El ácido salicílico (SA) juega un papel fundamental en la respuesta defensiva de las plantas. Este compuesto se acumula en las mismas como consecuencia de infecciones patogénicas de tipo incompatible, y su aplicación exógena induce resistencia. Asimismo, plantas transgénicas incapaces de acumularlo presentan una mayor susceptibilidad a patógenos de distinta naturaleza. Por otra parte, el ácido gentísico (GA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) se acumula en plantas en infecciones compatibles no necrotizantes. La aplicación exógena de GA induce un conjunto de proteínas de defensa PR (Pathogenesis related) distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario en la señalización frente a patógenos en plantas. Ambos compuestos se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una o más moléculas de azúcar. Estas reacciones de conjugación son catalizadas por proteínas denominadas glicosiltransferasas. En plantas de tomate el SA se acumula como SA 2-O-ß-glucósido, unido a una molécula de glucosa, mientras el GA lo hace en forma de GA 5-O-ß-xilósido, unido a xilosa. GAGT (Gentisic Acid Glycosyl Transferase) ha sido descrita como la proteína que conjuga GA en tomate. Dado que la glicosilación de metabolitos es una forma rápida de inactivarlos, la existencia de esta proteína con actividad conjugadora de GA refuerza la idea del ácido gentísico (GA) como molécula señal complementaria al SA en la interacción planta-patógeno. Por otra parte, la proteína Twi1 (Tomato wound inducible), descrita en tomate como una posible glicosiltransferasa debido a sus características comunes con este grupo de proteínas, presenta inducción por SA y otros compuestos de naturaleza fenólica, además de herida e interacciones de tipo incompatible. Trabajos en los que se ha llevado a cabo la sobreexpresión o el silenciamiento de una GT han puesto de manifiesto cómo ello conlleva la aparición de resistencia o susceptibilidad frente a una infección patogénica. Por tanto, las GTs tienen un papel fundamental en la respuesta defensiva de la planta, modulando los niveles de moléculas que intervienen en dicha respuesta. Por otra parte, se han realizado estudios dirigidos a elucidar la implicación de compuestos del metabolismo secundario en la interacción de plantas de tomate con distintos patógenos. Ello ha permitido detectar cambios concretos de los niveles de un número determinado de metabolitos a lo largo de las infecciones, como son cuatro amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) que se acumulan en plantas de tomate infectadas con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Las HCAAs son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, de bajo peso molecular y que se caracterizan por la presencia de nitrógeno en su estructura. En su ruta de biosíntesis participan diversos enzimas tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), la tirosina descarboxilasa (TYDC) o la tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). La acumulación en tomate de las cuatro amidas como consecuencia de la infección bacteriana va acompañada de la inducción del isoenzima THT1-3. La obtención de plantas transgénicas que sobreexpresen o silencien las proteínas GAGT, Twi1 y THT1-3 permitirá llevar a cabo ensayos de resistencia frente a infecciones patogénicas que contribuyan al conocimiento del sistema defensivo de las plantas, tanto en sus aspectos de señalización como en los referidos a componentes de la respuesta final de la planta. Al mismo tiempo, esta estrategia puede constituir, en sí misma, un medio de obtención de plantas más resistentes frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza. / Campos Beneyto, L. (2014). Metabolitos secundarios de naturaleza fenólica: papel en la respuesta defensiva de plantas de tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/44236 / TESIS

