Los fenilpropanoides constituyen un grupo de metabolitos secundarios producidos y utilizados por las plantas como parte de la respuesta defensiva tanto constitutiva como inducible. Un gran número de ellos están implicados en la resistencia frente a la enfermedad a diferentes niveles: señalización (ácido salicílico), agentes antimicrobianos (fitoalexinas), y endurecimiento de la pared celular (lignina). Las amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, que desempeñan un importante papel en la defensa de las plantas frente a patógenos y predadores. Las HCAAs se forman a partir de la condensación de tioésteres de hidroxicinamoil-CoA con feniletilaminas, tales como la tiramina. El último paso en la biosíntesis de las HCAAs está catalizado por el enzima tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). En la presente tesis se muestra la identificación y el estudio de cuatro HCAAs, p-cumaroildopamina, feruloildopamina, p-cumaroiltiramina y feruloiltiramina, asociadas a la infección de tomate con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Su identificación y caracterización estructural se han llevado a cabo mediante técnicas de cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas (HPLC-MS). Se ha analizado la posible implicación del ácido salicílico y del etileno en la inducción patogénica de dichas moléculas y del enzima responsable de su biosíntesis (THT). Además, se ha estudiado la actividad antioxidante y antibacteriana in vitro de las cuatro HCAAs identificadas. Por último, se han obtenido líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana y de tomate que sobreexpresan el gen de la THT, y se han analizado los perfiles cromatográficos de dichas líneas. / Zacarés Sanmartín, L. (2008). Nuevas aportaciones al metabolismo secundario del tomate. Identificación y estudio de moléculas implicadas en la respuesta a la infección con pseudomonas syrinagae pv. tomato [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3021 / Palancia

Las levaduras del género Saccharomyces se encuentran entre los primeros microorganismos que fueron explotados por el hombre. Su habilidad para transformar diferentes azúcares en etanol y CO2, ha sido utilizada en la producción de bebidas alcohólicas y en la elaboración de alimentos como el pan, constituyendo así uno de los primeros ejemplos de la aplicación biotecnológica de un microorganismo. En los últimos años la levadura se ha revelado como el microorganismo eucariótico más útil para estudios biológicos y para la los nuevos desarrollos en el campo de la Biotecnología. Las razones que justifican el uso continuado de cepas industriales de S. cerevisiae son su habilidad para transformar eficazmente azúcares en etanol, dióxido de carbono y numerosos metabolitos secundarios que dan lugar al sabor y aroma característico de cada producto y su capacidad para soportar el estrés causado principalmente por la temperatura, la presión osmótica, la presión hidrostática, alta densidad celular, el etanol y la competición con bacterias y otras levaduras silvestres. No obstante, se puede mejorar su tolerancia al estrés consiguiendo así beneficios potenciales en los procesos de producción de alimentos y bebidas alcohólicas. La fermentación a bajas temperaturas resulta clave en los procesos de elaboración de determinadas bebidas alcohólicas con características organolépticas que se ajusten a los perfiles de calidad sensorial y de preferencia del consumidor. La respuesta celular que se desencadena tras someter las células a bajas temperaturas no está bien caracterizada, pues aunque se sabe que tiene como consecuencia la síntesis de una serie de proteínas, éstas no están conservadas en un rango amplio de organismos. El objetivo de la presente Tesis es la identificación y caracterización de aquellos genes que por un aumento de su expresión, confieran una mayor capacidad de crecimiento a temperaturas bajas en cepas de S. cerevisiae. Así, demostramos que los efectos del frío se v / Vicent González, IE. (2009). Aislamiento e identificación de genes de saccharomyces cerevisiae implicados en la tolerancia a frío [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4504 / Palancia

Tesis por compendio / [ES] La longevidad de las semillas, o el tiempo durante el cual permanecen las semillas viables, es de gran importancia para la conservación de la biodiversidad, la agricultura y la economía. Además, el estudio de este parámetro puede contribuir a conocer mejor los mecanismos moleculares comunes a todos los organismos para prevenir el envejecimiento. Una de las principales estrategias de las semillas para ralentizar su envejecimiento consiste en detener su metabolismo, a través de su deshidratación. Otros mecanismos moleculares para evitar daños son el aislamiento frente al entorno a través de la cubierta de la semilla, y la producción de antioxidantes y otras moléculas para evitar el daño oxidativo, uno de los principales causantes del envejecimiento de las semillas. Los mecanismos de reparación mitigan parte del daño acumulado. El organismo modelo de plantas Arabidopsis thaliana brinda la oportunidad de la realización de estudios genómicos para el estudio de, en este caso, la longevidad de las semillas para descubrir nuevos factores genéticos y mecanismos moleculares determinantes. Este conocimiento servirá para entender mejor los procesos de deterioro de las semillas y que también será clave para aumentar la longevidad de estas. Mediante el uso de variedades naturales genotipadas de Arabidopsis thaliana y un estudio de asociación del genoma conocido como GWAS, seguido de estudios de genética reversa, se han identificado 12 nuevos genes relacionados con la longevidad de las semillas, relacionados con la protección del embrión, el control del daño oxidativo, y la permeabilidad de la cubierta de la semilla. El desarrollo de la cubierta de la semilla está determinado por factores de transcripción. Plantas mutantes en diversos factores de transcripción involucrados en el desarrollo de la cubierta de la semilla presentan una longevidad alterada. La sobreexpresión de los factores de transcripción AtHB25 y COG1 provoca que las semillas presenten una mayor longevidad debido a una incrementada deposición de poliésteres lipídicos. Estas barreras de poliésteres lipídicos son la cutícula, formada por cutina, y la suberina. Ambas participan positivamente en la protección del embrión frente al ambiente exterior. Estudios genómicos de ambos factores de transcripción han demostrado que AtHB25 regula directamente a enzimas biosintéticos de los monómeros de suberina y cutina, y COG1 regula la expresión de enzimas relacionados con la polimerización de poliésteres lipídicos y lignina. La regulación en la que participa AtHB25 es muy importante debido a la alta conservación de las secuencias genómicas y funciones de AtHB25 en angiospermas, y parece involucrado en la respuesta a bajas temperaturas. Por otra parte, COG1, que está involucrado en la percepción de luz, regula parte del desarrollo del tegumento externo a través de la regulación de AP2, un factor clave en el establecimiento de la identidad de tejido de este tegumento de la cubierta de la semilla, donde se localiza la suberina. AtHB25 y COG1 están involucrados en la adaptación de la longevidad de la semilla a través de señales ambientales como la temperatura y la luz, respectivamente, regulando la deposición de poliésteres lipídicos. / [CAT] La longevitat de les llavors, o el temps que romanen les llavors viables, es de gran importància per la conservació de la biodiversitat, l'agricultura i l'economia. A més a més, l'estudi d'aquest paràmetre pot contribuir a conèixer millor els mecanismes moleculars comuns a tots els organismes per prevenir l'envelliment. Una de les principals estratègies de les llavor per retardar el seu envelliment consisteix detenir el seu metabolisme, mitjançant la seua deshidratació. Altres mecanismes moleculars per evitar danys son el seu aïllament de l'entorn per mitjan de la coberta de la llavor, i la producció d'antioxidants i altres molècules per evitar el dany oxidatiu, un dels principal causants del envelliment de les llavors. Els mecanismes de reparació mitiguen part del dany acumulat. L'organisme model Arabidopsis thaliana brinda la oportunitat de la realització d'estudis genòmics per a l'estudi de, en aquest cas, la longevitat de les llavors per descobrir nous factors genètics y mecanismes moleculars determinants. Aquest coneixement servirà per entendre millor els processos de deteriorament de les llavor i serà clau per augmentar la longevitat d'aquestes. Mitjançant l'ús de varietats naturals genotipades d'Arabidopsis thaliana i un estudi d'associació del genoma conegut com GWAS, seguits d'estudis de genètica inversa, s'han identificat 12 nous gens relacionats amb la longevitat de les llavors, relacionats amb la protecció de l'embrió, el control del dany oxidatiu, y la permeabilitat de la coberta de la llavor. El desenvolupament de la coberta de la llavor està determinada per factors de transcripció. Plantes mutants a diversos factors de transcripció involucrats al desenvolupament de la coberta de les llavors presenten una longevitat alterada. La sobreexpressió dels factors de transcripció AtHB25 i COG1 provoca que les llavors presenten una major longevitat degut a una deposició de polièsters lipídics incrementada. Aquestes barreres de polièsters lipídics son la cutícula, formada per cutina, i la suberina. Ambdues participen positivament la protecció de l'embrió enfront de l'entorn exterior. Estudis genòmics d'ambdós factors de transcripció han demostrat que AtHB25 directament regula a enzims biosintètics dels monòmers de suberina i cutina i COG1 regula enzims relacionats amb la polimerització de polièsters lipídics i lignines. La regulació en la que participa AtHB25 es molt important degut a l'alta conservació de les seqüències genòmiques i funcions de AtHB25 en angiospermes, i parteix estar involucrat en la resposta a baixes temperatures. Per altra banda, COG1, que està involucrat en la percepció de la llum, regula part del desenvolupament del integument extern mitjançant la regulació de AP2, un factor clau en l'establiment de la identitat de teixit de aquest integument de la coberta de la llavor, on es localitza la suberina. AtHB25 i COG1 estan involucrats en l'adaptació de la longevitat de la llavor per mitjan de senyals ambientals com la temperatura i la llum, respectivament, regulant la deposició de polièsters lipídics. / [EN] Seed longevity, or period that seeds