En esta Tesis Doctoral se propone una alternativa a la coyuntura actual de rechazo
social frente al uso de OMGs en la industria agroalimentaria, mediante la demostración
y el desarrollo de un nuevo concepto sobre el uso de las técnicas de biología molecular
en la obtención de levaduras modificadas genéticamente, el concepto de Evolución
Genómica mediante Diseño Molecular. La idea básica de este nuevo concepto es simple
y se basa en imitar a la propia naturaleza en su constante evolución, pero acelerando y
dirigiendo el proceso evolutivo con el objeto de seleccionar en un corto periodo de
tiempo aquellos cambios genéticos que específicamente hayamos diseñado a escala
molecular. Las levaduras no son una entidad invariable en el tiempo, al contrario, como
todos los organismos vivos evolucionan con el tiempo. Mediante esta nueva
metodología que hemos desarrollado, se consigue acelerar el proceso evolutivo, pues las
modificaciones genéticas que hemos introducido se podrían haber efectuado
espontáneamente por la levadura en su entorno natural como consecuencia de procesos
de recombinación, duplicación o eliminación de elementos genéticos a lo largo de su
ciclo reproductivo, aunque indudablemente se habrían perdido sin la presencia de
determinadas condiciones de selección y, dada la baja probabilidad de que esos eventos
ocurrieran, habrían necesitado de un inmenso periodo de tiempo.
Se ha demostrado el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular,
mediante la construcción e integración cromosómica de un casete de selección basado
en la sobreexpresión del gen YAP1, que da origen a un marcador dominante que
confiere resistencia a diversos compuestos tóxicos para las levaduras, tales como
cicloheximida y cerulenina. Para el desarrollo de dicho casete de selección nos hemos
impuesto y respetado las siguientes condiciones:
1) Utilización de la capacidad de recombinación homóloga de las levaduras del género
Saccharomyces;
2) Utilización de material genético procedente exclusivamente de la propia cepa de
levadura a evolucionar;
3) El material genético no ha de sufrir ningún paso intermedio de clonaje o expresión en
otros sistemas biológicos.
Una vez cumplidas todas estas condiciones, las cepas resultantes no deberían responder
a la definición oficial de organismos modificados genéticamente de la Unión Europea:
¿organismos en los que su material genético ha sido alterado de una manera que no
sucede de forma natural mediante los procesos de reproducción sexual y/o recombinación natural¿. Para alcanzar el objetivo fundamental del proyecto, hemos
trabajado inicialmente con un sistema modelo más sencillo, como es el caso de una cepa
de una levadura de laboratorio, y a continuación hemos abordado la misma
aproximación experimental pero trabajando con una levadura que se emplea en la
producción industrial de cerveza tipo ¿lager¿. La metodología experimental que se ha
diseñado ha consistido en obtener, sólo mediante reacciones de PCR, una construcción
que, posteriormente a su inserción cromosómica mediante recombinación homóloga,
pone al gen YAP1 bajo el control de un promotor fuerte de un gen de la ruta de la
glicólisis, el promotor del gen PGK1. Se determinó si la sobreexpresión del gen YAP1
en la cepa cervecera evolucionada, era capaz de disminuir la aparición espontánea de
mutantes deficientes en respiración (¿petites¿) durante la fermentación del mosto
cervecero. La continuada reutilización industrial de la levadura cervecera está asociada
con un incremento en la frecuencia de la aparición de ¿petites¿, con el consiguiente
efecto negativo sobre el proceso fermentativo. Según los resultados obtenidos, la cepa
evolucionada, presenta claramente una menor formación de ¿petites¿ durante su
reutilización a lo largo de 10 microfermentaciones sucesivas, con respecto a la cepa
parental.
Una vez demostrada la viabilidad del concepto de Evolución Genómica mediante
Diseño Molecular, el paso siguiente consistió en la aplicación de dicha metodología al
desarrollo de levaduras con características de interés industrial. Se han diseñado
reorganizaciones cromosómicas sobre 3 tipos de levaduras industriales:
a) Una levadura de producción de cerveza tipo¿ lager¿ evolucionada para dar lugar a
una baja producción de diacetilo; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido
mediante la sobreexpresión del gen ILV5 que codifica para una isomerorreductasa que
convierte el ¿-acetolactato en ¿-ß-dihidroxivalerato. De esta forma, se evita la
acumulación de ¿-acetolactato en la cerveza y se acorta sensiblemente el proceso de
maduración al haberse reducido la producción de diacetilo. La cepa evolucionada
consigue disminuir en más de 10 días con respecto a la cepa parental el tiempo
necesario para que la concentración de diacetilo esté al nivel que la práctica industrial
considera aceptable para dar por finalizado el proceso de ¿lagering¿.
b) Una levadura en la que se ha aumentado notablemente su actividad pectinolítica, lo
que presenta aplicaciones para su uso en el procesado industrial de material vegetal rico
en pectina; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión
del gen PGU1 que codifica para una endopoligalacturonasa. Se obtuvieron dos nuevas variantes de la cepa parental, una conteniendo el casete de selección y otra en la que
dicho casete se eliminó mediante un proceso denominado ¿pop out¿, permitiendo de
esta forma la reutilización de dicho casete en sucesivos diseños de reordenación
genómica sobre la misma cepa. Ambas variantes presentan un notable incremento de la
actividad hidrolítica sobre la pectina sin perjuicio de su producción de etanol ni de su
capacidad fermentativa.
c) Una levadura vínica comercial que se ha evolucionado en busca de una mejor
tolerancia frente a bajas temperaturas. Se ha intentado obtener el fenotipo deseado
mediante inactivación del gen INP51 que codifica una enzima inositol polifosfato 5-
fosfatasa, implicada en la homeostasis del inositol 4, 5-difosfato, cuya pérdida de
función provoca la acumulación de dicho metabolito y, según se ha descrito en la
literatura, un aumento de la tolerancia al frío.
Se han obtenido nuevas cepas en las que se ha inactivado bien una copia del gen INP51
de la cepa industrial, bien ambas copias. Sin embargo, y contrariamente a lo descrito
para la cepas de laboratorio, la inactivación del gen INP51 no aumenta la capacidad de
crecimiento frente a bajas temperaturas de la cepa industrial evolucionada.
Todos estos ejemplos de aplicación de la metodología desarrollada demuestran la
utilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular en la mejora
de las cepas de levaduras industriales del género Saccharomyces / Sani, D. (2013). Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34325 / TESIS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/34325 |
| Date | 05 December 2013 |
| Creators | Sani, Daniele |
| Contributors | Navarro Marzal, Alfonso Luis, Serrano Salom, Ramón, Universitat Politècnica de València. Instituto Universitario de Ingeniería de Alimentos para el Desarrollo - Institut Universitari d'Enginyeria d'Aliments per al Desenvolupament |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Source | Riunet |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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