Plastids are the cellular organelles where many of the visual, health and flavor-related metabolites are produced and stored in the fruit, and therefore are valuable components for consumers and breeders. The more sugar and flavor the fruit has, the more appreciated is for the consumer and industry. Thus, one of the breeder's goals is to obtain new varieties with fruits improved in these aspects. Paradoxically, fruits with a high content in chloroplasts have been avoided by the breeders because it usually suffers of oxidative stress disorders; such yellow shoulder impairment and fruit cracking when the light intensity increases. For this reason breeding efforts has been focused mainly on avoiding fruit losses and organoleptic characteristics have been neglected. This thesis aims to improve tomato fruit quality by engineering plants to produce fruits with enhanced fruit chloroplast functions and improved tolerance to oxidative stress, using cisgenic/ intragenic approaches. SlGLK1, SlGLK2 and SlAPRR2 transcription factors have been suggested to be involved in chloroplast development. Tomato MoneyMaker plants were engineered to express SlGLKs and SlAPRR2 either singly or in combination early in development. Those lines provide fruits which accumulate more sugars, carotenoids and specific volatiles than WT. The fruit chloroplast enhanced lines were characterized at the structural, metabolic, proteomics and transcriptomics. A novel additive effect in the chloroplast regulation network resulted when both transcription factors were coexpressed and a hypothesis for this effect is presented. In addition, two tomato traditional varieties (Muchamiel and Pera) expressing tomato genes for BMW anthocyanin regulatory complex under the control of the light inducible promoter (PLI) were produced and characterized. Engineered tomato plants showed large accumulation of anthocyanin specifically in the fruit peel and in Type VI trichomes. Characterization of those tissues indicated specific alterations of the flavonoid pathway that were highly dependent on the light conditions. These tomato lines could be of high interest to protect the fruit chloroplast enhancement lines from eventual stresses involving ROS, and also to assess the effect on plant growth under high light stress and in plant-pest interaction studies. / Los plastidos son orgánulos celulares donde se producen y almacenan muchos de los metabolitos relacionados con atributos organolépticos y compuestos beneficiosos para la salud, por lo tanto se consideran componentes de alto valor añadido para consumidores y mejoradores vegetales. Cuanto mayor contenido en azúcares solubles y sabor presente el fruto más se valoran por los consumidores y la industria. Por lo tanto uno de los objetivos actuales de los mejoradores de tomate es mejorar el fruto en estos aspectos. Paradójicamente, se ha seleccionado en contra de frutos con alto contenido en cloroplastos porque este carácter, bajo alta intensidad lumínica, suele estar asociado a daños en el fruto por estrés oxidativo; como los hombros amarillos del tomate o el agrietado del fruto. Por este motivo los esfuerzos en mejora se han orientado principalmente a evitar pérdidas y consecuentemente la calidad organoléptica se ha visto reducida. El objetivo de esta tesis es mejorar la calidad del fruto de tomate mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética orientadas a incrementar los cloroplastos en fruto y mejorar la tolerancia al estrés oxidativo con una aproximación cis/ intragenica. Los factores de transcripción SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 han sido estudiados por influir en el desarrollo del cloroplasto. Plantas de tomate de variedad MoneyMaker fueron mejoradas genéticamente para expresar de forma individual o conjunta SlGLKs y SlAPRR2 en estadios tempranos de desarrollo. Estas líneas proveen frutos con mayor acumulo de azúcares, carotenos y volátiles que el control MoneyMaker. Las líneas potenciadas en desarrollo de cloroplastos se caracterizaron a nivel estructural, metabólico, proteómico y transcriptómico. Se descubrió un novedoso efecto aditivo en la regulación génica del cloroplasto cuando ambos factores de transcripción se expresan simultáneamente y se presentó una hipótesis para dicho efecto. Además se caracterizaron dos variedades tradicionales de tomate (Muchamiel and Pera) diseñadas para expresar genes pertenecientes al complejo de regulación de antocianinas BMW, bajo el control del promotor inducible por luz (PLI). Las plantas mejoradas genéticamente presentan una gran acumulación de antocianos, especialmente en piel de fruto y en tricomas tipo VI. Caracterización de estos tejidos indican alteraciones específicas en la ruta de flavonoides y una alta dependencia a condiciones de luz. Estas plantas podrían ser de gran interés para proteger frutos con altos niveles de cloroplastos frente al estrés oxidativo generado por ROS, para evaluar el efecto en el crecimiento de la planta bajo condiciones de alta luz y en futuros estudios de interacción