Plant breeding is focused on selection of new genotypes with improved traits. Conventional methods based on hybridization and those based on biotechnology (somatic hybridization, genetic transformation, ploidy manipulation, etc.) are used to create novel genetic variations. Biotechnology provides powerful tools for plant breeding, for instance, haploid technology allows achievement of homozygous lines from heterozygous parents in one step, which reduces significantly the time required by conventional methods. Concerning woody species, characterized by self-incompatibility, long juvenile period and high degree of heterozygosity, this technique is the only way to get homozygous lines. Haploid plants are of great interest for breeding and genomic studies, being used in mutation research, genetic analysis, genome mapping and gene transfer. Gametic embryogenesis, based on cellular totipotency, produces an embryo from an immature gamete, by switching its developmental pathway from gametophytic to sporophytic. This research is focused on inducing gametic embryogenesis in two important Mediterranean fruit crops: almond (Prunus dulcis Mill.) via in vitro anther culture and mandarin (Citrus reticulata Blanco) via isolation and microspore culture. Also ploidy manipulation was applied to loquat (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) for getting genotypes whit different ploidy levels. The experiments were carried out through years 2014, 2015 and 2016 at the 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) as well as at the 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Regarding the almond anther culture, formation of calli and production of embryos was achieved through the direct embryogenesis route. On then other hand, early embryo regeneration is reported, for the first time, from isolated microspore culture of mandarin, 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Our results report the evidence of gametic embryogenesis and the production of homozygous regenerants in almond and mandarin, two species extremely recalcitrant to microspore embryogenesis. However, the results are affected by many factors that need further studies to better understand the embryogenic development and to increase the rate of embryo achievement. Moreover, another biotechnological tool (ploidy manipulation) was also applied for implementing the IVIA loquat breeding program. Polyploid plants are of great interest in this species, due to its potential for producing seedless genotypes via direct use of triploids or crosses between tetra and diploids. Aimed at obtaining new loquat genotypes, with different ploidy levels (polyploids), colchicine was applied to seeds before germination, to induce chromosome duplication. A total of three triploids (3x) and one tetraploid (4x) were obtained. / La mejora genética tiene como objetivo la selección de nuevos genotipos con mejores características. Los métodos de mejora convencional basados en hibridaciones y aquellos basados en Biotecnología (hibridación somática, transformación genética, manipulación de la ploidía, etc.) se utilizan para obtener nueva variación genética. La Biotecnología proporciona herramientas poderosas en mejora genética, por ejemplo, la obtención de haploides permite obtener líneas homocigotas en un solo paso, disminuyendo significativamente el tiempo requerido usando métodos convencionales. Respecto a especies leñosas, caracterizadas por autoincompatibilidad floral, largo período juvenil y alto grado de heterocigosidad, esta técnica es el único método de obtención de líneas homocigotas. Los genotipos haploides tienen un alto interés en estudios genómicos, siendo utilizados en estudios de mutaciones, análisis genéticos, mapeo genético y transferencia genética. Este estudio tiene como objetivo la inducción de embriogénesis gamética en dos especies mediterráneas muy importantes: el almendro (Prunus dulcis Mill.) por medio de cultivo in vitro de anteras y el mandarino (Citrus reticulata Blanco) por medio de aislamiento de microesporas. Además, se ha estudiado la obtención de poliploides en níspero (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) con el objetivo de obtener genotipos con diversos niveles de ploidía. Los experimentos se llevaron a cabo en los años 2014, 2015 y 2016 en la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) y en el 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Respecto al cultivo de anteras en almendro, la formación de callos y producción de embriones se obtuvo mediante embriogénesis directa. Por otro lado, se ha conseguido regenerar por primera vez embriones a partir de microesporas aisladas en