remain viable, is important for biodiversity conservation, agriculture and economy. In addition, the study of this parameter could ease the knowledge about molecular mechanisms common to all organisms to prevent aging. One of the main strategies of seeds to reduce their aging consists to stop their metabolism, through drying. Other molecular mechanisms to avoid damages are the isolation from the environment with the seed coat, and the production of antioxidants and other molecules to avoid oxidative damage, one of the main seed aging causes. Repair mechanisms relieve part of the accumulated damage. The model plant Arabidopsis thaliana provides the opportunity to carry out genomic studies for the research of, in this case, seed longevity to discover determinant genetic factors and molecular mechanisms. This will serve to better understand seed deterioration processes and it will be key to increase seed longevity. Using natural genotyped varieties of Arabidopsis thaliana and a genome-wide association study (GWAS) followed by reverse genetic studies, 12 new genes related to seed longevity have been identified. They are related to embryo protection, oxidative damage control, and seed coat permeability. Seed coat development is determined by transcription factors. Mutant plants in some transcription factors involved in the seed coat development present altered seed longevity. The over-expression of the transcription factors AtHB25 and COG1 resulted in seeds with increased longevity due to an increased lipid polyester deposition. These lipid polyesters barriers are the cuticle, formed by cutin, and the suberin layer. Both participate positively in the embryo protection from the external environment. Genomic studies of both transcription factors have revealed that AtHB25 directly regulates biosynthetic enzymes of suberin and cutin monomers, and COG1 regulates the expression of enzymes related to the polymerization of lipid polyesters and lignin. The regulation involving AtHB25 is crucial due to the high conservation of genomic sequences and functions of AtHB25 in angiosperms, and it seems to be involved in the response to low temperatures. On the other hand, COG1, which is involved in light perception, regulates part of the development of the external integument through its regulation by AP2, a key factor in establishing the tissue identity of this seed coat integument, where suberin is located. AtHB25 and COG1 are involved in seed longevity adaptation through environmental signals such as temperature and light, respectively, regulating lipid polyesters deposition. / Agradezco a las instituciones públicas la inversión en investigación. Gracias a ella, los laboratorios, el personal y los distintos equipos se han podido financiar. Gaetano fue quien me ayudó enormemente conseguir la beca FPI del Ministerio de Economía y Competitividad BES-2015-072096, asociada al proyecto de investigación nacional BIO2014-52621-R-AR / Renard Meseguer, J. (2021). Identification of genes related to seed longevity in Arabidopsis thaliana using genomic molecular techniques [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/170554 / TESIS / Compendio

[ES] El crecimiento de las plantas se ve afectado por el estrés abiótico, sequía, salinidad o altas temperaturas. La transducción de señales de estrés abiótico es fundamental para generar una respuesta fisiológica adecuada, que implica la participación de diferentes hormonas vegetales, siendo el ácido abscísico (ABA) el regulador hormonal crítico en la regulación de la respuesta de la planta a situaciones de estrés por déficit hídrico. La vía de señalización de ABA y los componentes principales están bien caracterizados molecular y bioquímicamente. Los receptores de ABA "Pyrabactin Resistance 1"(PYR)/"PYR1-LIKE" (PYL)/ "Regulatory Component of ABA Receptor" (RCAR) juegan un papel importante en la regulación cuantitativa de la señalización ABA tanto en semillas como en tejidos vegetativos. Aunque la función bioquímica de los receptores PYR/PYL/RCARs de ABA, está bien caracterizada, se conoce poco sobre otros aspectos con relevancia biológica, como sus modificaciones postraduccionales o la regulación de su vida media. Uno de los avances recientes en este campo ha sido el descubrimiento de una nueva familia de E3 ligasas llamadas RSL1/RFAs ("RING-finger-ABA-related") que consta de al menos 10 miembros, reguladores clave de la estabilidad de los receptores PYR/PYL/RCAR de ABA en tejidos de raíces y hojas, regulando su degradación en diferentes ubicaciones celulares. Un estudio detallado de esta familia génica reveló que RSL1/RFA se caracterizan estructuralmente por la presencia de tres dominios RING putativos en tándem, denominados "RING1-IN BETWEEN RING-RING2" (RBR), y en consecuencia pertenecen a la familia de E3 ligasas de tipo RBR. Cinco miembros de la familia RSL1/RFA, RSL1 y RFA6-RFA9, contienen un dominio TM en el extremo C-terminal, lo que sugiere que RFA6-RFA9 también se localizan en la membrana plasmática. Sin embargo, otros miembros de las E3 ligasas como RFA1-RFA5 carecen del dominio TM C-terminal y su caracterización funcional, así como su ubicación celular, aún no se conocen. Nosotros mostramos que la E3 ligasa RFA1 se localiza en núcleo y citosol, mientras que RFA4 muestra una localización específica en el núcleo promoviendo la degradación nuclear de los receptores ABA. Por lo tanto, los miembros de la familia RSL1/RFA interactúan con los receptores ABA en la membrana plasmática, el citosol y el núcleo, dirigiéndolos a su degradación a través de la vía endosomal/vacuolar (en el caso de RSL1) o el proteosoma 26S (para RFA1 y RFA4). Proporcionamos información sobre la función fisiológica de estas E3 ligasas de tipo RBR. Realizando tanto mutagénesis como ensayos bioquímicos para identificar la cisteína 361 (Cys361) en RFA4 como la Cys del sitio activo, que es una característica distintiva de las E3 ligasas de tipo RBR. Demostramos mediante análisis de inmunotransferencia del mutante con pérdida de función de rfa1rfa4 que los niveles endógenos de los receptores de ABA PYR1 y PYL4 aumentan en comparación con las plantas de tipo silvestre. Hemos identificado una enzima E2, "Ubiquitin Conjugating Enzyme 26" (UBC26), como la enzima nuclear canónica E2 que interactúa con la E3 ligasa RFA4 y forma complejos UBC26-RFA4-Receptor, formando agregados nucleares. Generamos alelos ubc26 con pérdida de función que mostraban una mayor sensibilidad a ABA y acumulación de receptores ABA en comparación con el tipo silvestre. En definitiva, hemos revelado un sofisticado sistema de ubiquitinación de receptores ABA en diferentes ubicaciones subcelulares llevado a cabo a través de la familia de E3 ligasas RSL1/RFA de tipo RBR. Por otro lado, hemos iniciado pruebas bioquímicas para identificar la S-acilación en el dominio TM de RSL1. Generando RSL1C334S, RSL1 C5S y RSL1C6S mediante mutagénesis y RSL1ΔTM que presenta una delección del dominio TM. Los estudios iniciales han demostrado que los residuos de Cys cercanos al dominio TM están S-acilados. Finalmente, generamos nu / [CA] El creixement de les plantes es pot veure afectat per l'estrès abiòtic, sequera, salinitat o altes temperatures. La transducció de senyals d'estrès abiòtic és fonamental per a generar una resposta fisiològica adequada, que implica la participació de diferents hormones vegetals, sent l'àcid abscísic (ABA) el regulador hormonal crític en la regulació de la resposta de la planta a situacions d'estrès per dèficit hídric. La ruta de senyalització d'ABA i els components principals de la ruta estan ben caracteritzats molecularment i bioquímica. Els receptors "Pyrabactin Resistance 1"(PYR)/"PYR1-LIKE"(PYL)/"Regulatory Component of ABA Receptor" (RCAR) exerceixen un paper important en la regulació quantitativa en resposta a l'estrès tant en llavors com en planta. Encara que la funció bioquímica dels receptors PYR/PYL/RCARs d'ABA, està ben caracteritzada en els últims anys, es coneix poc sobre altres aspectes amb rellevància biològica, com les seues modificacions postraduccionals o la regulació de la seua vida mitjana. Un dels avanços recents en aquest camp ha sigut el descobriment d'una nova família d'E3 ligases anomenades RSL1/RFAs ("RING-finger-ABA-related") que consta d'almenys 10 membres, que són reguladors clau de l'estabilitat dels receptors PYR/PYL/RCAR d'ABA en teixits d'arrels i fulles, regulant la seua degradació en diferents ubicacions cel·lulars. Un estudi més detallat d'aquesta família gènica va revelar que RSL1/RFAs es caracteritzen estructuralment per la presència de tres dominis RING putatius en tàndem, denominats "RING1-IN BETWEEN RING-RING2" (RBR), i en conseqüència pertanyen a la família d'E3 ligases de tipus RBR. Cinc membres de la família RSL1/RFA, RSL1 i RFA6-RFA9, contenen un domini TM en l'extrem C-terminal, la qual cosa suggereix que RFA6-RFA9 també es localitzen en la membrana plasmàtica. No obstant això, altres membres d'aquesta família d'E3 ligases com RFA1-RFA5 manquen del domini TM C-terminal i la seua caracterització funcional, així com la seua ubicació cel·lular, encara no ha sigut investigada. Vam mostrar que l'E3 ligasa RFA1 es localitza tant en el nucli com en el citosol, mentre que RFA4 mostra una localització específica en el nucli promovent la degradació nuclear dels receptors ABA. Per tant, els membres de la família RSL1/RFA interactuen amb els receptors ABA en la membrana plasmàtica, el citosol i el nucli, dirigint-los a la seua degradació a través de la vía endosomal/vacuolar (en el cas de RSL1) o el proteosoma 26S (per a RFA1 i RFA4). Proporcionem informació sobre la funció fisiològica d'aquestes E3 ligases de tipus RBR. Realitzant tant mutagènesis com a assajos bioquímics per a identificar la cisteïna 361 (Cys361) en RFA4 com la Cys del lloc actiu, que és una característica distintiva de les E3 ligases de tipus RBR. Hem demostrat mitjançant una anàlisi d'immuno-transferència del mutant amb pèrdua de funció de rfa1rfa4 que els nivells endògens dels receptors d'ABA PYR1 i PYL4 augmenten en comparació amb les plantes de tipus silvestre. D'altra banda, hem identificat un enzim E2, "Ubiquitin Conjugating Enzyme 26" (UBC26), com l'enzim nuclear canònic E2 que interactua amb l'E3 ligasa RFA4 i forma complexos UBC26-RFA4-Receptor, formant agregats nuclears. També generem al·lels ubc26 amb pèrdua de funció que mostraven una major sensibilitat a ABA i acumulació de receptors ABA en comparació amb el tipus silvestre. En definitiva, hem revelat un sofisticat sistema