planta-patógenos / Els plastidis són orgànuls cel.lulars on es produeixen i emmagatzemen molts dels metabòlits relacionats amb atributs organolèptics i composts beneficiosos per a la salut, per tant es consideren components d'alt valor afegit per a consumidors i milloradors vegetals. Quant major contingut en sucres solubles i sabor presenta el fruït, més serà valorat per part dels consumidors i la industria. Paradoxalment, s'ha seleccionat en contra dels fruïts amb alt contingut en cloroplasts perquè aquest caràcter, davall alta intensitat lumínica, sol estar associat amb danys en el fruït per estrés oxidatiu; com muscles groguencs de la tomata o clevitjament del fruït. Per aquest motiu, l'esforç en millora s'ha orientat principalment a evitar pèrdues de manera que la qualitat organolèptica s'ha vist reduïda. L'objectiu d'aquesta tesi es millorar la qualitat del fruït de tomata mitjançant l'ús de tècniques d'enginyeria genètica orientades a incrementar els cloroplasts al fruït i millorar la tolerància a l'estrès oxidatiu amb una aproximació cis/intragènica. Plantes de tomata de la varietat MoneyMaker foren millorades genèticament per expressar de manera individual o conjunta SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 als moments inicials del desenvolupament. Aquestes línies donen fruïts amb major acumulació de sucres, carotens i volàtils que el control MoneyMaker. Les línies potenciades amb el desenvolupament de cloroplasts es caracteritzaren a nivell estructural, metabòlic, proteòmic i transcriptòmic. Es va descobrir un nou efecte additiu en la regulació gènica del cloroplast quan ambdós factors de transcripció s'expressen de manera simultània i es va presentar una hipòtesi per a dit efecte. A més, es van caracteritzar dos varietats tradicionals de tomata (Muchamiel i Pera) dissenyades per a expressar gens que pertanyen al complex de regulació d'antocians BMW, davall el control del promotor induïble per llum (PLI). Les plantes millorades genèticament presentaren una gran acumulació d'antocians, especialment a la pell del fruït i en tricomes de tipus VI. La caracterització d'aquest teixit indica alteracions específiques en la ruta dels flavonoides i una altra dependència a condicions de llum. Aquestes plantes podrien ser de gran interès per a protegir els fruïts d'alts nivells de cloroplasts front a l'estrès oxidatiu generat pels ROS, i per a avaluar l'efecte en el creixement de la planta davall condicions d'alta llum i en futurs estudis d'interacció planta-patògen. / Cocaliadis Caisson, MF. (2017). A multilevel, developmentally controlled gene engineering strategy for tomato fortification and protection [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90401 / TESIS

Tesis por compendio / [EN] Until recently, the genetic improvement of tomato (Solanum lycopersicum) was focused in agronomic traits, such as yield and biotic or abiotic stresses; therefore the interest in tomato fruit quality is relatively new. The tomato fruit surface can be considered both an agronomic trait as well as a quality trait, because it has an effect on consumer impression in terms of color and glossiness but also it underlies the resistance/sensitivity to cracking or water loss with consequences on fruit manipulation (e.g. transport and processing). The cuticle is deposited over the cell wall surrounding the epidermal cells and it is the first barrier in the plant-environment interface. The cuticle composition includes two main groups of metabolites: cuticular waxes and cutin. Other metabolites can be founded into the cuticle matrix, as triterpenoids and flavonoids. Those minor cuticular components are involved in the correct functionality of the cuticle. Understanding cuticle biosynthesis and genetic regulation requires the development of fast and simple analytical methodologies to study those specialized metabolites using large populations (e.g. mutant collections or introgression lines), together with the identification of genes and genomic regions responsible of their production. This thesis aims to contribute to our understanding of the molecular programs underlying tomato fruit quality by providing: i) a general protocol to profile cuticular waxes in different species, including tomato; ii) a QTL map for cuticular composition (i.e. cuticular waxes and cutin monomers) using the Solanum pennellii introgression line population; iii) a detailed protocol of the reverse genetic tool