el cultivar de mandarino 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Los resultados obtenidos muestran que la embriogénesis gamética y la regeneración de embriones homocigótos en almendro y mandarino, dos especies extremadamente recalcitrantes para la embriogenésis a partir de microesporas, es posible. Sin embargo, los resultados se ven afectados por muchos factores que necesitan estudios adicionales para comprender mejor el desarrollo embriogénico y para aumentar la tasa de obtención del embriones. Además, otra herramienta biotecnológica (manipulación de la ploidía) se aplicó con el objetivo de implementar el programa de mejora de níspero del IVIA. Las plantas poliploides en esta especie tienen un alto interés, pues podrían permitir la obtención de frutos sin semilla, por medio de la obtención directa de triploides o mediante cruzamiento entre tetraploides y diploides. Con el objetivo de obtener nuevos genotipos de níspero con diferentes niveles de ploidía (poliploides), se aplicó colchicina a semillas sin germinar con el fin de inducir la duplicación cromosómica y se obtuvieron 3 triploides (3x) y un tetraploide (4x). / La millora genètica té com objectiu la selecció de nous genotips amb millors característiques. Els mètodes de millora convencional basats en hibridacions i aquells basats en Biotecnologia (hibridació somàtica, transformació genètica, manipulació de la ploïdia, etc.) s'utilitzen per aconseguir nova variació genètica. La Biotecnologia proporciona eines poderoses en millora genètica, per exemple, l'obtenció d'haploides permet obtenir línies homozigòtiques en un sol pas, disminuint significativament el temps requerit usant mètodes convencionals. Pel que fa a espècies llenyoses, caracteritzades per autoincompatibilitat floral, llarg període juvenil i alt grau d'heterozigosi, aquesta tècnica és l'únic mètode d'obtenció de línies homozigòtiques. Els genotips haploides tenen un alt interès en estudis genòmics, sent utilitzats en estudis de mutacions, anàlisis genètics, mapatge genètic i transferència genètica. Aquest estudi té com objectiu la inducció d'embriogènesi gamètica en dos espècies mediterrànies molt importants: l'ametller (Prunus dulcis Mill.) a través del cultiu in vitro d'anteres i el mandariner (Citrus reticulata Blanco) per mitjà d'aïllament de micròspores. A més a més, s'ha estudiat l'obtenció de poliploides en nespra (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) Amb l'objectiu d'aconseguir genotips amb diversos nivells de ploïdia. Els experiments es van dur a terme en els anys 2014, 2015 i 2016 a la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) i a 'l'Institut Valencià d'Investigacions Agràries' (IVIA). Respecte al cultiu d'anteres en ametller, la formació de calls i producció d'embrions es va obtenir mitjançant embriogènesi directa. D'altra banda, s'ha aconseguit per primera vegada la regeneració d'embrions a partir de micròspores aïllades en el conrear de mandariner 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Els resultats obtinguts mostren que l'embriogènesi gamètica i la regeneració d'embrions homozigotics en ametller i mandariner, dues espècies extremadament recalcitrants per l'embriogènesi a partir de micròspores, és possible. No obstant això, els resultats es veuen afectats per molts factors que necessiten estudis addicionals per entendre millor el desenvolupament embriogènic i per augmentar la taxa d'obtenció dels embrions. A més, una altra eina biotecnològica (manipulació de la ploïdia) es va aplicar amb l'objectiu d'implementar el programa de millora de nespra de l'IVIA. Les plantes poliploides en aquesta espècie tenen un alt interès, ja que podrien permetre l'obtenció de fruits sense llavor, per mitjà de l'obtenció directa de triploides o mitjançant encreuament entre tetraploides i diploides. Amb l'objectiu d'aconseguir nous genotips de nespra amb diferents nivells de ploïdia (poliploides), es va aplicar colquicina a llavors sense germinar per tal d'induir la duplicació cromosòmica i es van obtenir 3 triploides (3x) i un tetraploide (4x). / Cimò, G. (2017). Ploidy manipulation for genetic improvement in some Mediterranean fruit crops [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79874 / TESIS