d'ubiquitinació de receptors ABA en diferents ubicacions subcel·lulars dut a terme a través de la família d'E3 ligases RSL1/RFA de tipus RBR. Hem iniciat proves bioquímiques per a identificar la S-acilació en el domini TM de RSL1. Hem generat RSL1C334S, RSL1 C5S i RSL1C6S mitjançant mutagènesis, així com RSL1ΔTM que presenta una delecció del domini TM. Els estudis inicials han demostrat que els residus de Cys pròxims al domini TM estan S-acilados. Final / [EN] Plant growth is affected by abiotic stress, drought, salinity or high temperature. Signal transduction of abiotic stress is crucial to generate an appropriated physiological response, which involves the participation of different plant hormones, being abscisic acid (ABA) the critical hormonal regulator in regulating the plant's response to situations of stress due to water deficit. The ABA signaling pathway and the major components of the pathway are well characterized molecularly and biochemically. Pyrabactin Resistance 1 (PYR)/PYR1-LIKE (PYL)/Regulatory Component of ABA Receptor (RCAR) ABA receptors play an important role in quantitative regulation of ABA signaling both in seeds and vegetative tissues. Although the biochemical function of the PYR/PYL/RCAR ABA receptors has been well established in recent years, little is known about other aspects with biological relevance, such as their post-translational modifications or the regulation of their half-life. One of the recent advances in this field has been the discovery of a new family of E3 ligases called RSL1/RFAs (RING-finger-ABA-related) that consists of at least 10 members, which are key regulators of the stability of PYR/PYL/RCARs in root and leaf tissues, and regulate the degradation of ABA receptors at different cellular locations. Further inspection of the gene family revealed that RSL1/RFAs are structurally characterized by the presence of three putative RING domains in tandem, named as RING1-IN BETWEEN RING (IBR)-RING2, and accordingly they belong to the RBR-type E3 ligase family. Five members of the RSL1/RFA family, that is, RSL1 and RFA6-RFA9, contain a TM domain at the C-terminal end of the proteins, which suggests that RFA6-RFA9 are also localized in plasma membrane. However, other members of this family of E3 ligases such as RFA1-RFA5 lack the C-terminal TM domain and their functional characterization, as well as their cellular location, has not been investigated yet. In this study we show that the E3 ligase RFA1 is localized both in the nucleus and in the cytosol, while RFA4 shows a specific localization in the nucleus promoting the nuclear degradation of ABA receptors. Therefore, we members of the RSL1/RFA family interact with ABA receptors at the plasma membrane, cytosol and nucleus, targeting them for degradation via the endosomal/vacuolar pathway (in the case of RSL1) or the 26S- proteasome (for RFA1 and RFA4). We provide information on the physiological function of these RBR-type E3 ligases, which are hardly explored in plants. Additionally, we performed mutagenesis and biochemical assays to identify Cys361 in RFA4 as the active site cysteine, which is a distinctive feature of RBR-type E3 ligases. We have shown by immunoblot analysis of the rfa1rfa4 loss-of-function mutant that endogenous levels of ABA receptors PYR1 and PYL4 are increased compared to wild-type plants. On the other hand, we have identified an E2 enzyme, Ubiquitin Conjugating Enzyme 26 (UBC26), as the canonical nuclear enzyme E2 that interacts with the E3 ligase RFA4 and forms UBC26-RFA4-Receptor complexes, forming nuclear aggregates. We also generated loss-of function ubc26 alleles that exhibited higher sensitivity to ABA and accumulation of ABA receptors compared to wild type. We have revealed a sophisticated ubiquitination system of ABA receptors in different subcellular locations carried out through the RBR-type RSL1/RFA family of E3 ligases. We have proceeded with the biochemical and genetic study of the different members of the family. We have started biochemical tests to identify the S-acylation in the TM domain of RSL1. To this end, we have generated RSL1C334S, RSL1 C5S and RSL1C6S by mutagenesis as well as RSL1ΔTM, a deletion of the TM domain. Initial studies have shown that Cys residues close to the TM domain are S-acylated. Finally, we have also generated new combined mutants: rsl1rfa1, rsl1rfa5, rfa1rfa5 and rsl1rfa1rfa5. / Fernández López, MA. (2021). Regulación de la señalización del ABA mediante mecanismos que controlan vida media y actividad de los receptores PYR/PYL [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172364 / TESIS

[ES] Durante siglos de cultivo en la Península Ibérica después de su introducción en el siglo XVI, las judías se adaptaron a nuevos entornos, evolucionando numerosas variedades locales. Se evaluaron cultivares españoles locales de Phaseolus lunatus (frijol lima) y su resistencia a la salinidad, en dónde se expusieron las plantas a varios tratamientos de sal, con el fin de evaluar el efecto de la salinidad en el crecimiento y el rendimiento del cultivo. Se observó que el estrés salino redujo el peso fresco de los órganos aéreos, lo que permitió clasificar los cuatro genotipos según su tolerancia a la salinidad. la prolina aumentó en todos los cultivares, más notablemente en el cv. VPH-79, con las concentraciones absolutas más altas registradas en los cultivares más tolerantes a la sal. Estos hallazgos indican que P. lunatus es moderadamente tolerante a la sal y que sus principales mecanismos para adaptarse al estrés salino son el mantenimiento de altas concentraciones de K+ y la acumulación de prolina en las hojas. Por otra parte, se analizaron en invernadero 24 genotipos locales de P. vulgaris de España durante dos temporadas consecutivas. De cada genotipo, se cultivaron cinco plantas y se caracterizaron (17 rasgos cuantitativos y 15 cualitativos) utilizando los descriptores del IBPGR. Los resultados obtenidos indican una alta variabilidad para la mayoría de los rasgos, especialmente los relacionados con el rendimiento y sus componentes. Además, se analizaron las respuestas a los tratamientos por déficit hídrico y estrés salino, en cuanto a inhibición del crecimiento y contenido de prolina foliar (Pro), en 47 genotipos de Phaseolus vulgaris de diferentes orígenes. Para la mayoría de las variables de crecimiento analizadas y Pro, los efectos del cultivo, el tratamiento y sus interacciones fueron altamente significativos (p<0.001); los rasgos morfológicos de las raíces, el diámetro del tallo y el número de hojas se debieron principalmente a una variación incontrolada, mientras que la variación del peso fresco y el contenido de agua de los tallos y las hojas fue inducida claramente por el estrés. Bajo las condiciones experimentales, los efectos promedio del estrés salino sobre el crecimiento de las plantas fueron relativamente más débiles que los del déficit hídrico. . Pro, por su parte, fue la única variable que mostró una correlación negativa con todos los parámetros de crecimiento, pero particularmente con los de tallos y hojas mencionados anteriormente, como lo indican los coeficientes de correlación de Pearson y los PCA. Se propone el uso de Pro como un marcador bioquímico adecuado para exámenes simples, rápidos y a gran escala de genotipos de judía, para excluir los más sensibles, aquellos que acumulan concentraciones más altas de Pro en respuesta a tratamientos de estrés hídrico o salino. Asimismo, se han analizado las respuestas a la salinidad en seis cultivares de judía común: cuatro variedades locales de España y dos líneas experimentales de Cuba. La prolina fue usada para clasificar la tolerancia de los cultivares, Las concentraciones de azúcares solubles totales variaron con los tratamientos y entre los genotipos, pero fue difícil evaluar su papel en la tolerancia al estrés de las plantas analizadas. Los cambios en el contenido de malondialdehído (MDA) no indicaron peroxidación de la membrana inducida por sal como resultado del estrés oxidativo secundario; en consecuencia, no se detectó acumulación de compuestos fenólicos totales y flavonoides, como mecanismo de defensa antioxidante. Estos resultados destacan la confiabilidad del uso de prolina como marcador bioquímico del estrés salino en judía y la importancia del mecanismo relacionado con el transporte de potasio a las hojas para conferir tolerancia al estrés a algunos cultivares de judía. / [CA] Durant segles de cultiu a la Península Ibèrica després de la seva introducció en el segle XVI, les mongetes es van adaptar a nous entorns, evolucionant nombroses varietats locals. Es van avaluar conreessis espanyols locals de garrofó (fesol llima) i la seva resistència a la salinitat, a on es van exposar les plantes a diversos tractaments de sal, per tal d'avaluar l'efecte de la salinitat en el creixement i el rendiment de l'cultiu. Es va observar que l'estrès salí va reduir el pes fresc dels òrgans aeris, el que va permetre classificar els quatre genotips segons la seva tolerància a la salinitat. la prolina augmentar en tots els conreessis, més notablement en el cv. VPH-79, amb les concentracions absolutes més altes registrades en els conreessis més tolerants a la sal. Aquestes troballes indiquen que P. lunatus és moderadament tolerant a la sal i que els seus principals mecanismes per adaptar-se a l'estrès salí són el manteniment d'altes concentracions de K + i l'acumulació de prolina en les fulles. D'altra banda, es van analitzar en hivernacle 24 genotips locals de P. vulgaris d'Espanya durant dues temporades consecutives. De cada genotip, es van conrear cinc plantes i es van caracteritzar (17 trets quantitatius i 15 qualitatius) utilitzant els descriptors de l'IBPGR. Els resultats obtinguts indiquen una alta variabilitat per a la majoria dels trets, especialment els relacionats amb el rendiment i els seus components. A més, es van analitzar les respostes als tractaments per dèficit hídric i estrès salí, pel que fa a inhibició de l'creixement i contingut de prolina foliar (Pro), en 47 genotips de Phaseolus vulgaris de diferents orígens. Per a la majoria de les variables de creixement analitzades i Pro, els efectes de l'cultiu, el tractament i les seves interaccions van ser altament significatius (p <0.001); els trets morfològics de les arrels, el diàmetre de la tija i el nombre de fulls es van deure principalment a una variació incontrolada, mentre que la variació de l'pes fresc i el contingut d'aigua de les tiges i les fulles va ser induïda clarament per l'estrès. Sota les condicions