so-called Fruit-VIGS to assist in the study of gene function in tomato fruit; and iv) a thorough characterization of the first null allele for the transcription factor SlMYB12 (i.e. Slmyb12-pf) in tomato fruit which provides new insights into the regulation of the flavonoid biosynthetic pathway in the fruit peel by high resolution mass spectrometry and RNA-Seq approaches. / [ES] Hasta hace poco, la mejora genética del cultivo del tomate (Solanum lycopersicum) había estado centrada principalmente en caracteres agronómicos, como la productividad y la resistencia a estreses, tanto bióticos como abióticos. Así, el interés en la calidad del fruto de tomate es relativamente reciente. La superficie del fruto del tomate puede considerarse tanto un carácter agronómico como de calidad, pues influye en la primera impresión de los consumidores en términos de color y brillo, así como también en los procesos de resistencia o sensibilidad a la rotura ('cracking') o a la pérdida de agua. Estos factores determinan el aspecto del fruto y condicionan atributos relacionados con su manipulación (transporte y procesado). La cutícula se deposita sobre la pared celular de las células epidérmicas y es la primera barrera que interacciona con el ambiente. Está constituida por dos grandes tipos de metabolitos: las ceras cuticulares y la cutina. Otros metabolitos pueden aparecer embebidos en la matriz cuticular, como es el caso de los triterpenoides y los flavonoides. Estos metabolitos contribuyen a la correcta funcionalidad de la cutícula. La compresión de la biosíntesis y regulación génica de la cutícula requiere del desarrollo de metodologías de análisis sencillas y rápidas para el estudio de estos metabolitos especializados en grandes poblaciones (colecciones de mutantes o líneas de introgresión), así como para la identificación de genes y regiones génicas responsables de la producción y acumulación de dichos compuestos, pudiendo ser muy útiles para implementar programas de mejora de la calidad del tomate. El objetivo de esta tesis es contribuir a la comprensión sobre los programas moleculares subyacentes a la calidad del fruto de tomate, proporcionando: i) un protocolo general de análisis del contenido de ceras cuticulares en diferentes especies, incluyendo el tomate; ii) un mapa de QTL de la composición cuticular (incluyendo ceras y monómeros de cutina) obtenido con la población de líneas de introgresión de Solanum pennellii; iii) un protocolo detallado de uso de la herramienta de genética reversa Fruit-VIGS con el que realizar estudios de funciones génicas en fruto de tomate; y iv) una minuciosa caracterización de un nuevo alelo nulo del factor de transcripción SlMYB12 (Slmyb12-pf) en fruto de tomate, proporcionando nueva información sobre la regulación de la ruta biosintética de los flavonoides en la piel del fruto, utilizando espectrometría de masas de alta resolución y de nuevas tecnologías de secuenciación. / [CA] Fins fa poc de temps, la millora genètica de la tomata (Solanum lycopersicum) anava dirigida fonamentalment als caràcters de tipus agronòmic, com la productivitat i la tolerància a estressos biòtics o abiòtics, resultant que l'interés per la qualitat dels fruits és relativament nou. La superfície de la tomata pot ser considerada tant com un caràcter agronòmic com un de qualitat, ja que és l'aspecte de la superfície del fruit el que confereix al consumidor la primera impressió de color, brillantor, però és també la pell del fruit la responsable de la diferent susceptibilitat del fruit a desenvolupar clevills o que el fruit sofrisca més o menys pèrdues d'aigua, tot tenint importants conseqüències en la manipulació (i.e. transport i processament del fruit). La cutícula és dipositada per sobre de la paret cel·lular que envolta la capa de cèl·lules epidèrmiques i constitueix la primera barrera en la interfase planta-medi ambient. La composició de la cutícula presenta dos grups principals de metabòlits: les ceres i la cutina. També es poden trobar altres metabòlits els triterpenoids i el flavonoids. Aquests darrers components cuticulars menors són implicats en el correcte funcionament de la cutícula. Per tal de comprendre la biosíntesi i la regulació genètica de la cutícula cal desenvolupar tecnologies analítiques senzilles i rapides que permeten estudiar aquests metabòlits especialitzats en poblacions grans de plantes (i.e. Col·leccions de mutants o de línies d'introgressió), a més de la identificació