[ES] Los dobles haploides son una gran herramienta para la mejora genética de híbridos debido a que se puede alcanzar la homocigosis completa en una sola generación. Entre las técnicas usadas para obtener estas plantas, la inducción de la embriogénesis de microsporas, mediante el cultivo de anteras o de microsporas, es la más eficiente y la más usada. La embriogénesis de microsporas es también un ejemplo de totipotencia de las células vegetales gracias a su habilidad de reprogramar su desarrollo gametofítico hacia una ruta esporofítica, donde las células proliferan de forma organizada para crear un nuevo organismo. Como en muchos otros procesos in vitro, las condiciones de cultivo deben ser optimizadas para incrementar la eficiencia. En la presente Tesis Doctoral, hemos usado dos especies como sistemas experimentales para estudiar y optimizar el cultivo de microsporas. Por un lado, usamos berenjena (Solanum melongena) como un ejemplo de cultivo de importancia económica en el que los protocolos todavía tienen mucho margen de mejora. La optimización de la densidad celular y los reguladores de crecimiento han demostrado ser útiles para modificar la eficiencia del cultivo de microsporas de berenjena. Por otra parte, hemos utilizado el cultivo de microsporas de Brassica napus para estudios básicos puesto que ha sido ampliamente usado como modelo para entender procesos celulares que ocurren durante este cambio en el desarrollo. Se detalla un protocolo estandarizado para el cultivo de microsporas de B. napus, el cual ha sido utilizado en todos los cultivos en esta Tesis para explorar una serie de procesos y estructuras celulares potencialmente implicados en el cambio de desarrollo hacia embriogénesis. Estos procesos incluyen estrés del retículo endoplásmico, muerte celular programada, autofagia y estructura y composición de la pared celular. Estudiamos en paralelo el cultivo de microsporas de dos genotipos de B. napus con diferente respuesta androgénica en condiciones estándar y añadiendo Tricostatina A, un modulador epigenético que ha mostrado ser beneficioso para la respuesta androgénica en algunos casos. En conjunto, esta Tesis representa un avance en la optimización del cultivo de microsporas en estas especies y arroja luz sobre el papel de algunos procesos en el contexto de embriogénesis de microsporas. / [CA] Els dobles haploides són una gran eina en millora vegetal per a la producció d'híbrids, a causa de la seua total homozigosi, que es pot aconseguir en només una generació in vitro. Entre les diverses tècniques que s'utilitzen per tal d'obtenir aquestes plantes, la inducció de l'embriogènesi de microspores, mitjançant cultiu d'anteres o microspores, és la més comuna i eficient. L'embriogènesi de microspores també és un exemple de la totipotència de les cèl·lules vegetals, capaços de reprogramar-se d'una via gametofítica a una via esporofítica, on proliferen de manera organitzada per crear un nou organisme. Com en moltes altres tecniques in vitro, s'han d'optimitzar les condicions del cultiu per tal d'augmentar l'eficiència. En la present Tesi Doctoral, hem utilitzat dues espècies de plantes com a sistemes experimentals per estudiar i optimitzar el cultiu de microspores. Per una banda, hem utilitzat l'albergínia (Solanum melongena) com a exemple de cultiu d'importància econòmica on els protocols encara tenen marge per a l'optimització. La optimització de la densitat de cèl·lules en cultiu i la concentració de reguladors de creixement van demostrar ser útils per modificar l'eficiència de la resposta dels cultius de microspores d'albergínia. D'altra banda, hem utilitzat cultius de microspores de Brassica napus principalment per a estudis bàsics, ja que s'utilitza àmpliament com a model per entendre els processos cel·lulars que es produeixen durant aquest canvi de desenvolupament. Es detalla un protocol estandarditzat per al cultiu de microspores de B. napus, que s'ha utilitzat en tots els cultius inclosos en aquesta Tesi per explorar una sèrie de processos i estructures cel·lulars potencialment implicades en el canvi de desenvolupament cap a l'embriogènesi. Aquests inclouen l'estrès del reticle endoplasmàtic, la mort cel·lular programada, l'autofàgia i l'estructura i composició de la paret cel·lular. Vam estudiar en paral·lel cultius de microspores de dos genotips de B. napus amb diferent resposta androgènica, cultivats en condicions estàndard i afegint-hi Tricostatina A, un modulador epigenètic que s¿ha demostrat beneficiós per a la resposta androgènica en alguns casos. En conjunt, aquesta Tesi representa un avanç en l'optimització dels cultius de microsporas en aquestes espècies i aporta llum sobre el paper d'alguns processos en el context de l'embriogènesi de microspores. / [EN] Doubled haploids are a great tool for hybrid breeding due to their complete homozygosity achievable in only one in vitro generation. Among the several techniques used to obtain these plants, induction of microspore embryogenesis, via anther or microspore culture, is the most common and efficient approach. Microspore embryogenesis is also an