experimentals, els efectes mitjana de l'estrès salí sobre el creixement de les plantes van ser relativament més febles que els de el dèficit hídric. . Pro, per la seva banda, va ser l'única variable que va mostrar una correlació negativa amb tots els paràmetres de creixement, però particularment amb els de tiges i fulles esmentats anteriorment, com ho indiquen els coeficients de correlació de Pearson i els PCA. Es proposa l'ús de Pro com un marcador bioquímic adequat per a exàmens simples, ràpids i a gran escala de genotips de mongeta, per excloure els més sensibles, aquells que acumulen concentracions més altes de Pro en resposta a tractaments d'estrès hídric o salí. Així mateix, s'han analitzat les respostes a la salinitat en sis conreessis de mongeta comú: quatre varietats locals d'Espanya i dues línies experimentals de Cuba. La prolina va ser usada per a classificar la tolerància dels conreessis, Les concentracions de sucres solubles totals van variar amb els tractaments i entre els genotips, però va ser difícil avaluar el seu paper en la tolerància a l'estrès de les plantes analitzades. Els canvis en el contingut de malondialdehid (MDA) no van indicar peroxidació de la membrana induïda per sal com a resultat de l'estrès oxidatiu secundari; en conseqüència, no es va detectar acumulació de compostos fenòlics totals i flavonoides, com a mecanisme de defensa antioxidant. Aquests resultats destaquen la fiabilitat de l'ús de prolina com a marcador bioquímic de l'estrès salí en jueva i la importància de l'mecanisme relacionat amb el transport de potassi a les fulles per conferir tolerància a l'estrès a alguns conreessis de mongeta. / [EN] During centuries of cultivation in the Iberian Peninsula after their introduction in the 16th century, beans adapted to new environments, evolving numerous landraces.In this study was also evaluated the resistance to salinity of several local Spanish cultivars of Phaseolus lunatus L. (lima bean). Plants were subjected to various salt treatments and growth and biochemical parameters were determined. It was observed that salt stress reduced the fresh weight of aerial organs, which allowed us to classify the four genotypes according to their tolerance to salinity. In addition, proline increased in all cultivars, most notably in cv. VPH-79, with the highest absolute concentrations recorded in the most salt tolerant cultivars. These findings indicate that P. lunatus is moderately salt tolerant and that its main mechanisms for adapting to salt stress are the maintenance of high K+ concentrations and proline accumulation in leaves. In studies conducted in this research project, 24 landraces of P. vulgaris from Spain were analyzed in greenhouses during two consecutive seasons. From each genotype, five plants were grown and characterized for 17 quantitative and 15 qualitative traits using IBPGR descriptors. . The results obtained indicate high variability for most of the traits, especially those related to yield and its components. On the other hand, this study analyzed the responses to water deficit and salt stress treatments, in terms of growth inhibition and leaf proline (Pro) content, in 47 Phaseolus vulgaris genotypes of different origins. For most of the growth variables analyzed and Pro, the effects of cultivar, treatment and their interactions were highly significant (p <0.001); root morphological traits, stem diameter and number of leaves were mainly due to uncontrolled variation, whereas variation in fresh weight and water content of stems and leaves was clearly induced by stress. Under our experimental conditions, the average effects of salt stress on plant growth were relatively weaker than those of water deficit. . Pro, in turn, was the only variable that showed a negative correlation with all growth parameters, but particularly with those of stems and leaves mentioned above, as indicated by Pearson's correlation coefficients and PCAs. We propose the use of Pro as a biochemical marker suitable for simple, rapid, large-scale screening of bean genotypes to exclude the most sensitive, those that accumulate higher concentrations of Pro in response to water or salt stress treatments. In addition, responses to salinity were analyzed in six common bean cultivars: four local varieties from Spain and two experimental lines from Cuba. Proline was used to rank the relative tolerance of the cultivars. Concentrations of total soluble sugars varied with treatments and among genotypes, but it was difficult to assess their role in stress tolerance of the plants tested.. Changes in malondialdehyde (MDA) content did not indicate salt-induced membrane peroxidation as a result of secondary oxidative stress; consequently, accumulation of total phenolic compounds and flavonoids, as an antioxidant defense mechanism, was not detected. These results highlight the reliability of the use of proline as a biochemical marker of salt stress in common beans and the importance of the mechanism related to potassium transport to leaves in conferring stress tolerance to some common bean cultivars. / Arteaga Castillo, SM. (2021). Cultivos para el cambio climático: selección y caracterización de variedades de judía (Phaseolusvulgaris L.) y Phaseolus lunatus tolerantes a la sequía y salinidad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/168450 / TESIS

[EN] Mutants able to germinate and perform early growth in medium containing a high NaCl concentration were identified and named salt resistant (sre). The sre mutants also were able to germinate in high-osmoticum medium, indicating that they are osmotolerant in a germination assay. Complementation analyses revealed that sre1-1 and sre1-2 were alleles of the abscisic acid (ABA) biosynthesis ABA2 gene. A map-based cloning strategy allowed the identification of the ABA2 gene and molecular characterization of the new aba2 alleles. The ABA2 gene product belongs to the family of short-chain dehydrogenases/reductases, which are known to be NAD- or NADP-dependent oxidoreductases. Recombinant ABA2 protein produced in Escherichia coli exhibits a Km value for xanthoxin of 19 µM and catalyzes in a NAD-dependent manner the conversion of xanthoxin to abscisic aldehyde, as determined by HPLC-mass spectrometry. The ABA2 mRNA is expressed constitutively in all plant organs examined and is not upregulated in response to osmotic stress. The results of this work are discussed in the context of previous genetic and biochemical evidence regarding ABA biosynthesis, confirming the xanthoxin-->abscisic aldehyde-->ABA transition as the last steps of the major ABA biosynthetic pathway. The abscisic aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product of A. thaliana catalyzes the final step in abscisic acid (ABA) biosynthesis. An aao3-1 mutant in a Landsberg erecta genetic background exhibited a wilty phenotype in rosette leaves, whereas seed dormancy was not affected (Seo et al., 2000a). Therefore, it was speculated that a different aldehyde oxidase would be the major contributor to ABA biosynthesis in seeds (Seo et al., 2000a). Through a screening based on germination under high-salt concentration, we isolated two mutants in a Columbia genetic background, initially named sre2-1 and sre2-2. Complementation tests with different ABA-deficient mutants indicated that sre2-1 and sre2- 2 mutants were allelic to aao3-1, and therefore they were renamed as aao3-2 and aao3-3, respectively. Indeed, molecular characterization of the aao3-2 mutant revealed a T-DNA insertional mutation that abolished the transcription of AAO3 gene, while sequence analysis of AAO3 in aao3-3 mutant revealed a deletion of three nucleotides and several missense mutations. Physiological characterization of aao3-2 and aao3-3 mutants revealed a wilty phenotype and osmotolerance in germination assays. In contrast to aao3-1, both aao3-2 and aao3-3 mutants showed a reduced dormancy. Accordingly, ABA levels were reduced in dry seeds and rosette leaves of both aao3-2 and aao3-3. Taken together, these results indicate that AAO3 gene product plays a major role in seed ABA biosynthesis. / [ES] El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona implicada en el control de procesos vegetales esenciales, principalmente el desarrollo de la semilla así como la respuesta de las plantas a diferentes estreses ambientales, particularmente frío, sequía y salinidad. En el presente trabajo se ha realizado la búsqueda en colecciones de Arabidopsis thaliana mutagenizadas con T-DNA de mutantes capaces de germinar en condiciones de alta sal (NaCl), identificándose tres loci mutantes, inicialmente denominados sre1, sre2 y sre3 (“salt resistant”). Los mutantes sre, además de su capacidad para germinar y establecer plántula en condiciones de estrés osmótico, mostraban una germinación resistente a paclobutrazol, latencia muy reducida, mayor transpiración y niveles de ABA en hojas de roseta significativamente menores que plantas silvestres. El análisis de complementación reveló que los mutantes sre1 eran alélicos al mutante aba2-1, los mutante sre2 eran alélicos al mutante aao3-1 y el mutante sre3 era alélico al mutante aba1-5. Así, el ABA bloquea la germinación y el establecimiento de la plántula en condiciones de bajo potencial hídrico, por lo que mutantes capaces de germinar en condiciones de estrés osmótico representan frecuentemente mutantes defectivos en la biosíntesis de ABA. Mediante una combinación de las estrategias de mapeo posicional y gen candidato se llevó a cabo la identificación del gen ABA2 y de las mutaciones sre1-1/aba2-11 y sre1- 2/aba2-12. El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena corta dependiente de NAD+ (SDR). La mutación sre1-1/aba2-11 es debida a una deleción de 53 pb que también supone un cambio en la pauta de lectura, generando un alelo nulo de ABA2. La mutación sre1-2/aba2-12 conduce a la sustitución Gly28Arg, afectando al sitio de unión del coenzima. Mediante un análisis HPLC-MS se ha demostrado que la proteína recombinante ABA2 cataliza la conversión de xantoxina en aldehído abscísico en una reacción dependiente de NAD+ . Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen inequívocamente que la conversión de xantoxina en aldehído abscísico representa el penúltimo paso de la ruta de biosíntesis de ABA y que este es catalizado por el producto génico del gen ABA2 (At1g52340). El último paso de la ruta de biosíntesis de ABA es la conversión de aldehído abscísico en ácido abscísico. Este paso está catalizado en Arabidopsis por el producto génico del gen AAO3. Los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutante aao3-1, muestran una reducción en los niveles de ABA en hojas de roseta y una mayor transpiración que las plantas silvestres. Además, y contrariamente el mutante aao3-1, muestran un fenotipo de osmotolerancia en germinación y establecimiento de plántula, germinación resistente a paclobutrazol, latencia reducida y poseen una reducción del 65% en los niveles de ABA en semillas. La caracterización molecular de la mutación sre2-1/aao3-2 revela una inserción de T-DNA que elimina la transcripción del gen AAO3, constituyendo por tanto un alelo nulo. La secuenciación del gen AAO3 en el mutante sre2-2/aao3-3 revela una deleción de tres nucleótidos y varias mutaciones de cambio de sentido. La evidencia genética y bioquímica resultante del análisis de los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aaao3-3 indica que lesiones en el gen AAO3 conducen a niveles reducidos de ABA y fenotipos característicos en semillas. Por consiguiente, queda demostrado que el gen AAO3 desempeña un papel crucial en la biosíntesis de ABA en semillas. / [CA] L´àcid abscísic (ABA) és una fitohormona que ha estat implicada en el control de processos vegetals essencials, principalment en el desenvolupament de la llavor així com en la resposta de les plantes a diferents estressos ambientals, particularment fred, sequera i salinitat. En el present treball de tesi doctoral s´ha fet la recerca en coleccions d´Arabidopsis thaliana mutagenizades amb T-DNA de mutants capaços de germinar en condicions d´elevada sal (NaCl), identificant-se tres loci mutants, inicialment denominats sre1,sre2 i sre3 (“salt resistant”). Els mutants sre, a més de la seva capacitat per a germinar i establir plàntula en condicions d´estrès osmòtic, mostraven una germinació resistent a paclobutrazol, latència molt reduïda, major transpiració i nivells d´ABA en fulles de roseta significativament menors que les plantes silvestres. L´anàlisi de complementació va mostrar que els mutants sre1 eren al·lèlics al mutant aba2-1, els mutants sre2 eren al·lèlics al mutant aao3-1 i el mutant sre3 era al·lèlic al mutant aba1-5. Així, l´ABA bloqueja la germinació i l´establiment de la plàntula en condicions de baix potencial hídric, i aleshores mutants capaços de germinar en condicions d´estrès osmòtic representen normalment mutants amb defectes en la biosíntesi d´ABA. Mitjançant una combinació de les estratègies de mapeig posicional i gen candidat s´ha realitzat la identificació del gen ABA2 y de les mutacions sre1-1/aba2- 11 y sre1-2/aba2-12.El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena curta dependent de NAD+ (SDR). La mutació sre1-1/aba2-11 es deguda a una deleció de 53 pb que també suposa un camvi en la pauta de lectura, generant un al·lel nul de ABA2. La mutació sre1-2/aba2-12 produeix a la substitució Gly28Arg, afectant al lloc d´unió del coenzima. Mitjançant un anàlisi HPLC-MS s´ha demostrat que la proteïna recombinant ABA2 catalitza la conversió de xantoxina en aldehid abscísic en una reacció dependent de NAD+ . Els resultats obtinguts en el present treball estableixen inequívocament que la conversió de xantoxina en aldehíd abscísic representa el penúltim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA i que està catalitzat pel producte gènic del gen ABA2 (At1g52340). L´últim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA és la conversió de l´aldehid abscísic en àcid abscísic. Aquest pas està catalitzat en A. thaliana pel producte gènic del gen AAO3. Els mutants sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutant aao3-1, mostraven una reducció en els nivells d´ABA en fulles de roseta i una major transpiració que las plantes silvestres. A més, i contràriament al mutant aao3-1, mostraven un fenotip de osmotolerancia en germinació i establiment de plàntula, germinació resistent a paclobutrazol, latència reduïda i posseeixen una reducció del 65% en els nivells d´ABA en llavors. La caracterització molecular de la mutació sre2-1/aao3-2 revela una inserció de T-DNA que elimina la transcripció del gen AAO3, constituint por tant un al·lel nul. La secuenciació del gen AAO3 en el mutant sre2-2/aao3-3 va revelar una deleció de tres nucleòtids i vàries mutacions de canvi de sentit. L´evidencia genètica i bioquímica resultant de l´anàlisi dels mutants sre2- 1/aao3-2 i sre2-2/aaao3-3 indica que lesions en el gen AAO3 condueixen a nivells reduïts d´ABA i fenotips característics en llavors. Aleshores, queda demostrat que el gen AAO3 poseeix un paper crucial en la biosíntesi d´ABA en llavors. / González Guzmán, M. (2005). Genética molecular de la biosíntesis del ácido abscísico. Clonación y caracterización del gen ABA2 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/135830 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

Tesis por compendio / [ES] Enmarcada en la línea de investigación de nuestro laboratorio sobre señalización por nitrógeno principalmente en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC7942, con esfuerzos centrados en las proteínas PII y PipX y su red de señalización, esta Tesis amplía el espectro de moléculas investigadas en relación con dicha red. Estudia y caracteriza el miembro no canónico de la superfamilia de la proteína PII denominado CutA, generalmente anotado como de protección frente a metales divalentes, altamente conservado en todos los dominios de la vida (incluidos animales y el ser humano). En ella examinamos la posible protección frente a metales provista por CutA en dos bacterias muy distantes, Escherichia coli y Synechococcus elongatus, usando knockouts para ambas del gen que codifica para CutA. Ni los estudios de complementación en E. coli del gen silvestre ni los observacionales de sensibilidad a metales en S. elongatus han dado soporte a la función anotada para CutA, a pesar de que demostramos mediante seguimiento turbidimétrico que el Cu2+ hace agregar a la proteína CutA pura de S. elongatus (producida recombinantemente) y por tanto se une a ella, aunque con una afinidad baja por comparación con las concentraciones tóxicas de este metal para dicha cianobacteria. Buscando profundizar en el conocimiento de CutA, hemos determinado a muy alta resolución mediante difracción de rayos X la estructura de esta proteína de S. elongatus, sin evidenciar complejo alguno con cobre, pero demostrando que los tres bolsillos intersubunidades en el homotrímero de CutA son capaces de transportar moléculas orgánicas (en nuestro caso Bis-Tris). Estos resultados apoyan una posible función de CutA basada en la unión a estos bolsillos de biomoléculas neutras o positivamente cargadas y capaces de formar varios puentes de hidrógeno con las paredes de potencial negativo y fuerte carácter polar de estos bolsillos. También hemos estudiado la proteína PipY de S. elongatus, identificada recientemente como pareja funcional de la antes mencionada PipX, determinando sus propiedades espectroscópicas, unión de piridoxal fosfato (PLP) y resolviendo su estructura mediante difracción de rayos X. Probamos que PipY es monomérica y que tiene PLP unido. Su estructura no apoya que sea un enzima, siendo aparentemente apropiada para ejercer una posible función en la homeostasis de PLP. Dado que muy recientemente se ha descrito una epilepsia genética humana dependiente de vitamina B6 debida a mutaciones en el gen humano ortólogo de pipY, PROSC (ahora llamado PLPBP; codifica la proteína PLPHP), usamos inicialmente PipY de S. elongatus y luego PROSC humana como banco de pruebas de la patogenicidad de las mutaciones que se han asociado a esta epilepsia, utilizando para ello mutagénesis dirigida y producción de las formas silvestre y mutantes de estas proteínas, comparando sus propiedades. Estos estudios han demostrado la patogenicidad y establecido mecanismos para la misma para cada una de las mutaciones de cambio de sentido de PROSC descritas hasta ahora en esta epilepsia. Nuestros estudios han representado un importante avance en la comprensión de las proteínas de tipo PipY y de la epilepsia asociada a la forma humana de las mismas. / [CA] Emmarcada en la línia d'investigació del nostre laboratori de senyalització per nitrogen principalment en el cianobacteri Synechococcus elongatus PCC7942, amb esforços centrats en les proteïnes PII i PipX i la seua xarxa de senyalització, esta Tesi amplia l'espectre de molècules investigades en relació amb la dita xarxa. Estudia i caracteritza el membre no canònic de la superfamília de la proteïna PII denominat CutA, generalment anotat com de protecció a metalls divalents, altament conservat en tots els dominis de la vida (inclosos animals i l'ésser humà). En ella examinem la possible protecció front a metalls proveïda per CutaA en dos bacteris molt distants, Escherichia coli i Synechococcus elongatus, usant knockouts del gen que codifica CutA per a ambdues. Ni els estudis de complementació en E. coli del gen silvestre ni els observacionals de sensibilitat a metalls en S. elongatus han donat suport a la funció anotada per CutA, tot i que vam demostrar mitjançant seguiment turbidimétric que el Cu2 + fa agregar a la proteïna CutA pura de S. elongatus (produïda de forma recombinant) i per tant s'uneix a ella, encara que amb una afinitat baixa per comparació amb les concentracions tòxiques d'aquest metall per a aquest cianobacteri. Buscant aprofundir en el coneixement de CutA, hem determinat a molt alta resolució mitjançant difracció de raigs X l'estructura d'aquesta proteïna de S. elongatus, sense evidenciar cap complex amb coure, però demostrant que les tres cavitats formades entre les subunitats del homotrimer de CutA són capaços de transportar molècules orgàniques (en el nostre cas Bis-Tris). Aquests resultats donen suport a una possible funció de CutA basada en la unió a aquestes cavitats de biomolècules neutres o positivament carregades i capaços de formar diversos ponts d'hidrogen amb les parets de potencial negatiu i fort caràcter polar d'aquestes cavitats. També hem estudiat la proteïna PipY de S. elongatus, identificada recentment com a parella funcional de l'abans esmentada PipX, determinant les seves propietats espectroscòpiques, unió de piridoxal fosfat (PLP) i resolent la seva estructura mitjançant difracció de raigs X. Vam provar que PipY és monomèrica i que té PLP unit. La seva estructura no recolza que sigui un enzim, sent aparentment apropiada per a exercir una possible funció en l'homeòstasi de PLP. Atès que molt recentment s'ha descrit una epilèpsia genètica humana dependent de vitamina