de gens i regions genòmiques que són responsables de la seua producció. Aquesta tesi té com a objectiu contribuir a millorar la nostra comprensió dels programes moleculars que afecten determinats aspectes de la qualitat de la tomata mitjançant els següents objectius: i) proporcionar un protocol general per obtenir perfils de ceres cuticulars en diferents espècies, inclosa la tomata; ii) obtenir un mapa de QTL per a la composició cuticular (i.e. ceres cuticulars i monòmers de cutina) mitjançant la utilització de la població de línies d'introgressió de Solanum pennelli; iii) descriure amb detall el protocol d'una eina de revers genètica denominada Fruit-VIGS que resulta molt adequada per estudiar funció gènica a la tomata; y iv) fer una caracterització exhaustiva del primer al·lel nul del factor de transcripció SlMYB12 (ie. Slmyb12-pf) en tomata la qual proporciona informació nova sobre la regulació de la ruta de biosíntesi de flavonoides en la pell de la tomata mitjançant espectrometria de masses d'alta resolució i RNAseq. / Fernández Moreno, JP. (2015). TOMATO FLESHY FRUIT QUALITY IMPROVEMENT: CHARACTERIZATION OF GENES AND GENOMIC REGIONS ASSOCIATED TO SPECIALIZED METABOLISM IN TOMATO FLESHY FRUIT [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/55505 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

[EN] ABSTRACT Abscisic acid (ABA) signaling plays a critical role in regulating root growth and root system architecture. ABA-mediated growth promotion and root tropic response under water stress are key responses for plant survival under limiting water conditions. In this work, we have explored the role of Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) PYR/PYL/RCAR receptors (PYRABACTIN RESISTANCE1 (PYR1)/PYR1 LIKE (PYL)/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS) for root ABA signaling. As a result, we discovered that PYL8 plays a nonredundant role for the regulation of root ABA sensitivity. Unexpectedly, given the multigenic nature and partial functional redundancy observed in the PYR/PYL family, the single pyl8 mutant showed reduced sensitivity to ABA-mediated root growth inhibition. This effect was due to the lack of PYL8-mediated inhibition of several clade A phosphatases type 2C (PP2Cs), since PYL8 interacted in vivo with at least five PP2Cs, namely HYPERSENSITIVE TO ABA1 (HAB1), HAB2, ABAINSENSITIVE1 (ABI1), ABI2, and PP2CA/ABA-HYPERSENSITIVE GERMINATION3 as revealed by tandem affinity purification and mass spectrometry proteomic approaches. Membrane-delimited abscisic acid (ABA) signal transduction plays a critical role in early ABA signaling, but the molecular mechanisms linking core signaling components to the plasma membrane are unclear. We show that transient calciumdependent interactions of PYR/PYL/RCAR ABA receptors with membranes are mediated through a 10-member family of C2-domain ABA-related (CAR) proteins in Arabidopsis thaliana. Specifically, we found that PYL4 interacted in an ABA-independent manner with CAR1 in both the plasma membrane and nucleus of plant cells. CAR1 belongs to a plant-specific gene family encoding CAR1 to CAR10 proteins, and bimolecular fluorescence complementation and coimmunoprecipitation assays showed that PYL4-CAR1 as well as other PYR/PYL-CAR pairs interacted in plant cells. The crystal structure of CAR4 was solved, which revealed that, in addition to a classical calcium-dependent lipid binding C2 domain, a specific CAR signature is likely responsible for the interaction with PYR/PYL/RCAR receptors and their recruitment to phospholipid vesicles. This interaction is relevant for PYR/PYL/RCAR function and ABA signaling, since different car triple mutants affected in CAR1, CAR4, CAR5, and CAR9 genes showed reduced sensitivity to ABA in seedling establishment and root growth assays. In summary, we identified PYR/PYL/RCAR-interacting partners that mediate a transient Ca2+-dependent interaction with phospholipid vesicles, which affects PYR/PYL/RCAR subcellular localization and positively regulates ABA signaling. / [ES] RESUMEN La señalización por la hormona vegetal ácido abscísico (ABA) desempeña un papel crítico en la regulación del crecimiento de la raíz y en la arquitectura del sistema radical. La promoción de crecimiento de la raíz en condiciones de estrés hídrico mediada por ABA es clave para la supervivencia de las plantas bajo condiciones limitantes de agua. En este trabajo, hemos explorado el papel de los