además, en el Capítulo 3 se describe la adaptación a la tecnología GB de las herramientas de ingeniería genética CRISPR/Cas9, así como su caracterización funcional. La funcionalidad de estas herramientas para editado génico y activación y represión transcripcional se validó con el sistema de expresión transitoria en N.benthamiana. Finalmente, el Capítulo 4 presenta una implementación práctica del uso de la tecnología GB para hacer mejora vegetal de manera precisa. La transformación estable en tomate de una construcción intragénica que comprendía un marcador de selección intragénico y un regulador de la biosíntesis de flavonoides resultó en frutos con un mayor contenido de flavonoles. En conjunto, esta Tesis muestra la implementación de diseños genéticos cada vez más complejos y precisos en plantas utilizando elementos estándar y herramientas modulares siguiendo los principios de la Biología Sintética. / [CA] La Biologia Sintètica és un camp emergent de caràcter interdisciplinar que es fonamenta amb l'aplicació a la enginyeria genètica dels principis de modularitat, abstracció i estandarització. Una nova vessant de la Biologia Sintètica aplicada a les plantes, la Biologia Sintètica Vegetal (BSV), ofereix noves possibilitats de millora de cultius que podrien portar a una millora de la resistència, a una major productivitat, o a un augment de la qualitat nutricional. Tanmateix, per poder arribar a este fi les eines moleculars disponibles en estos moments per a la BSV han d'adaptar-se per convertir-se en modulars, estàndards i més precises. Per això es plantejà com objectiu general d'aquesta Tesi adaptar, expandir i refinar les eines d'ensamblatge d'ADN de la BSV per permetre la incorporació d'especificacions funcionals en la descripció d'elements genètics estàndards (fitobricks) i facilitar la construcció d'estructures multigèniques cada vegada més complexes i precises, incloent eines d'edidat genètic. El punt de partida d'aquesta Tesi fou el mètode d'ensamblatge d'ADN modular GoldenBraid (GB) basat en enzims de restricció tipo IIS. Per optimitzar el proces d'ensamblatge i catalogar la col.lecció de fitobricks generats es desenvolupà una base de dades i un conjunt d'eines software, tal i com es descriu al Capítol 1. El paquet final de software es presentà en format web com GB2.0, fent-se accessible al públic mitjançant la pàgina web www.gbcloning.upv.es. El Capítol 1 també proporciona una descripció detallada del funcionament de GB2.0, exemplificant el seu ús amb l'ensamblatge d'una construcció multigènica per a la producció d'antocians. Amb l'augment en nombre i complexitat de les construccions GB, el següent pas fou el refinament dels estàndards amb la incorporació de la informació experimental associada a cada element genètic (es descriu en el Capítol 2). Per a aquest fi, el paquet de software de GB es reformulà amb una nova versió anomenada GB3.0. Aquesta versió consisteix en un sistema d'ensamblatge auto-contingut i complemtament traçable on les dades experimentals que descriuen la funcionalitat de cada element genètic es mostren en forma de fulla de dades estàndard. La utilitat de les especificacions tècniques per anticipar el comportament de dispositius biològics compostos s'exemplificà amb la combinació de un interruptor químic i un prototip d'un mòdul de sobreproducció d'antocians equivalent al descrit al Capítol 1. Aquesta combinació va tindre com a resultat un dispositiu de producció d'antocians que respón a dexametasona. A més a més, al Capítol 3 es descriu l'adaptació a la tecnologia GB de les eines d'enginyeria genètica CRISPR/Cas9, així com la seua caracterització funcional. La funcionalitat d'aquestes eines per a l'editat gènic i activació i repressió transcripcional es validà amb el sistema d'expressió transitòria en N. benthamiana. Finalment, al Capítol 4 es presenta una implementació pràctica de l'ús de la tecnologia GB per fer millora vegetal de mode precís. La transformació estable en tomaca d'una construcció intragènica que comprén un marcador de selecció intragènic i un regulador de la biosíntesi de flavonoïdes resultà en plantes de tomaca amb un major contingut de flavonols en llur fruits. En conjunt, esta Tesi mostra la implementació de dissenys genètics cada vegada més complexos i precisos en plantes utilitzant elements estàndards i eines modulars seguint els principis de la Biologia Sintètica. / Vázquez Vilar, M. (2016). DESIGN OF GENETIC ELEMENTS AND SOFTWARE TOOLS FOR PLANT SYNTHETIC BIOLOGY [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/68483 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio
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Fundamental and applied research in ABA signaling: Regulation by ABA of the chromatin remodeling ATPase BRAHMA and biotechnological use of the PP2CA promoter

Peirats Llobet, Marta 13 June 2017 (has links)
Optimal response to drought is critical for plant survival and will affect biodiversity and crop performance during climate change. Mitotically heritable epigenetic and dynamic chromatin state changes have been implicated in the plant response to the drought stress hormone abscisic acid (ABA). The Arabidopsis SWI/SNF chromatin-remodeling ATPase BRAHMA (BRM) modulates response to ABA by preventing premature activation of stress response pathways during germination. Here, we show that the core ABA signalosome formed by ABA receptors, PP2Cs and SnRK2s physically interact with BRM to regulate BRM activity and post-translationally modify BRM by phosphorylation/dephosphorylation. Genetic evidence suggests that BRM acts downstream of SnRK2.2/2.3 kinases and biochemical studies identified evolutionary conserved SnRK2 phosphorylation sites in the C-terminal region of BRM. Our data suggest that SnRK2-dependent phosphorylation of BRM leads to its inhibition, and PP2CA-mediated dephosphorylation of BRM restores the ability of BRM to repress ABA response. ABA plays a key role to regulate germination and post-germination growth and the AP2-type ABI4 and bZIP-type ABI5 transcription factors (TFs) are required for ABA-mediated inhibition of post-germination growth when the embryo encounters water stress. The growth arrest induced by ABI4 and ABI5 involves ABA signaling and in the case of ABI5, it has been demonstrated that ABA inhibits the activity of BRM to induce ABI5 transcription. Loss of BRM activity leads to destabilization of a nucleosome involved in repression of ABI5 transcription. Therefore reduction of BRM activity in the brm-3 allele leads to enhanced expression of ABI5 in 2-d-old seedlings and enhanced sensitivity to ABA. Novel genetic evidence obtained in this work indicates that ABI4 is one of the redundant TFs