B6 deguda a mutacions en el gen humà ortòleg de pipY, PROSC (ara anomenat PLPBP; codifica la proteïna PLPHP), fem servir inicialment PipY de S. elongatus i després PROSC humana com banc de proves de la patogenicitat de les mutacions que s'han associat a aquesta epilèpsia, utilitzant mutagènesi dirigida i produint les formes silvestre i mutants d'aquestes proteïnes, comparant les seves propietats. Aquests estudis han demostrat la patogenicitat i establert mecanismes per a la mateixa per a cadascuna de les mutacions de canvi de sentit de PROSC descrites fins ara en aquesta epilèpsia. Els nostres estudis han representat un important avanç en la comprensió de les proteïnes de tipus PipY i de l'epilèpsia associada a la forma humana de les mateixes. / [EN] In the context of research of our laboratory on nitrogen signaling mainly in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC7942, with efforts focused on the PII and PipX proteins and their signaling network, this Thesis extends the spectrum of molecules investigated in relation to such network. It studies and characterizes the non-canonical member of the PII protein superfamily named CutA, a highly conserved protein in all domains of life (including animals and humans) which is generally annotated as protecting against divalent metals. We examine the possible protection provided by CutA against metals, using knockouts for the CutA-encoding gene of two phylogenetically distant bacteria, Escherichia coli and Synechococcus elongatus PCC7942. Neither complementation studies in E. coli by the wild-type gene, nor observational studies of sensitivity to metals in the S. elongatus knockout have supported the function annotated for CutA, although we show by turbidimetric monitoring that Cu2+ causes aggregation of pure S. elongatus CutA (produced recombinantly) and therefore binds to it, although with a low affinity by comparison with the concentrations of this metal that are toxic for this cyanobacterium. Aiming at getting further insight into CutA, we have determined at very high resolution, by X-ray diffraction, the structure of this protein of S. elongatus, failing to observe Cu2+ bound in this structure, but showing that the three pockets formed at intersubunit boundaries in the CutA homotrimer are capable of transporting organic molecules (in our case Bis-Tris) without inducing conformational changes in the protein. This finding supports a possible function of CutA based on the binding to these pockets of neutral or positively charged biomolecules capable of forming several hydrogen bonds with the pocket walls, which are endowed with negative potential and have a strong polar character. We have also studied the PipY protein of S. elongatus, recently identified as a functional partner of the aforementioned PipX, determining its spectroscopic properties, binding of pyridoxal phosphate (PLP) and solving its structure by X-ray diffraction. We prove that PipY is monomeric and has PLP attached. Its structure does not favor an enzymatic role of PipY, being more appropriate for exerting a possible function in the homeostasis of PLP. Given the very recent description of a human vitamin B6-dependent genetic epilepsy associated to mutations in the human orthologue of the pipY gene, PROSC (now called PLPBP, encoding the PROSC protein, now named PLPHP), we used first S. elongatus PipY and afterwards and more extensively human PROSC to test by site-directed mutagenesis the pathogenicity of the mutations that have been associated with this epilepsy. These studies have demonstrated the pathogenicity and established mechanisms for this pathogenicity for each of the missense mutations reported thus far in patients with PROSC-associated epilepsy. Our studies represent an important advance in the understanding of PipY-like proteins and of epilepsy associated with the human form thereof. / Para la realización de esta Tesis, Lorena Tremiño Agulló ha disfrutado de una Beca de Formación de Personal Investigador (FPI) (BES-2012-058304) otorgado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo 739 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, V. Rubio) y se ha enmarcado dentro de los proyectos: -“Luz estructural sobre señalización y regulación por nitrógeno y sobre biosíntesis de arginina/urea, sus errores congénitos, y su conexión con biología del envejecimiento”, (BFU2011-30407) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal,V. Rubio). -“Una mirada molecular al control de la detoxificación de amonio y a sus patologías y errores congénitos, y a la señalización por amonio. En busca del papel de la proteína CutA”, (BFU2014-58229) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal, V. Rubio). -"BioMeder. Genes, proteínas y rutas de señalización en enfermedades raras" (PrometeoII/2014/029) de la Conselleria d'Educació de la Generalitat Valenciana (investigadores, P. Sanz, A. Marina y V. Rubio). / Tremiño Agulló, L. (2019). Bases estructurales de la señalización y regulación por nitrógeno y procesos asociados [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/117999 / TESIS / Compendio

[ES] La N6-metiladenosina (m6A) es una modificación generalizada en los ARN celulares de diferentes organismos que puede afectar muchos procesos y vías celulares. En las plantas, ocurre mediante un complejo de metilación que contiene varias proteínas: MTA, MTB, FIP37, VIR y HAKAI. Esta modificación es eliminada por desmetilasas de la familia AlkB, mientras que los miembros de la familia ETC son las proteínas mejor descritas que reconocen y procesan los ARN m6A-modificados. Estudios de epitransciptómica viral han revelado un papel igualmente importante de m6A durante la infección por virus; sin embargo, no existe una función pro- o antiviral de m6A generalizada. El laboratorio donde se ha llevado a cabo este trabajo ha sido pionero en el estudio del efecto de m6A en la interacción planta-virus, utilizando como virus modelo el AMV. El AMV pertenece a la familia Bromoviridae, y su genoma está formado por tres (+)ssARN. Los ARN1/2 codifican las subunidades de replicasa (P1 y P2), mientras que el ARN3 codifica la proteína de movimiento (MP) y sirve como molde para la síntesis del sgARN4, que codifica la proteína de cubierta (CP). Al comienzo de esta tesis, nuestro laboratorio ya había informado sobre: la presencia de supuestos motivos m6A en el 3'UTR/RNA3, una región crítica para la replicación de AMV, la primera m6A-desmetilasa de Arabidopsis (ALKBH9B), la relevancia funcional de ALKBH9B para mantener niveles adecuados de m6A/A para la correcta replicación de AMV, la capacidad de la CP de AMV para interactuar con ALKBH9B, posiblemente para usurpar la actividad de ALKBH9B, y la capacidad de las proteínas de Arabidopsis ECT2/3/5 para interactuar con el ARNv de AMV que contienen m6A. Dada la relevancia funcional de m6A en la biología de AMV, en esta tesis se decidió profundizar en el conocimiento de las implicaciones del mecanismo de regulación de m6A en el ciclo infeccioso viral de AMV. Para ello, se decidió: profundizar en la comprensión funcional de la m6A-desmetilasa ALKBH9B, evaluar la función in vivo de los supuestos dos sitios m6A presentes en el 3'UTR/ARN3, y explorar una posible implicación de algunas m6A metiltransferasas en la infección causada por AMV. El mapeo de los subdominios funcionales de atALKBH9B determinó la presencia de IDRs en la región N-terminal, dentro del dominio interno similar a AlkB y en la región C-terminal. Alrededor del 78% del RBD identificado en ALKBH9B está contenido en el IDR C-terminal. Debido a que las IDRs se localizan con frecuencia en proteínas que se someten a LLPS, un proceso que probablemente contribuye a la formación y estabilidad de los gránulos de ARN, es posible que las IDR y la RBD de ALKBH9B puedan actuar de manera cooperativa para promover la formación de gránulos de ARN. El análisis de los putativos motivos DRACH localizados en el bucle de hpB y en el tallo inferior de hpE del 3'UTR/ARN3 de AMV demostró que son sitios críticos involucrados en la replicación in vivo de AMV. La identidad de los residuos 2012A, 2013A y 2014A en el bucle hpB parece ser un requisito estructural clave para la replicación y/o acumulación de AMV. Con respecto a hpE, nuestros resultados determinaron que el supuesto residuo de m6A (1902A), así como el apareamiento de bases del tallo inferior de hpE, también son requisitos esenciales para la síntesis in vivo de ARNs de cadena positiva en AMV. Hasta donde sabemos, esta es la primera evidencia en AMV que muestra que el bucle de hpB y el tallo inferior de hpE están involucrados en la replicación/acumulación viral y la síntesis de ARNs de cadena positiva, respectivamente. Finalmente, en cuanto al estudio de la influencia de las m6A-metiltransferasas en el ciclo de infección viral de AMV, no se determinó un efecto proviral y/o antiviral en el complejo m6A-ARNm metiltransferasa conformado por atMTA:atMTB, ni en el putativo complejo m6A- ARNr metiltransferasa conformado por atMETTL5-like:atTRMT112-like sobre la biología de AMV. / [CA] La N6-metiladenosina (m6A) és una modificació generalitzada en els ARN cellulars de diferents organismes que pot afectar molts processos i vies cellulars. En les plantes, ocorre mitjançant un complex de metilació que conté diverses proteïnes: MTA, MTB, FIP37, VIR i HAKAI. Aquesta modificació és eliminada per desmetilasas de la família AlkB, mentre que els membres de la família ETC són les proteïnes més ben descrites que reconeixen i processen els ARN m6A-modificats. Estudis de epitransciptómica viral han revelat un paper igualment important de m6A durant la infecció per virus; no obstant això, no existeix una funció pro- o antiviral de m6A generalitzada. El laboratori on s'ha dut a terme aquest treball ha sigut pioner en l'estudi de l'efecte de m6A en la interacció planta-virus, utilitzant com a virus model el AMV. El AMV pertany a la família Bromoviridae, i el seu genoma està format per tres (+) ssARN. Els ARN1/2 codifiquen les subunitats de replicasa (P1 i P2), mentre que l'ARN3 codifica la MP i serveix com a motle per a la síntesi del sgARN4, que codifica la CP. Al començament d'aquesta tesi, el nostre laboratori ja havia informat sobre: la presència de suposats motius m6A en el 3'UTR/RNA3, una regió crítica per a la replicació de AMV, la primera m6A-desmetilasa de Arabidopsis (ALKBH9B), la rellevància funcional d'ALKBH9B per a mantindre nivells adequats de m6A/A per a la correcta replicació de AMV, la capacitat de la CP de AMV per a interactuar