receptores PYR/PYL/RCAR (PYRABACTIN RESISTANCE1 (PYR1)/PYR1 LIKE (PYL)/ REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS) de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) en la ruta de señalización de ABA en raíz. Así, hemos descubierto que el receptor de ABA PYL8 juega un papel no redundante en la regulación de la percepción de ABA en raíz. Inesperadamente, dada la naturaleza multigénica y la redundancia funcional parcial observada en la familia PYR/PYL/RCAR, el mutante pyl8 fue el único mutante sencillo de pérdida de función de los receptores PYR/PYL/RCAR que mostraba una sensibilidad reducida a la inhibición del crecimiento mediada por ABA en raíz. Este efecto se debe a la falta de inhibición mediada por PYL8 de varias fosfatasas del grupo A tipo 2C (PP2Cs), ya que PYL8 es capaz de interactuar in vivo con al menos cinco PP2Cs, denominadas HYPERSENSITIVE TO ABA1 (HAB1), HAB2, ABAINSENSITIVE1 (ABI1), ABI2, and PP2CA/ABA-HYPERSENSITIVE GERMINATION3 según lo han revelado la purificación por afinidad en tándem (TAP por sus siglas en inglés) y estudios proteómicos de espectrometría de masas. La transducción de la señal del ABA localizada en la membrana plasmática celular juega un papel crucial en los pasos iniciales de la señalización de la fitohormona, pero los mecanismos moleculares que unen los componentes básicos de la señalización y la membrana plasmática no están claros. Estudiando las interacciones de los receptores del ABA PYR/PYL/RCAR con la membrana plasmática hemos encontrado que éstos pueden interaccionar transitoriamente con ella de forma dependiente de calcio gracias a una familia de proteínas con dominios C2 relacionadas con la ruta de señalización de ABA (denominadas C2-domain ABA-related (CAR) proteins). Específicamente, se encontró que PYL4 interacciona de manera independiente de ABA con CAR1 tanto en la membrana plasmática como en el núcleo de las células vegetales. La proteína CAR1 pertenece a una familia multigénica constituida por 10 miembros en Arabidopsis thaliana, desde CAR1 hasta CAR10, y que solo se encuentra en plantas. Los ensayos de complementación bi-molecular de fluorescencia y de co-immunoprecipitación confirmaron la interacción en células vegetales tanto de PYL4-CAR1 como de otras parejas de PYR/PYL-CAR. La cristalización de la proteína CAR4 reveló que, además de un dominio C2 clásico de unión a lípidos dependiente de calcio, las proteínas de la familia CAR presentan un dominio específico que probablemente es responsable de la interacción con los receptores PYR/PYL/RCAR y de su posterior reclutamiento a las vesículas de fosfolípidos. Esta interacción es relevante para la función de los receptores PYR/PYL/RCAR en la señalización del ABA, ya que diferentes mutantes triples car de pérdida de función, que tienen afectados los genes CAR1, CAR4, CAR5, y CAR9, demostraron una reducción de la sensibilidad al ABA en ensayos de establecimiento de plántula y crecimiento de la raíz. En resumen, hemos identificado nueva familia de proteínas que son capaces mediar las interacciones transitorias dependientes de Ca2+ con vesículas de fosfolípidos, lo que a su vez afecta localización de PYR/PYL/RCAR y regula positivamente la señalización de ABA. / [CAT] RESUM La senyalització per l'hormona vegetal àcid abcíssic (ABA) exerceix un paper crític en la regulació del creixement de l'arrel i també en l'arquitectura del sistema radical. La promoció del creixement de l'arrel en condicions d'estrés hídric, regulada per ABA és clau per la supervivència de les plantes sota condicions limitants d'aigua. Amb aquest treball, hem investigat el paper dels receptors PYR/PYL/RCAR (PYRABACTIN RESISTANCE1 (PYR1)/PYR1 LIKE (PYL)/ REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS) d'Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) en el camí de senyalització d'ABA en arrel. Així, hem descobert que el receptor d'ABA PYL8 exerceix un paper no redundant en la regulació de la percepció d'ABA en arrel. Inesperadament, donada la naturalesa multigènica i la redundància funcional parcial que s'observa en la família PYR/PYL/RCAR, el mutant pyl8 va ser l'únic mutant senzill de pèrdua de funció dels receptors PYR/PYL/RCAR que mostrava una sensibilitat reduïda a la inhibició del creixement mitjançada per l'ABA en l'arrel. Doncs aquest efecte es deu a la falta d'inhibició regulada per PYL8 de diverses fosfatases del grup A tipus 2C (PP2Cs), ja que PYL8 té la capacitat d'interactuar