regulated by BRM that mediate ABA response during germination and early seedling growth. Thus, the association of BRM with the ABI4 locus together with the observed derepression of ABI4 expression in brm-3 suggests that BRM directly regulates ABI4 expression. Finally, this work provides a direct link between the ABA signalosome and the chromatin-remodeling ATPase BRM, which enables ABA-dependent modulation of BRM activity as a possible mechanism to enhance plant drought tolerance. Additionally, we identified and characterized the promoter of PP2CA as a stress-inducible promoter and we have used it to drive the expression of ABA receptors from Arabidopsis and Solanum lycopersicum. This technology appears to be promising for the expression of ABA receptors in an inducible manner and to generate drought tolerant plants. / La respuesta óptima a la sequía es crítica para la supervivencia de las plantas y afectará a la biodiversidad y al rendimiento de los cultivos durante el cambio climático. Las modificaciones epigenéticas y los cambios dinámicos del estado de la cromatina han sido implicados en la respuesta de la planta al ácido abscísico (ABA), la conocida como la hormona del estrés hídrico. La ATPasa remodeladora de cromatina de tipo SWI/SNF de Arabidopsis, BRAHMA (BRM), modula la respuesta al ABA mediante la prevención de la activación prematura de las vías de respuesta al estrés durante la germinación. Aquí, mostramos que el núcleo del señalosoma de ABA formado por los receptores de ABA, las PP2Cs y las SnRK2s interaccionan físicamente con BRM para regular su actividad y modificarla post-traduccionalmente por mecanismos de fosforilación/desfosforilación. La evidencia genética sugiere que BRM actúa aguas abajo de las quinasas SnRK2.2/2.3 y los estudios bioquímicos identificaron la presencia en la región C-terminal de BRM de sitios de fosforilación de las SnRK2 que estaban conservados evolutivamente. Nuestros datos sugieren que la fosforilación de BRM que depende de las SnRK2 conduce a su inhibición, y que la desfosforilación de BRM mediada por PP2CA restaura la capacidad de BRM para reprimir la respuesta a ABA. El ABA juega un papel clave en la regulación de la germinación y el crecimiento post germinativo y los factores de transcripción de tipo AP2 como ABI4 y de tipo bZIP como ABI5, son necesarios para la inhibición del crecimiento post germinativo mediado por ABA cuando los embriones encuentran estrés hídrico. La detención del crecimiento inducida por ABI4 y ABI5 implica la señalización de ABA y en el caso de ABI5, se ha demostrado que el ABA inhibe la actividad de BRM para inducir la transcripción de ABI5. La pérdida de actividad de BRM conduce a la desestabilización de un nucleosoma implicado en la represión de la transcripción de ABI5. Por lo tanto, la reducción de la actividad de BRM en el alelo brm-3 conduce a una mayor expresión de ABI5 en plántulas de 2 días y una mayor sensibilidad a ABA. La nueva evidencia genética obtenida en este trabajo indica que ABI4 es uno de los factores de transcripción redundantes regulados por BRM que median la respuesta a ABA durante los estadios de germinación y crecimiento temprano de las plántulas. La asociación de BRM con el locus ABI4, junto con la desrepresión de la expresión de ABI4 observada en el mutante brm-3 sugiere que BRM regula directamente la expresión de ABI4. Por último, este trabajo proporciona una relación directa entre el señalosoma de ABA y la ATPasa remodeladora de cromatina BRM, que permite la modulación de la actividad de BRM de modo dependiente de ABA como un posible mecanismo para mejorar la tolerancia a sequía de las plantas. Además, hemos identificado y caracterizado el promotor de PP2CA como un promotor inducible por estrés y lo hemos utilizado para dirigir la expresión de los receptores de ABA de Arabidopsis y Solanum lycopersicum. Esta tecnología parece ser prometedora para la expresión de receptores de ABA de modo inducible y para generar plantas tolerantes a la sequía. / La resposta òptima a la sequera és crítica per a la supervivència de les plantes i afectarà la biodiversitat i al rendiment dels cultius durant el canvi climàtic. Les modificacions epigenètiques i els canvis dinàmics de l'estat de la cromatina han estat implicats en la resposta de la planta a l'àcid abscísic (ABA), la coneguda com hormona de l'estrès hídric. La ATPasa remodeladora de cromatina de tipus SWI/SNF d'Arabidopsis, BRAHMA (BRM), modula la resposta al ABA mitjançant la prevenció de l'activació prematura de les vies de resposta a l'estrès durant la germinació. Ací, mostrem que el nucli del senyalosoma d'ABA format pels receptors d'ABA, les PP2Cs i les SnRK2s interaccionen físicament amb BRM per regular la seva activitat i modificar-la post-traduccionalment per mecanismes de fosforilació/desfosforilació. L'evidència genètica suggereix que BRM actua aigües avall de les quinases SnRK2.2/2.3 i els estudis bioquímics van identificar la presència, a la regió C-terminal de BRM, de llocs de fosforilació de les SnRK2 que estaven conservats evolutivament. Les nostres dades suggereixen que la fosforilació de BRM que depèn de les SnRK2, condueix a la inhibició de BRM, i que la defosforilació de BRM mediada per PP2CA restaura la capacitat de BRM per reprimir la resposta a ABA. El ABA juga un paper clau en la regulació de la germinació i el creixement post-germinació i els factors de transcripció de tipus AP2 com ABI4 i de tipus bZIP com ABI5, són necessaris per a la inhibició del creixement post-germinació mediat per ABA quan els embrions pateixen estrès hídric. La detenció del creixement induïda per ABI4 i ABI5 implica la senyalització d'ABA i en el cas d'ABI5, s'ha demostrat que l'ABA inhibeix l'activitat de BRM per induir la transcripció d'ABI5. La pèrdua d'activitat de BRM condueix a la desestabilització d'un nucleosoma implicat en la repressió de la transcripció d'ABI5. Per tant, la reducció de l'activitat de BRM a l'al·lel brm-3 condueix a una major expressió d'ABI5 en plàntules de 2 dies i una major sensibilitat a l'ABA. La nova evidència genètica obtinguda en aquest treball indica que ABI4 és un dels factors de transcripció redundants que són regulats per BRM que medien la resposta a l'ABA durant els estadis de germinació i creixement primerenc de les plàntules. Per tant, l'associació de BRM amb el locus ABI4, juntament amb la desrepressió de l'expressió de ABI4 observada al mutant brm-3 suggereix que BRM regula directament l'expressió d'ABI4. Finalment, aquest treball proporciona una relació directa entre el senyalosoma d'ABA i l'ATPasa remodeladora de cromatina BRM, que permet la modulació de l'activitat de BRM de manera dependent d'ABA com un possible mecanisme per millorar la tolerància a sequera de les plantes. A més, hem identificat i caracteritzat el promotor de PP2CA com un promotor induïble per estrès i l'hem utilitzat per dirigir l'expressió dels receptors d'ABA d'Arabidopsis i Solanum lycopersicum. Aquesta tecnologia sembla ser prometedora per a l'expressió de receptors d'ABA de manera induïble i per generar plantes tolerants a la sequera. / Peirats Llobet, M. (2017). Fundamental and applied research in ABA signaling: Regulation by ABA of the chromatin remodeling ATPase BRAHMA and biotechnological use of the PP2CA promoter [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/82694 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales
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Development of CRISPR-based programmable transcriptional regulators and their applications in plants

Selma García, Sara 01 September 2022 (has links)
[ES] La Biología Sintética de Plantas tiene como objetivo rediseñar las plantas para que adquieran características y funcionalidades novedosas a través de circuitos reguladores ortogonales. Para lograr este objetivo, se deben desarrollar nuevas herramientas moleculares con la capacidad de interactuar con factores endógenos de manera potente y específica. CRISPR/Cas9 surgió como una herramienta prometedora que combina la capacidad personalizable de unión al DNA, a través de la versión catalíticamente inactivada de la proteína Cas9 (dCas9), con la posibilidad de anclar dominios autónomos de activación transcripcional (TADs) a su estructura para lograr una regulación específica de la expresión génica. Los activadores transcripcionales programables (PTAs) pueden actuar como procesadores específicos, ortogonales y versátiles para el desarrollo de nuevos circuitos genéticos en las plantas. En busca de dCas9-PTA optimizados, se llevó a cabo una evaluación combinatoria de diferentes arquitecturas dCas9 con un catálogo de varios TAD. La mejor herramienta resultante de esta comparación, denominada dCasEV2.1, se basa en la estrategia scRNA y la combinación de los dominios de activación EDLL y VPR con un bucle multiplexable gRNA2.1, que es una versión mutada del gRNA2.0 descrito previamente. En este trabajo, el activador programable dCasEV2.1 demostró ser una herramienta potente y específica, logrando tasas de activación más altas que otras estrategias dCas9 disponibles en plantas. Se observaron tasas de activación sin precedentes dirigidas a genes endógenos en N. benthamiana, acompañadas de una estricta especificidad en todo el genoma, lo que hace que esta herramienta sea adecuada para la regulación estricta de redes reguladoras complejas. Como prueba de concepto, se diseñaron cuatro programas de activación para distintas ramas de la ruta de los flavonoides, buscando obtener enriquecimientos metabólicos específicos en hojas de N. benthamiana. El análisis metabólico de las hojas metabólicamente reprogramadas mediante dCasEV2.1 reveló un enriquecimiento selectivo de los metabolitos diana y sus derivados glicosilados, que se correlacionaron con el programa de activación empleado. Estos resultados demuestran que dCasEV2.1 es una herramienta eficaz para la ingeniería metabólica y un componente clave en los circuitos genéticos destinados a reprogramar los flujos metabólicos. Finalmente, basándonos en dCasEV2.1, desarrollamos un sistema optimizado de regulación de genes inducidos por virus (VIGR) que utiliza un vector Potato Virus X (PVX) para el suministro de los programas de activación CRISPR codificados con gRNA. Este enfoque permite controlar el transcriptoma de la planta a través de una aplicación sistémica basada en aerosol de componentes CRISPR a plantas adultas. El nuevo sistema PVX-VIGR produjo una fuerte activación transcripcional en varios genes diana endógenos, incluidos tres factores de transcripción MYB-like seleccionados. Las activaciones específicas de MYB condujeron a perfiles metabólicos distintivos, demostrando que las aplicaciones potenciales de la herramienta dCasEV2.1 en plantas incluyen la obtención de perfiles metabólicos personalizados utilizando un suministro basado en aerosol de instrucciones de reprogramación transcripcional codificadas por gRNA. En resumen, esta tesis proporciona herramientas novedosas para la activación transcripcional fuerte, ortogonal y programable en plantas, con una caja de herramientas ampliada para el suministro de los programas de activación. / [CA] La Biologia Sintètica de Plantes té com objectiu redissenyar les plantes per que obtinguen característiques i funcionalitats innovadores mitjançant circuits reguladors ortogonals. Per arribar a aquest objectiu, s'han de desenvolupar noves ferramentes moleculars amb la capacitat d'interactuar amb factor endògens d'una manera potent i específica. CRISPR/Cas9 va sorgir com una ferramenta prometedora que combina la capacitat personalitzable d'unió al DNA, mitjançant la versió catalíticament inactivada de la proteïna Cas9 (dCas9), amb la possibilitat de fixar dominis autònoms de activació transcripcional (TADs) a la seua estructura per aconseguir una regulació específica de la expressió gènica. Els activadors transcripcionals programables (PTAs) poden actuar com a processadors específics, ortogonals i versàtils per al desenvolupament de nous circuits genètics a les plantes. Buscant dCas9-PTA optimitzats, es va realitzar una avaluació combinatòria de distintes arquitectures dCas9 amb un catàleg de diversos TAD. La millor ferramenta segons aquesta comparació, anomenada dCasEV2.1, es basa en la estratègia scRNA i la combinació del dominis d'activació EDLL i VPR amb un bucle multiplexable gRNA2.1, que es una versió mutada del gRNA2.0 descrit prèviament. En aquest treball, el activador programable dCasEV2.1 es va mostrar com una ferramenta potent i específica, aconseguint nivells d'activació majors que altes estratègies dCas9 disponibles en plantes. Es van observar taxes d'activació sense precedents dirigides a gens endògens en N. benthamiana, junt a una estricta especificitat en tot el genoma, indicant que aquesta ferramenta és adequada per a la regulació estricta de xarxes reguladores complexes. Como proba de concepte, se van dissenyar quatre programes d'activació per a diferent branques de la ruta dels flavonoides, cercant obtenir enriquiments metabòlics específics en fulles de N. benthamiana. L'anàlisi metabòlic de les fulles metabòlicament reprogramades mitjançant dCasEV2.1 va revelar un enriquiment selectiu del metabòlits diana i els seus derivats glicosilats que es correlacionen amb el programa d'activació emprat. Aquests resultats demostren que dCasEV2.1 és una ferramenta eficaç per a l'enginyeria metabòlica i un