amb ALKBH9B, possiblement per a usurpar l'activitat d'ALKBH9B, i la capacitat de les proteïnes de Arabidopsis ECT2/3/5 per a interactuar amb el ARNv de AMV que contenen m6A. Donada la rellevància funcional de m6A en la biologia de AMV, en aquesta tesi es va decidir aprofundir en el coneixement de les implicacions del mecanisme de regulació de m6A en el cicle infecciós viral de AMV. Per a això, es va decidir: aprofundir en la comprensió funcional de la m6A-desmetilasa ALKBH9B, avaluar la funció in vivo dels supòsits dos llocs m6A presents en el 3'UTR/ARN3, i explorar una possible implicació d'algunes m6A metiltransferasas en la infecció causada per AMV. El mapatge dels subdominis funcionals de atALKBH9B va determinar la presència de IDRs a la regió N-terminal, dins del domini intern similar a AlkB i a la regió C-terminal. Al voltant del 78% del RBD identificat en ALKBH9B està contingut en el IDR C-terminal. Pel fet que les IDRs es localitzen amb freqüència en proteïnes que se sotmeten a LLPS, un procés que probablement contribueix a la formació i estabilitat dels grànuls d'ARN, és possible que les IDR i la RBD d'ALKBH9B puguen actuar de manera cooperativa per a promoure la formació de grànuls d'ARN. L'anàlisi dels putatius motius DRACH localitzats en el bucle de hpB i en la tija inferior de hpE del 3'UTR/ARN3 de AMV va demostrar que són llocs crítics involucrats en la replicació in vivo de AMV. La identitat dels residus 2012A, 2013A i 2014A en el bucle hpB sembla ser un requisit estructural clau per a la replicació i/o acumulació de AMV. Respecte a hpE, els nostres resultats van determinar que el suposat residu de m6A (1902A), així com l'aparellament de bases de la tija inferior de hpE, també són requisits essencials per a la síntesi in vivo de ARNs de cadena positiva en AMV. Fins on sabem, aquesta és la primera evidència en AMV que mostra que el bucle de hpB i la tija inferior de hpE estan involucrats en la replicació/acumulació viral i la síntesi de ARNs de cadena positiva, respectivament. Finalment, quant a l'estudi de la influència de les m6A-metiltransferasas en el cicle d'infecció viral de AMV, no es va determinar un efecte proviral i/o antiviral en el complex m6A-ARNm metiltransferasa conformat per atMTA:atMTB, ni en el putatiu complex m6A-ARNr metiltransferasa conformat per atMETTL5-like:atTRMT112-like sobre la biologia de AMV. / [EN] N6-methyladenosine (m6A) is a widespread modification on cellular RNAs of different organisms that can impact many cellular processes and pathways. In plants, m6A-methylation is mainly installed by a methylation complex containing several proteins: MTA, MTB, FIP37, VIR, and HAKAI. This modification is removed by demethylases of the AlkB family, and members of the ECT family are the best described proteins that recognize and process m6A-modified RNAs. Studies of viral epitransciptomics have revealed an equally important role of m6A during virus infection; however, there is no global pro- or antiviral role of m6A that can be generalized. The laboratory where this work was carried out has been a pioneer in the study of the effect of m6A on plant-viruses, using AMV as a model-virus. AMV belongs to the Bromoviridae family and, as the rest of the members of this family, its genome consists of three (+)ssRNAs. RNA1 and RNA2 encode the replicase subunits (P1 and P2), whereas RNA 3 encodes the MP and serves as a template for the synthesis of sgRNA 4, which encodes CP. At the beginning of this thesis, our laboratory had already reported on: the presence of putative m6A-motifs in the 3'UTR RNA3, a critical region for AMV replication, the first Arabidopsis m6A-demethylase (ALKBH9B), the functional relevance of ALKBH9B to maintain adequate m6A/A levels for correct AMV replication, the ability of AMV-CP to interact with ALKBH9B, possibly to usurp ALKBH9B activity, and the capability of Arabidopsis ECT2/3/5 to interact with m6A-containing AMV vRNAs. Given the functional relevance of m6A on the biology of AMV, in this thesis it was decided to deepen the knowledge of the implications of the m6A regulation mechanism on the viral infectious cycle of AMV. For this, it was decided: deepen the functional understanding of the m6A-demethylase ALKBH9B, evaluate the in vivo function of the putative two m6A-sites present in the 3'UTR-RNA 3, and explore a possible involvement of some m6A-methyltransferases in infection caused by AMV. We mapped functional subdomains in the atALKBH9B m6A-demethylase required for its binding to the vRNA and to the CP of AMV. Remarkably, it was observed the presence of IDRs in the N-terminal region, within the internal domain like AlkB and in the C-terminal region. About 78% of the RBD identified in ALKBH9B is contained in the C-terminal IDR. In this context, it has been proposed that the capability to specifically target different RNAs in RBPs containing IDRs is due to conformational flexibility as well as the establishment of extended conserved electrostatic interfaces with RNAs. Additionally, due that IDRs are frequently localized in proteins that undergo LLPS, a process that likely contributes to the formation and stability of RNA granules, it's possible that the IDRs and the RBD of ALKBH9B could act cooperatively to promote RNA granule formation. The analysis of the putative DRACH-motifs located in the hpB loop and the lower-stem of hpE in the 3'UTR RNA 3 present hot sites involved in AMV replication in vivo. The identity of residues 2012A, 2013A and 2014A in the hpB loop appears to be a key structural requirement for AMV replication and/or accumulation. Regarding hpE, our results determined that the putative m6A-residue 1902A, as well as the base pairing of the lower-stem of hpE, are also essential requirements for the in vivo plus-strand synthesis in AMV. To our knowledge, this is the first evidence in AMV to show that the hpB loop and the lower-stem of hpE are involved in viral replication/accumulation and plus-strand synthesis, respectively. Finally, regarding the study of the influence of m6A-methyltransferases on the viral infection cycle of AMV, a non-proviral and/or antiviral effect was determined in the m6A-mRNA methyltransferase complex made up of atMTA:atMTB, nor of the putative m6A-rRNA methyltransferase complex made up of atMETTL5-like:atTRMT112-like on the biology of AMV. / Alvarado Marchena, LF. (2022). Insights into the Molecular Mechanisms of the N6-Methyladenosine (m6A) Methylation Machinery in the Regulation of the Infection Cycle of RNA Plant Viruses [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185122 / TESIS

[ES] El empleo de organismos vivos como biofactorías ha ganado una atención significativa en la industria debido a la creciente demanda de sistemas de producción sostenibles y la escasez de recursos. Entre sus muchas aplicaciones, las biofactorías pueden ser diseñadas para producir feromonas de insectos, las cuales sirven como alternativa ecológica a los pesticidas para el control de plagas en la agricultura. Como prueba de concepto, en esta tesis doctoral se caracterizaron plantas de Nicotiana benthamiana modificadas genéticamente con una ruta multigénica para producir las feromonas de polillas (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) y (Z)-11-hexadecenil acetato (Z11-16OAc). Las plantas resultantes produjeron cantidades moderadas de ambas feromonas (111.4 µg g-1 FW y 11.8 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente), y tasas de emisión diarias de ~10 ng g-1 FW para cada feromona. La producción de feromonas afectó negativamente al desarrollo de las plantas, probablemente debido a la sustancial carga metabólica y posible toxicidad de estos productos. Una estrategia para superar estas limitaciones es diseñar un sistema de expresión condicional que permita a las plantas crecer con normalidad antes de inducir la producción de feromonas. Para ello desarrollamos un conjunto de promotores sintéticos personalizables, llamados GB_SynP, activables con dCasEV2.1, un activador transcripcional potente y programable desarrollado recientemente para la inducción de genes en plantas. Los promotores GB_SynP permitieron una regulación precisa de los transgenes, con unos niveles de transcripción robustos y modulables en el estado "encendido" (presencia de dCasEV2.1 y la correspondiente guía de ARN), y una expresión mínima en el estado "apagado". Para implementar el sistema de producción condicional de feromonas en plantas se generó una nueva ruta multigénica para la biosíntesis de feromonas de polilla bajo el control de los promotores GB_SynP. Paralelamente, el activador dCasEV2.1 se reguló transcripcionalmente mediante el módulo CUP2:GAL4 sensible a sulfato de cobre, un inductor químico ampliamente utilizado en la agricultura. La funcionalidad del sistema se probó mediante expresión transitoria en N. benthamiana, resultando en unos rendimientos en el estado "encendido" de 32.7 µg g-1 FW y 25 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente, y unos niveles insignificantes en ausencia de cobre. Sin embargo, la expresión en estable de esta ruta en N. benthamiana produjo unos niveles de expresión de los transgenes significativamente menores y una marcada disminución en la producción de feromonas. Esto supone que el sistema en su forma actual resulte inviable como biofactoría de feromonas en términos prácticos. La optimización de este sistema debe centrarse en mejorar la cascada de activación, en el uso de especies de plantas alternativas con mayor biomasa, y/o en incrementar las tasas de emisión en planta. Como alternativa a la producción de feromonas en plantas, la intercambiabilidad de piezas génicas entre plantas y hongos filamentosos puede aprovecharse para crear biofactorías fúngicas de feromonas. En este sentido, nuestro grupo adaptó previamente el sistema GoldenBraid a hongos filamentosos, llamado FungalBraid. En esta tesis ampliamos la colección de FungalBraid incorporando 27 piezas nuevas que incluyen diferentes marcadores de selección y promotores constitutivos e inducibles, los cuales se caracterizaron funcionalmente en Penicillium digitatum y P. chrysogenum. Además, se expresaron con éxito los promotores GB_SynP en P. digitatum, en combinación con el sistema de dCas9 activadora contenido en el vector pAMA18. Aunque los niveles de expresión de GB_SynP en hongos filamentosos fueron menores que los observados previamente en plantas, ésta y otras herramientas disponibles en la colección FungalBraid pueden utilizarse en el futuro para el desarrollo de biofactorías