in vivo almenys amb cinc PP2Cs, anomenades HYPERSENSITIVE TO ABA1 (HAB1), HAB2, ABAINSENSITIVE1 (ABI1), ABI2, and PP2CA/ABAHYPERSENSITIVE GERMINATION3 segons ho han revelat per una banda la purificació per afinitat en tàndem (TAP són les seues sigles en anglés) i per altra banda, estudis proteòmics d'espectrometria de masses. Pel que fa a la transducció del senyal del l'ABA, la qual es localitza en la membrana plasmàtica cel¿lular, juga un paper molt important en els primers instants de la senyalització de la fitohormona, no obstant això els mecanismes moleculars que uneixen els components bàsics d'aquesta senyalització amb la membrana plasmàtica, no es troben del tot clars. Per tant, s'han estudiat les interaccions que tenen els receptors del ABA PYR/PYL/RCAR amb la membrana plasmàtica, i hem trobat que aquests tenen la capacitat d'interaccionar transitòriament amb la membrana de forma dependent al calci, gràcies a una família de proteïnes amb domini C2, les quals es troben relacionades amb la ruta de senyalització d'ABA(anomenades C2domain ABArelated (CAR) proteins).Específicament, es va trobar que PYL4 interacciona d'una manera independent al ABA amb CAR1, tant en la membrana plasmàtica, com en el nucli de les cèl¿lules vegetals. La proteïna CAR1 pertany a la família multigènica constituïda per 10 components en Arabidopsis thaliana, des de CAR1 fins CAR10, que tan sols es troba en plantes. Els assajos de complementació bimolecular de fluorescència i de co-immunoprecipitació, van confirmar la interacció en cèl¿lules vegetals, tant de PYL4CAR1 com d'altres parelles de PYR/PYL-CAR. La cristal¿lització de la proteïna CAR4 va revelar que, a més d'un domini C2 clàssic de unió a lípids dependent del calci, les proteïnes de la família CAR presenten un domini PYR/PYL/RCAR, i del seu posterior reclutament a les vesícules fosfolipídiques. Doncs, aquesta interacció és rellevant en la funció dels receptors PYR/PYL/RCAR, ja que participa en la senyalització del l'ABA. Aquesta interacció es clau per a la funció dels receptors, ja que diferents mutants triples car de pèrdua de funció, els quals posseïxen afectats els gens CAR1, CAR4, CAR5 i CAR9, van mostrar una reducció de la sensibilitat a l'ABA en assajos d'establiment de plàntula i creixement de l'arrel. En conclusió, hem identificat una nova família de proteïnes amb la capacitat d'organitzar les interaccions transitòries dependents del calci amb vesícules de fosfolípids, fet que al seu torn afecta la localització de PYR/PYL/RCAR i regula positivament la senyalització d'ABA. / Rodríguez Solovey, LN. (2015). IDENTIFICATION OF TARGETS AND AUXILIARY PROTEINS OF PYR/PYL/RCAR ABA RECEPTORS: PROTEIN PHOSPHATASES TYPE 2C (PP2Cs) AND C2-DOMAIN ABA-RELATED PROTEINS (CARs) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58862 / TESIS

[ES] El calcio (Ca2+) es un catión esencial que juega un papel fundamental en todos los organismos vivos. Desde el punto de vista funcional, el Ca2+ actúa como un segundo mensajero que regula distintos procesos celulares. Trabajos anteriores indican que la señalización mediante Ca2+ podría estar implicada en las primeras etapas de la inducción de la embriogénesis in vitro de las plantas, pero el verdadero papel del Ca2+ en este proceso es aún desconocido. Por eso, el principal objetivo de la presente Tesis es el estudio del papel del Ca2+ en la embriogénesis in vitro mediante dos sistemas in vitro: la embriogénesis somática y la embriogénesis de microsporas. Para determinar la importancia de la homeostasis del Ca2+ en la inducción de la embriogénesis y las dinámicas de los niveles de Ca2+ durante la inducción y el establecimiento de embriones somáticos y derivados de microsporas, se utilizaron tratamientos químicos y se detectaron los niveles de Ca2+ mediante sondas fluorescentes y sensores cameleon codificados genéticamente, visualizados con microscopía fluorescente y confocal. Observamos que el aumento de Ca2+ es un marcador temprano en la inducción de la embriogénesis in vitro y que los niveles de Ca2+ durante la embriogénesis in vitro son dinámicos en todos los sistemas estudiados. Además, las oscilaciones en los niveles de Ca2+ podrían estar relacionadas con los procesos de diferenciación que ocurren en las células inducidas una vez une el Ca2+ a la calmodulina. Mostramos que un aumento de Ca2+ dentro de un rango definido de concentración tiene un efecto positivo, dependiendo del sistema, en la producción de