component clau als circuits genètics destinats a reprogramar els fluxos metabòlics. Finalment, en base a dCasEV2.1, desenvoluparem un sistema optimitzat de regulació de gens induïts per virus (VIGR) que utilitza un vector Potato Virus X (PVX) per al subministrament dels programes d'activació CRISPR codificats amb gRNA. Aquesta aproximació permet controlar el transcriptoma de la planta mitjançant l'aplicació sistèmica basada en aerosol de components CRISPR a plantes adultes. El nou sistema PVX-VIGR va produir una gran activació transcripcional en diversos gens diana endògens, inclosos tres factors de transcripció MYB-like seleccionats prèviament. Les activacions específiques de MYB conduïren a perfils metabòlics distintius, demostrant que les aplicacions potencials de la ferramenta dCasEV2.1 en plantes inclouen la obtenció de perfils metabòlics personalitzats emprant un subministrament basat en aerosol de instruccions de reprogramació transcripcional codificades per gRNA. En resum, aquesta tesis proporciona noves ferramentes per a l'activació transcripcional forta, ortogonal i programable en plantes, amb una caixa de ferramentes eixamplada per al subministraments dels programes d'activació. / [EN] Plant Synthetic Biology aims to redesign plants to acquire novel traits and functionalities through orthogonal regulatory circuits. To achieve this goal, new molecular tools with the capacity of interacting with endogenous factors in a potent and specific manner must be developed. CRISPR/Cas9 emerged as promising tools which combine a customizable DNA-binding activity through the catalytically inactivated version of Cas9 protein (dCas9) with the possibility to anchor autonomous transcriptional activation domains (TADs) to its structure to achieve a specific regulation of the gene expression. The Programmable Transcriptional Activators (PTAs) could act as specific, orthogonal and versatile processor components in the development of new genetic circuits in plants. In search for optimized dCas9-PTAs, a combinatorial evaluation of different dCas9 architectures with a catalogue of various TADs was performed. The best resulting tool of this comparison, named dCasEV2.1, is based on the scRNA strategy and the combination of EDLL and VPR activation domains with a multiplexable gRNA2.1 loop, which is a mutated version of the previously described gRNA2.0. In this work, the dCasEV2.1 programable activator was proved to be a strong and specific tool, achieving higher activation rates than other available dCas9 strategies in plants. Unprecedented activation rates were observed targeting endogenous genes in N. benthamiana, accompanied by strict genome-wide specificity that makes this tool suitable to perform a tight regulation of complex regulatory networks. As a proof of concept, a design of four activation programs to activate different branches of the flavonoid pathway and obtain specific metabolic enrichments in N. benthamiana leaves was performed. The metabolic analysis on the dCasEV2.1 metabolically reprogrammed leaves revealed a selective enrichment of the targeted metabolites and their glycosylated derivatives that correlated with the activation program employed. These results demonstrate that dCasEV2.1 is a powerful tool for metabolic engineering and a key component in genetic circuits aimed at reprogramming metabolic fluxes. Finally, based on dCasEV2.1, we developed an optimized Viral Induced Gene Regulation (VIGR) system that makes use of a Potato Virus X (PVX) vector for the delivery of the gRNA-encoded CRISPR activation programs. This approach offers a way to control the plant transcriptome through a spray-based systemic delivery of CRISPR components to adult plants. The new PVX-VIGR system led to strong transcriptional activation in several endogenous target genes, including three selected MYB-like transcription factors. Specific MYB activations lead to distinctive metabolic profiles, showing that the potential applications of the dCasEV2.1 tool in plants include the obtention of custom metabolic profiles using a spray-based delivery of gRNA-encoded transcriptional reprogramming instructions. In sum, this thesis provides novel tools for strong, orthogonal and programmable transcriptional activation in plants, with an expanded toolbox for the delivery of the activation programs. / Selma García, S. (2022). Development of CRISPR-based programmable transcriptional regulators and their applications in plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185046 / TESIS
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Caracterización del gen CRIO4 y su implicación en tolerancia a estrés por frío

Izquierdo García, Ana Cristina 22 April 2016 (has links)
[EN] Cold is one of the most important abiotic stresses, severely affects the growth and development of plants, and limits their geographical distribution. Given that cold, salinity and drought stresses overlap some of their molecular mechanisms of response, a cDNA library of sugar beet (Beta vulgaris), generated from leaves of plants subjected to saline stress, was used to try to identify genes for tolerance to cold stress by its overexpression in yeast. In this way it was identified, among others, the CRIO4 gene whose characterization has been the work of this thesis. CRIO4 encodes a SEC14-like protein, and it is ortholog to PATL family of Arabidopsis thaliana and it shares a conserved domain with SEC14 and SFH family of yeast. CRIO4 overexpression confers to the yeast cells the ability to grow at low temperatures and tolerance to tunicamycin (an inhibitor of protein glycosylation). The in silico analysis of the CRIO4 sequence confirms several motifs and domains conserved in the protein that seem to direct its function toward the vesicular trafficking, and it reveals multiple potential phosphorylation sites in CRIO4 suggesting a possible role in signaling. Sec14 domain is a phospholipid binding and transfer domain, and the obtained results indicate that CRIO4 binds to phosphatidylinositol and phosphatidylethanolamine. CRIO4 does not complement the function of Sec14p of yeast, and this could be due to the lack of phosphatidylcholine affinity by CRIO4. Tryptophan transport is the greatest limiting factor for growth at low temperatures in yeast. The results of the yeast coexpression assay of CRIO4 and TAT2 (a high-affinity tryptophan permease) displayed in this thesis, seem to indicate stimulation of Tat2p transport to the plasma membrane by CRIO4, which could develop into an enhanced tryptophan absorption, thereby explaining the greater cold tolerance conferred by overexpression of CRIO4 in yeast. The subcellular localization study has shown that CRIO4 is