fúngicas que produzcan feromonas de insectos y otras biomoléculas de alto valor. / [CA] L'ús d'organismes vius com biofàbriques ha guanyat una atenció significativa a la indústria a causa de la creixent demanda de sistemes de producció sostenible i l'escassetat de recursos. Entre les seues moltes aplicacions, les biofàbriques poden ser dissenyades per a produir feromones d'insectes, les quals serveixen com a alternativa ecològica als pesticides per al control de plagues a l'agricultura. Com a prova d'aquest concepte, en aquesta tesi doctoral es van caracteritzar plantes de Nicotiana benthamiana modificades genèticament plantes de amb una ruta multigènica per a produir les feromones d'arnes (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) i (Z)-11-hexadecenil acetat (Z11-16OAc). Les plantes resultants van produir quantitats moderades de totes dues feromones (111.4 µg g-1 FW i 11.8 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament), i taxes d'emissió diàries d'aproximadament 10 ng g-1 FW per a cada feromona. La producció de feromones en aquestes plantes va afectar negativament el seu desenvolupament, probablement a causa de la substancial càrrega metabòlica i possible toxicitat d'aquests productes. Una estratègia per superar aquestes limitacions és dissenyar un sistema d'expressió condicional que permeta a les plantes créixer amb normalitat abans d'induir la producció de feromones. Per això hem desenvolupat un conjunt de promotors sintètics personalitzables, anomenats GB_SynP, activables amb dCasEV2.1, un activador transcripcional potent i programable desenvolupat recentment per a la inducció de gens en plantes. Els promotors GB_SynP van permetre una regulació precisa des transgens, amb uns nivells de transcripció robustos i modulables a l'estat "encès" (presència de dCasEV2.1 i la corresponent guia d'ARN), i una expressió mínima a l'estat "apagat". Per implementar el sistema de producció condicional de feromones en plantes es va generar una nova ruta multigènica per a la biosíntesi de feromones d'arna sota el control dels promotors GB_SynP. Paral·lelament, l'activador dCasEV2.1 es va regular transcripcionalment al mòdul CUP2:GAL4 sensible al sulfat de coure, un inductor químic àmpliament utilitzat en l'agricultura. La funcionalitat del sistema es va provar mitjançant expressió transitòria en N. benthamiana, resultant en uns rendiments a l'estat "encès" de 32.7 g-1 FW i 25 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament, i uns nivells insignificants en absència de coure. No obstant això, l'expressió estable d'aquesta ruta a N. benthamiana va produir uns nivells d'expressió dels transgens significativament menors i una marcada disminució en la producció de feromones. Això suposa que el sistema en la seua forma actual resulte inviable com a biofàbrica de feromones en termes pràctics. L'optimització d'aquest sistema ha de centrar-se en millorar la cascada d'activació, en l'ús d'espècies de plantes alternatives amb major biomassa, i/o en incrementar les taxes d'emissió a la planta. Com a alternativa a la producció de feromones en plantes, la intercanviabilitat de peces gèniques entre plantes i fongs filamentosos pot aprofitar-se per crear biofàbriques fúngiques de feromones. En aquest sentit, el nostre grup va adaptar prèviament el sistema GoldenBraid a fongs filamentosos, anomenat FungalBraid. En aquesta tesi, vam ampliar la col·lecció de FungalBraid incorporant 27 peces noves que inclouen diferents marcadors de selecció i promotors constitutius i induïbles, els quals es van caracteritzar funcionalment a Penicillium digitatum i P. chrysogenum. A més, es van expressar amb èxit els promotors GB_SynP en P. digitatum, en combinació amb el sistema de dCas9 activadora contingut en el vector pAMA18. Encara que els nivells d'expressió de GB_SynP en fongs filamentosos van ser menors que els observats prèviament en plantes, aquesta i altres eines disponibles a la col·lecció FungalBraid poden utilitzar-se en el futur per al desenvolupament de biofàbriques fúngiques que produeixin feromones d'insectes i altres biomolècules de gran valor. / [EN] The use of living organisms as biofactories have gained significant attention in the industry due to the increasing demand for sustainable production systems and the shortage of resources. Among their many applications, biofactories can be engineered to produce insect pheromones, which serve as eco-friendly alternatives to pesticides for pest management in agriculture. As a proof of concept, in this thesis we characterized Nicotiana benthamiana plants engineered with a multigene pathway to produce the moth pheromones (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) and (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16OAc). The resulting transgenic plants produced modest amounts of both pheromones (111.4 µg g-1 FW and 11.8 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc, respectively), and daily emission rates of ~10 ng g-1 FW for each pheromone. Pheromone production in these plants significantly affected their fitness, likely due to the substantial metabolic burden and possible toxicity of lipid-derived products. One strategy to address these developmental abnormalities consists of engineering conditional transgene expression systems, thus allowing plants to grow normally before inducing the production of pheromones. To achieve this goal, in this thesis we developed a set of customizable synthetic promoters called GB_SynP, which can be activated by dCasEV2.1, a strong programable transcriptional activator recently developed for plant gene regulation. These GB_SynP promoters enabled tight regulation of single and multiple transgenes, with robust and tunable transcription levels in the ON state (presence of dCasEV2.1 loaded with the corresponding gRNA), and minimal or undetectable expression in the OFF state. To implement a conditional expression system for pheromone production in plants, a newly engineered multigene pathway for the biosynthesis of moth pheromones was constructed under the control of GB_SynP promoters. In parallel, the dCasEV2.1 activator was transcriptionally regulated with the CUP2:GAL4 sensor for copper sulphate, an agronomically-compatible chemical trigger. The functionality of this system was tested transiently in N. benthamiana, resulting in estimated yields of 32.7 µg g-1 FW and 25 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc respectively in the ON state, and negligible levels in the absence of copper. However, stable transformation of the same copper-regulated pheromone pathway in N. benthamiana plants resulted in significantly lower transgene expression levels, which translated into a great reduction of pheromone yields. This makes the system in its current form a non-viable pheromone biofactory in practical terms. Further optimization should focus on the improvement of the activation cascade, the use of alternative plant hosts with more biomass, and/or the enhancement of emission rates in planta. As an alternative to pheromone production in plants, the interchangeability of DNA parts between plants and filamentous fungi could also be exploited to create fungal biofactories for pheromone production. In this regard, our research group previously adapted the GoldenBraid system for filamentous fungi, which we named FungalBraid. In this thesis, we expanded the FungalBraid collection by incorporating 27 new DNA parts, including different selection markers and several constitutive and inducible promoters, all of which were functionally characterized in Penicillium digitatum and P. chrysogenum. Furthermore, we successfully expressed the GB_SynP promoters developed for plants in P. digitatum, in combination with the non-integrative pAMA18-derived vector for the expression of a dCas9-based activator. Although further optimization of GB_SynP in filamentous fungi is required, as expression levels were lower than those previously observed in plants, this and the other tools available in the FungalBraid collection can be effectively employed in the future for the development of fungal biofactories that produce insect pheromones and other high value biomolecules. / Este trabajo ha sido financiado mediante la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario FPU18/02019 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), así como por el proyecto europeo SUSPHIRE (PCI2018-092893, Era- CoBiotech), y los proyectos de Plan Nacional I+D PID2019-108203RB-100 y PID2021-125858OB-100 (Ministerio de Ciencia e Innovación). / Moreno Giménez, E. (2023). Synthetic biology tools for production of insect pheromones in plants and filamentous fungi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201180

La Proteína Quinasa C (PKC) participa en numerosas funciones fisiológicas a través de distintas rutas de señalización celular. Las isoenzimas clásicas están reguladas por diacilglicerol, ésteres de forbol, calcio y fosfolípidos aniónicos. La presencia de insaturaciones en los diacilgliceroles de la membrana modifica la activación de la PKC alfa.Los dominios C2 de PKC clásicas presentan dos tipos de sitios de unión de calcio y enlazan tres cationes de manera similar. La desnaturalización térmica de estos dominios se desplazó hacia mayores temperaturas con concentraciones crecientes de calcio, siendo mayor el efecto en presencia de fosfolípidos aniónicos. La estructura secundaria de los dominios C2 de PKC clásicas así como de la PKC alfa completa mostró una elevada proporción de hoja beta. La adición de fosfolípidos aniónicos y PMA respectivamente provocó un mayor efecto protector frente a la desnaturalización térmica que sólo con calcio. / Protein Kinase C (PKC) plays a key role in several physiological functions through different celullar signalling pathways. The classical isoenzymes are regulated by diacylglycerol, phorbol esters, calcium, and anionic phospholipids.The presence of insaturations in the membrane diacylglycerols modifies the PKC alpha activation.C2 domains of classical PKC have two different binding sites for calcium, and bind three molecules in a similar way. The thermal denaturation of these domains moved to higher temperatures with increasing calcium concentrations, being this effect hingher in the presence of anionic phospholipids. The secondary structure of both C2 domains from classical PKC and PKC alpha showed a high contribution of beta-sheet component. The addition of anionic phospholipids and PMA produced the main protection against thermal denaturation, respectively