embriones, siendo más sensibles aquellos sistemas basados en suspensiones de células aisladas que aquellos que usan tejidos como explantes. Finalmente, estudiamos el papel de la calosa durante la embriogénesis somática, observando que la inhibición de la deposición de calosa impide el desarrollo embrionario, lo que sugiere una relación entre la formación de una barrera de calosa y el establecimiento de la identidad embrionaria en las células somáticas. / [CAT] El calci (Ca2+) és un catió essencial que juga un paper fonamental en tots els organismes vius. Des del punt de vista funcional, el Ca2+ actua com a un segon missatger que regula diferents processos cel·lulars. Treballs anteriors indiquen que la senyalització mitjançant el Ca2+ podria estar implicada en les primeres etapes de la inducció de l'embriogènesi in vitro de les plantes, però el paper real del Ca2+ en aquest procés encara és desconegut. Per això, el principal objectiu de la present Tesi és l'estudi del paper del Ca2+ en l'embriogènesi in vitro mitjançant dos sistemes in vitro: l'embriogènesi somàtica i l'embriogènesi de micròspores. Per tal de determinar la importància de l'homeòstasi del Ca2+ en la inducció de l'embriogènesi i les dinàmiques dels nivells de Ca2+ durant la inducció i l'establiment d'embrions somàtics i derivats de micròspores, es van utilitzar tractaments químics i es van detectar els nivells de Ca2+ mitjançant sondes fluorescents i sensors de cameleon codificats genèticament, visualitzats amb microscòpia fluorescent i confocal. Vam observar que l'augment de Ca2+ és un marcador primerenc en la inducció de l'embriogènesi in vitro i que els nivells de Ca2+ durant l'embriogènesi in vitro són dinàmics en tots els sistemes estudiats. A més, les oscil·lacions en els nivells de Ca2+ podrien estar relacionades amb els processos de diferenciació que tenen lloc en les cèl·lules induïdes una vegada uneix el Ca2+ a la calmodulina. Vam mostrar que un augment de Ca2+ dins d'un rang definit de concentració té un efecte positiu, depenent del sistema, en la producció d'embrions, essent més sensibles aquells sistemes basats en suspensions de cèl·lules aïllades que aquells que usen teixits com a explants. Finalment, vam estudiar el paper de la cal·losa durant l'embriogènesi somàtica, i vam observar que la inhibició de la deposició de cal·losa impedeix el desenvolupament embrionari, la qual cosa suggereix una relació entre la formació d'una barrera de cal·losa i l'establiment de la identitat embrionària en les cèl·lules somàtiques. / [EN] Calcium (Ca2+) is an essential cation that plays fundamental roles in all living organisms. From a functional point of view, Ca2+ acts as a second messenger that regulates different cellular processes. Previous works point to the fact that Ca2+ signaling may be involved in the early stages of induction of in vitro plant embryogenesis, but the actual role of Ca2+ in this process remained unveiled. Thus, the main goal of the present Thesis is to study the role of Ca2+ in in vitro embryogenesis using two in vitro systems: somatic embryogenesis and microspore embryogenesis. Chemical treatments and detection of Ca2+ with fluorescent probes and genetically-encoded cameleon sensors imaged by fluorescence and confocal microscopy were performed to determine the importance of Ca2+ homeostasis for induction of embryogenesis and the dynamics of Ca2+ levels during the induction and establishment of somatic and microspore-derived embryos. We observed that Ca2+ increase is an early marker of induction of in vitro embryogenesis and Ca2+ levels during in vitro embryogenesis are dynamic in all the systems we studied. Moreover, Ca2+ oscillations might be related to the differentiation processes that take place in the induced cells upon binding to calmodulin. We showed that Ca2+ increase within a defined range has system-specific positive effects in embryo yield, being more sensitive those systems using isolated cell suspensions rather than those using tissues as explants. Finally, we studied the role of callose during somatic embryogenesis, and we observed that inhibiting callose deposition prevents embryo development, which suggests a relationship between the formation of a callose barrier and the establishment of embryo identity in somatic cells. / Calabuig Serna, A. (2023). Multidisciplinary study of the role of calcium in plant in vitro embryogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196022