associated with the plasma membrane and intracellular membranes, being part of vesicles, which seems to confirm the role of CRIO4 in intracellular trafficking, function that it would share with its orthologous genes. The expression pattern of CRIO4 in sugar beet has shown that CRIO4 is expressed in all analyzed tissues, focusing its highest expression in leaf and root. It has also been shown that CRIO4 expression increases after shorter exposure to cold stress and heat stress. Phenotypic studies of several mutant lines of PATLs genes from Arabidopsis thaliana have been carried out and high variability in results was obtained, this could be due to functional redundancy among the members of this multigenic family. Phenotypic studies of transgenic lines of Arabidopsis thaliana overexpressing the CRIO4 gene have also been performed. These lines show an improvement in their growth and development at low temperatures, thereby increasing their tolerance to cold stress. Furthermore, expression of CRIO4, in A. thaliana transgenic lines, increases considerably after cold stress and heat shock. Moreover, accumulation points of CRIO4 were observed along the whole cell, after heat shock. Intracellular recycling of PIN2, a gravitropic response indicator, is affected by decreasing temperature. The results obtained in this thesis suggest that overexpression of CRIO4 reactivates intracellular transport of PIN2 under cold stress, which would imply that its phenotype is related to auxin traffic. / [ES] El frío es uno de los estreses abióticos más importantes, afecta severamente al crecimiento y desarrollo de las plantas, y limita su distribución geográfica. Puesto que el estrés por frío, por salinidad y por sequía solapan algunos de sus mecanismos moleculares de respuesta, se usó una biblioteca de ADNc de remolacha (Beta vulgaris) generada con hojas de plantas sometidas a estrés salino, para tratar de identificar genes de tolerancia a estrés por frío mediante su sobreexpresión en levadura. De este modo se identificó, entre otros, el gen CRIO4 cuya caracterización ha sido el trabajo de esta tesis. CRIO4 codifica una proteína tipo Sec14, y es ortólogo a la familia PATL de Arabidopsis thaliana y tiene un dominio conservado con SEC14 y la familia SFH de levadura. La sobreexpresión de CRIO4 confiere a las células de levadura la capacidad de crecer a temperaturas bajas y tolerancia a tunicamicina (inhibidor de la glicosilación de proteínas). El análisis in silico de la secuencia de CRIO4 confirma diversos motivos y dominios conservados en la proteína que parecen dirigir su función hacia el tráfico vesicular, y revela múltiples potenciales sitios de fosforilación en CRIO4 sugiriendo una posible función en señalización. El dominio Sec14 es un dominio de unión y transferencia de fosfolípidos, y los resultados obtenidos indican que CRIO4 establece unión con fosfatidiolinositol y fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la función de Sec14p de levadura, y esto podría ser debido a la falta de afinidad de CRIO4 por fosfatidilcolina. En levadura, el transporte de triptófano es el mayor factor limitante para el crecimiento a temperaturas bajas. Los resultados del ensayo de coexpresión de CRIO4 con TAT2 (una permeasa de alta afinidad para triptófano) en levadura mostrados en esta tesis, parecen indicar una estimulación del transporte de Tat2p hacia la membrana plasmática por parte de CRIO4, que podría devenir en una absorción de triptófano mejorada, explicando así la mayor tolerancia a frío conferida por la sobreexpresión de CRIO4 en levadura. El estudio de localización subcelular ha mostrado que CRIO4 está asociada a la membrana plasmática y en membranas intracelulares, formando parte de vesículas, lo que parece confirmar el papel de CRIO4 en el tráfico intracelular, función que compartiría con sus ortólogos. El patrón de expresión de CRIO4 en remolacha ha mostrado que CRIO4 se expresa en todos los tejidos analizados, concentrándose su mayor expresión en hoja y raíz. También se ha mostrado que la expresión de CRIO4 aumenta tras tiempos cortos de exposición a estrés por frío y estrés por calor. Se han realizado estudios fenotípicos de diferentes líneas mutantes en genes PATLs de Arabidopsis thaliana, obteniéndose una gran variabilidad en los resultados que podría ser debida a la redundancia funcional entre los miembros de esta familia multigénica. También se han realizado estudios fenotípicos de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen CRIO4. Estas líneas muestran una mejoría en su crecimiento y desarrollo a temperaturas bajas, aumentando por tanto su tolerancia al estrés por frío. Además, la expresión de CRIO4, en las líneas transgénicas de A. thaliana, aumenta considerablemente tras el estrés por frío y tras un choque térmico, observándose en este último caso, acúmulos de CRIO4 a lo largo de toda la célula. El reciclaje intracelular de PIN2, indicador de la respuesta gravitrópica, se ve afectado por la disminución de la temperatura. Los resultados obtenidos en esta tesis parecen indicar que la sobreexpresión de CRIO4 reactiva el transporte intracelular de PIN2 bajo estrés por frío, lo que implicaría que su fenotipo está relacionado con el tráfico de auxinas. / [CAT] El fred és un dels estressos abiòtics més importants, afecta severament al creixement i desenvolupament de les plantes, i limita la seua distribució geogràfica. Ja que l'estrès per fred, per salinitat i per sequera solapen alguns dels seus mecanismes moleculars de resposta, es va usar una biblioteca d'ADNc de remolatxa (Beta vulgaris) generada amb fulles de plantes sotmeses a estrès salí, per tractar d'identificar gens de tolerància a estrès per fred mitjançant la seua sobreexpressió en llevat. D'aquesta manera es va identificar, entre d'altres, el gen CRIO4 la caracterització del qual ha estat el treball d'aquesta tesi. CRIO4 codifica una proteïna tipus Sec14, i és ortòleg a la família PATL d'Arabidopsis thaliana i té un domini conservat amb SEC14 i la família SFH de llevat. La sobreexpressió de CRIO4 confereix a les cèl·lules de llevat la capacitat de créixer a temperatures baixes i tolerància a tunicamicina (inhibidor de la glicosilació de proteïnes). L'anàlisi in silico de la seqüència de CRIO4 confirma diversos motius i dominis conservats en la proteïna que semblen dirigir la seua funció cap al tràfic vesicular, i revelen múltiples potencials llocs de fosforilació en CRIO4 suggerint una possible funció en senyalització. El domini Sec14 és un domini d'unió i transferència de fosfolípids i els resultats obtinguts indiquen que CRIO4 estableix unió amb fosfatidiolinositol i fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la funció de Sec14p de llevat, i això podria ser a causa de la falta d'afinitat de CRIO4 per fosfatidilcolina. En llevat, el transport de triptòfan és el major factor limitant per al creixement a temperatures baixes. Els resultats de l'assaig de coexpressió de CRIO4 amb TAT2 (una permeasa d'alta afinitat per triptòfan) en llevat mostrats en aquesta tesi, semblen indicar una estimulació del transport de Tat2p cap a la membrana plasmàtica per part de CRIO4, que podria esdevindre en una absorció de triptòfan millorada, explicant així la major tolerància a fred conferida per la sobreexpressió de CRIO4 en llevat. L'estudi de localització subcel·lular ha mostrat que CRIO4 està associada a la membrana plasmàtica i en membranes intracel·lulars, formant part de vesícules, la qual cosa sembla confirmar el paper de CRIO4 en el tràfic intracel·lular, funció que compartiria amb els seus homòlegs. El patró d'expressió de CRIO4 en remolatxa ha mostrat que CRIO4 s'expressa en tots els teixits analitzats, concentrant-se la seua major expressió en fulla i arrel. També s'ha mostrat que l'expressió de CRIO4 augmenta després de temps curts d'exposició a estrès per fred i estrès per calor. S'han realitzat estudis fenotípics de diferents línies mutants en gens PATLs d'Arabidopsis thaliana, obtenint-se una gran variabilitat en els resultats que podria ser deguda a la redundància funcional entre els membres d'aquesta família multigènica. També s'han realitzat estudis fenotípics de línies transgèniques d'Arabidopsis thaliana que sobreexpressen el gen CRIO4. Aquestes línies mostren una millora en el seu creixement i desenvolupament a temperatures baixes, augmentant per tant la seua tolerància a l'estrès per fred. A més, l'expressió de CRIO4, en les línies transgèniques d'A. thaliana, augmenta considerablement després de l'estrès per fred i després d'un xoc tèrmic, observant-se en aquest últim cas, cúmuls de CRIO4 al llarg de tota la cèl·lula. El reciclatge intracel·lular de PIN2, indicador de la resposta gravitrópica, es veu afectat per la disminució de la temperatura. Els resultats obtinguts en aquesta tesi semblen indicar que la sobreexpressió de CRIO4 reactiva el transport intracel·lular de PIN2 sota estrès per fred, la qual cosa implicaria que el seu fenotip està relacionat amb el tràfic d'auxines. / Izquierdo García, AC. (2016). Caracterización del gen CRIO4 y su implicación en tolerancia a estrés por frío [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62826 / TESIS
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Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales

Sani, Daniele 05 December 2013 (has links)
En esta Tesis Doctoral se propone una alternativa a la coyuntura actual de rechazo social frente al uso de OMGs en la industria agroalimentaria, mediante la demostración y el desarrollo de un nuevo concepto sobre el uso de las técnicas de biología molecular en la obtención de levaduras modificadas genéticamente, el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular. La idea básica de este nuevo concepto es simple y se basa en imitar a la propia naturaleza en su constante evolución, pero acelerando y dirigiendo el proceso evolutivo con el objeto de seleccionar en un corto periodo de tiempo aquellos cambios genéticos que específicamente hayamos diseñado a escala molecular. Las levaduras no son una entidad invariable en el tiempo, al contrario, como todos los organismos vivos evolucionan con el tiempo. Mediante esta nueva metodología que hemos desarrollado, se consigue acelerar el proceso evolutivo, pues las modificaciones genéticas que hemos introducido se podrían haber efectuado espontáneamente por la levadura en su entorno natural como consecuencia de procesos de recombinación, duplicación o eliminación de elementos genéticos a lo largo de su ciclo reproductivo, aunque indudablemente se habrían perdido sin la presencia de determinadas condiciones de selección y, dada la baja probabilidad de que esos eventos ocurrieran, habrían necesitado de un inmenso periodo de tiempo. Se ha demostrado el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, mediante la construcción e integración cromosómica de un casete de selección basado en la sobreexpresión del gen YAP1, que da origen a un marcador dominante que confiere resistencia a diversos compuestos tóxicos para las levaduras, tales como cicloheximida y cerulenina. Para el desarrollo de dicho casete de selección nos hemos impuesto y respetado las siguientes condiciones: 1) Utilización de la capacidad de recombinación homóloga de las levaduras del género Saccharomyces; 2) Utilización de material genético procedente exclusivamente de la propia cepa de levadura a evolucionar; 3) El material genético no ha de sufrir ningún paso intermedio de clonaje o expresión en otros sistemas biológicos. Una vez cumplidas todas estas condiciones, las cepas resultantes no deberían responder a la definición oficial de organismos modificados genéticamente de la Unión Europea: ¿organismos en los que su material genético ha sido alterado de una manera que no sucede de forma natural mediante los procesos de reproducción sexual y/o recombinación natural¿. Para alcanzar el objetivo fundamental del proyecto, hemos trabajado inicialmente con un sistema modelo más sencillo, como es el caso de una cepa de una levadura de laboratorio, y a continuación hemos abordado la misma aproximación experimental pero trabajando con una levadura que se emplea en la producción industrial de cerveza tipo ¿lager¿. La metodología experimental que se ha diseñado ha consistido en obtener, sólo mediante reacciones de PCR, una construcción que, posteriormente a su inserción cromosómica mediante recombinación homóloga, pone al gen YAP1 bajo el control de un promotor fuerte de un gen de la ruta de la glicólisis, el promotor del gen PGK1. Se determinó si la sobreexpresión del gen YAP1 en la cepa cervecera evolucionada, era capaz de disminuir la aparición espontánea de mutantes deficientes en respiración (¿petites¿) durante la fermentación del mosto cervecero. La continuada reutilización industrial de la levadura cervecera está asociada con un incremento en la frecuencia de la aparición de ¿petites¿, con el consiguiente efecto negativo sobre el proceso fermentativo. Según los resultados obtenidos, la cepa evolucionada, presenta claramente una menor formación de ¿petites¿ durante su reutilización a lo largo de 10 microfermentaciones sucesivas, con respecto a la cepa parental. Una vez demostrada la viabilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, el paso siguiente consistió en la aplicación de dicha metodología al desarrollo de levaduras con características de interés industrial. Se han diseñado reorganizaciones cromosómicas sobre 3 tipos de levaduras industriales: a) Una levadura de producción de cerveza tipo¿ lager¿ evolucionada para dar lugar a una baja producción de diacetilo; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen ILV5 que codifica para una isomerorreductasa que convierte el ¿-acetolactato en ¿-ß-dihidroxivalerato. De esta forma, se evita la acumulación de ¿-acetolactato en la cerveza y se acorta sensiblemente el proceso de maduración al haberse reducido la producción de diacetilo. La cepa evolucionada consigue disminuir en más de 10 días con respecto a la cepa parental el tiempo necesario para que la concentración de diacetilo esté al nivel que la práctica industrial considera aceptable para dar por finalizado el proceso de ¿lagering¿. b) Una levadura en la que se ha aumentado notablemente su actividad pectinolítica, lo que presenta aplicaciones para su uso en el procesado industrial de material vegetal rico en pectina; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen PGU1 que codifica para una endopoligalacturonasa. Se obtuvieron dos nuevas variantes de la cepa parental, una conteniendo el casete de selección y otra en la que dicho casete se eliminó mediante un proceso denominado ¿pop out¿, permitiendo de esta forma la reutilización de dicho casete en sucesivos diseños de reordenación genómica sobre la misma cepa. Ambas variantes presentan un notable incremento de la actividad hidrolítica sobre la pectina sin perjuicio de su producción de etanol ni de su capacidad fermentativa. c) Una levadura vínica comercial que se ha evolucionado en busca de una mejor tolerancia frente a bajas temperaturas. Se ha intentado obtener el fenotipo deseado mediante inactivación del gen INP51 que codifica una enzima inositol polifosfato 5- fosfatasa, implicada en la homeostasis del inositol 4, 5-difosfato, cuya pérdida de función provoca la acumulación de dicho metabolito y, según se ha descrito en la literatura, un aumento de la tolerancia al frío. Se han obtenido nuevas cepas en las que se ha inactivado bien una copia del gen INP51 de la cepa industrial, bien ambas copias. Sin embargo, y contrariamente a lo descrito para la cepas de laboratorio, la inactivación del gen INP51 no aumenta la capacidad de crecimiento frente a bajas temperaturas de la cepa industrial evolucionada. Todos estos ejemplos de aplicación de la metodología desarrollada demuestran la utilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular en la mejora de las cepas de levaduras industriales del género Saccharomyces / Sani, D. (2013). Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34325 / TESIS
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Design of new hybrid nanomaterials with molecular gates as nanodevices for therapeutic applications

Mas Font, Nuria 30 March 2015 (has links)
La presente tesis doctoral, que lleva por título “Diseño de nuevos nanomateriales híbridos con puertas moleculares como nanodispositivos para aplicaciones terapéuticas” está centrada en el desarrollo de nuevos materiales funcionales híbridos orgánico-inorgánicos para aplicaciones de liberación controlada. Los dos capítulos de la presente tesis en los que se describen los resultados obtenidos (el segundo y el tercer capítulos) están directamente relacionados con el uso de las nanopartículas mesoporosas de sílice como matriz inorgánica en el desarrollo de nuevos materiales híbridos orgánico-inorgánicos para aplicaciones en liberación controlada. Aun así, los resultados se han dividido en dos capítulos, dependiendo del estímulo aplicado para la liberación de la molécula encapsulada. En uno de los capítulos, los diferentes materiales desarrollados se basan en nanodispositivos controlados enzimáticamente, mientras que en el otro capítulo es un cambio de pH o de fuerza electroestática (en los dos casos debido a la presencia de un microorganismo patógeno) el que causa la consecuente liberación de la carga. En el caso de los nanodispositivos controlados enzimáticamente, los cuales se describen en el Capítulo 2, se desarrollaron tres sólidos diferentes. El primer ejemplo se basó en el diseño, síntesis y caracterización de nanopartículas mesoporosas de sílice recubiertas con sales de azopiridinio, que se hidrolizan en presencia de esterasas y reductasas, las cuales se encuentran en la microflora del colon. Estas sales, que contienen un enlace azoico, se seleccionaron para una posible liberación selectiva en el colon. Los estudios de viabilidad celular e internalización se llevaron a cabo con células HeLa, así como los estudios de liberación del agente quimioterapéutico camptotecina. Un segundo ejemplo se centró en el diseño, síntesis, caracterización y aplicaciones de un nuevo nanodispositivo que responde a la presencia de proteasas para liberación controlada, empleando nanopartículas de sílice cubiertas con el polímero -poli-L-lisina. En este caso, se pretendía evaluar dos mecanismos diferentes de anclaje del polímero y los dos dieron resultados positivos, aunque presentaron diferentes perfiles de liberación en cada caso. También se realizaron estudios de viabilidad e internalización celular con este nuevo nanodispositivo, así como la liberación de camptotecina en células HeLa. Finalmente, el último nanodispositivo que responde a la acción de un enzima; incluye el diseño y aplicación de un “scaffold” 3D inteligente con puertas moleculares, el cual consiste en la combinación de nanopartículas mesoporosas de sílice con puertas y biomateriales porosos clásicos. En este caso, las nanopartículas mesoporosas de sílice se cubrieron con poliaminas y ATP. Estas nanopartículas se incorporaron durante la síntesis de un “scaffold” de gelatina, el cual se preparó mediante técnicas de prototipado rápido (RP). En presencia de fosfatasa ácida se induce la liberación del colorante encapsulado en los poros de las nanopartículas. La fosfatasa ácida se seleccionó como estímulo activador de este material diseñado, ya que es un enzima cuya concentración se emplea para evaluar la actividad de los osteoclastos en procesos de remodelación ósea y como marcador en metástasis de huesos. Estas propiedades abren posibilidades de uso de esta combinación en el diseño de materiales funcionales para la preparación de numerosos “scaffolds” avanzados con puertas moleculares, que puedan ayudar en aplicaciones de medicina regenerativa y terapias de cáncer de huesos. Con respecto al otro tipo de nanodispositivos, que se muestra en el Capítulo 3, se ha evaluado el posible uso de las nanopartículas mesoporosas de sílice con puertas moleculares como posibles vehículos para la liberación controlada de fármacos cuando un microorganismo patógeno está presente. En este caso, el diseño y desarrollo de nuevos materiales híbridos orgánico-inorgánicos se ha basado en el uso de nanopartículas mesoporosas de sílice como matriz inorgánica, cubiertas con entidades moleculares orgánicas que podrían responder a un cambio en el pH del ambiente o a un cambio en la fuerza electroestática, debido a la presencia de un microorganismo patógeno, tales como hongos o bacterias. Uno de estos nanodispositivos desarrollados demuestra las aplicaciones y propiedades antifúngicas de un soporte cargado con tebuconazol y cubierto con moléculas que actúan de puerta molecular dirigida mediante un cambio de pH. El otro material presenta aplicaciones antibacterianas contra bacterias gram-positivas y gram-negativas, ya que se utiliza un nanodispositivo cargado con vancomicina y funcionalizado con -poli-L-lisina. En los dos casos, se ha demostrado que el uso de la nanoformulación puede mejorar la efectividad del fármaco encapsulado, mejorando y ampliando el espectro de acción del mismo, lo cual abre un gran abanico de posibilidades en aplicaciones de estos nanodispositivos en el tratamiento de infecciones. En resumen, se puede concluir que en la presente tesis se han desarrollado nuevos sólidos híbridos orgánico-inorgánicos, así como se han descrito las aplicaciones de estos nanodisposotivos como sistemas de liberación controlada. Los resultados obtenidos podrían ser útiles en futuros diseños de materiales híbridos avanzados en biotecnología, biomedicina y, concretamente, en aplicaciones terapéuticas (como terapias contra el cáncer, tratamiento de infecciones, medicina regenerativa, etc.) / Mas Font, N. (2014). Design of new hybrid nanomaterials with molecular gates as nanodevices for therapeutic applications [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48491 / TESIS
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Estudio de los mecanismos de la regulación de la homeostasis iónica: Análisis fisiológico y transcriptómico del mutante hal4hal5 de Saccharomyces cerevisiae

Pérez Valle, Jorge 02 April 2009 (has links)
La homeostasis de la concentración celular de iones es una propiedad fundamental de las células vivas. Muchos parámetros fisiológicos importantes como el volumen celular, la turgencia, el pH intracelular, la fuerza iónica o la concentración interna de cationes dependen de la regulación de los sistemas de toma y salida de los principales cationes monovalentes: protones, sodio y potasio. El potasio, principal catión intracelular en plantas y muchos microorganismos, se retiene de forma activa, por lo que esta presente en el interior de las células a altas concentraciones, siendo el principal determinante de muchos de los parámetros fisiológicos anteriormente comentados. El umbral de toxicidad de otros cationes monovalentes como el sodio o el litio es mucho más bajo que el del potasio, por lo que se debe evitar su acumulación en el citoplasma para proteger enzimas esenciales y sensibles. Las células eucarióticas emplean el transporte activo primario, mediado por ATPasas de tipo P, y el transporte secundario, mediado por canales y cotransportadores, para mantener altas concentraciones de potasio, esencial para las células, y bajas concentraciones de sodio, que puede tener efectos tóxicos. En Saccharomyces cerevisiae el principal sistema de toma de potasio está codificado por los genes TRK1 y TRK2. El trabajo presentado se centra en el estudio de dos proteínas quinasas, Hal4 y Hal5. La sobre-expresión de los genes HAL4 y HAL5 mejora la tolerancia de las células de levadura a cationes tóxicos como el sodio o el litio, mientras que por el contrario, su disrupción produce hipersensibilidad a estos cationes. Se ha comprobado que estos efectos son dependientes del sistema de transporte de potasio Trk1-Trk2, y todo parece indicar que estas dos quinasas funcionan como activadores de este sistema, aumentando la entrada de potasio en las células, y por tanto, haciendo decrecer el potencial de membrana. Esta disminución del potencial de membrana también reduce la toma de cationes / Pérez Valle, J. (2009). Estudio de los mecanismos de la regulación de la homeostasis iónica: Análisis fisiológico y transcriptómico del mutante hal4hal5 de Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4329 / Palancia
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Identificación y caracterización de la familia de factores DBP, nuevos reguladores de la expresión génica en plantas

Castelló Llopis, María José 09 November 2009 (has links)
El factor de transcripción DBP1 de Nicotiana tabacum, es el primer miembro de una nueva familia de reguladores transcripcionales que poseen, además de capacidad de unión al ADN, actividad proteín-fosfatasa de tipo 2C. En este trabajo hemos abordado la caracterización funcional del factor regulador DBP1, determinando que su capacidad de unión al ADN reside en el motivo DNC, el cual se localiza en la región N-terminal de la proteína y está conservado entre las proteínas DBP de diferentes plantas mono y dicotiledóneas. Así mismo hemos llevado a cabo una búsqueda de factores proteicos que interaccionan con DBP1. Así, la isoforma G de la proteína 14-3-3 se presenta como el primer interactor de DBP1, comprometiendo en dicha interacción una zona del dominio N-terminal adyacente al motivo DNC. Mediante expresión transitoria en N. benthamiana hemos podido comprobar que la isoforma G de la 14-3-3 es capaz de promover la exclusión nuclear de DBP1, modificando la distribución núcleo-citoplasma que presenta en condiciones basales y participando así de manera indirecta en la regulación de genes diana de DBP1 como CEVI1. De los cuatro homólogos estructurales de DBP1 identificados en A. thaliana, AtDBP1 es el representante estructuralmente más semejante a DBP1 de tabaco. AtDBP1 mantiene la capacidad de unirse al ADN así como la actividad fosfatasa 2C característica de esta familia, y es capaz de interaccionar a través de su región N-terminal con la proteína GRF6, homóloga a la 14-3-3 G de tabaco. Con el objetivo de identificar dianas de AtDBP1 tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional para así averiguar los procesos biológicos en los que están implicados estos factores, se ha realizado un análisis proteómico comparativo entre plantas Col-0 y mutantes atdbp1 que ha puesto de manifiesto una baja acumulación de una de las isoformas del factor de inicio de la traducción 4E, eIF(iso)4E, en el mutante atdbp1. / Castelló Llopis, MJ. (2008). Identificación y caracterización de la familia de factores DBP, nuevos reguladores de la expresión génica en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6363 / Palancia

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