example of totipotency of plant cells due to their ability to reprogram themselves from a gametophytic to a sporophytic pathway, where cells proliferate in an organized way to create a new organism. As in many other in vitro procedures, culture conditions must be optimized in order to increase efficiency. In the present Doctoral Thesis, we used two plant species as experimental systems to study and optimize microspore culture. On one hand, we used eggplant (Solanum melongena) as an example of economically important crop where protocols have still room for optimization. Optimization of cell density and growth regulators demonstrated to be useful to modify the efficiency of eggplant microspore cultures. On the other hand, we used B. napus microspore cultures principally for basic studies since it is widely used as a model to understand cellular processes occurring during this developmental switch. A standardized protocol for Brassica napus microspore culture is detailed, which was used in all the cultures included in this Thesis to explore a series of processes and cellular structures potentially involved in the developmental switch towards embryogenesis. These included endoplasmic reticulum stress, programmed cell death, autophagy, and cell wall structure and composition. We studied in parallel microspore cultures from two B. napus genotypes with different androgenic response cultured in standard conditions and adding Trichostatin A, a epigenetic modulator shown to be beneficial for the androgenic response in some cases. Together, this Thesis represents an advance in the optimization of microspore cultures in these species, and sheds light on the role of some processes within the context of microspore embryogenesis. / Thanks are due to the Electron Microscopy Service of Universitat Politècnica de València, Marisol Gascón (IBMCP Microscopy Service). This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MICINN jointly funded by FEDER and by a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (656579) to PC-M This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MINECO jointly funded by FEDER. / Camacho Fernández, C. (2021). Microspore embryogenesis: cell wall dynamics and reprogramming of cell fate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/163698 / TESIS

[ES] El calcio (Ca2+) es un catión esencial que juega un papel fundamental en todos los organismos vivos. Desde el punto de vista funcional, el Ca2+ actúa como un segundo mensajero que regula distintos procesos celulares. Trabajos anteriores indican que la señalización mediante Ca2+ podría estar implicada en las primeras etapas de la inducción de la embriogénesis in vitro de las plantas, pero el verdadero papel del Ca2+ en este proceso es aún desconocido. Por eso, el principal objetivo de la presente Tesis es el estudio del papel del Ca2+ en la embriogénesis in vitro mediante dos sistemas in vitro: la embriogénesis somática y la embriogénesis de microsporas. Para determinar la importancia de la homeostasis del Ca2+ en la inducción de la embriogénesis y las dinámicas de los niveles de Ca2+ durante la inducción y el establecimiento de embriones somáticos y derivados de microsporas, se utilizaron tratamientos químicos y se detectaron los niveles de Ca2+ mediante sondas fluorescentes y sensores cameleon codificados genéticamente, visualizados con microscopía fluorescente y confocal. Observamos que el aumento de Ca2+ es un marcador temprano en la inducción de la embriogénesis in vitro y que los niveles de Ca2+ durante la embriogénesis in vitro son dinámicos en todos los sistemas estudiados. Además, las oscilaciones en los niveles de Ca2+ podrían estar relacionadas con los procesos de diferenciación que ocurren en las células inducidas una vez une el Ca2+ a la calmodulina. Mostramos que un aumento de Ca2+ dentro de un rango definido de concentración tiene un efecto positivo, dependiendo del sistema, en la producción de embriones, siendo más sensibles aquellos sistemas basados en suspensiones de células aisladas que aquellos que usan tejidos como explantes. Finalmente, estudiamos el papel de la calosa durante la embriogénesis somática, observando que la inhibición de la deposición de calosa impide el desarrollo embrionario, lo que sugiere una relación entre la formación de una barrera de calosa y el establecimiento de la identidad embrionaria en las células somáticas. / [CAT] El calci (Ca2+) és un catió essencial que juga un paper fonamental en tots els organismes vius. Des del punt de vista funcional, el Ca2+ actua com a un segon missatger que regula diferents processos cel·lulars. Treballs anteriors indiquen que la senyalització mitjançant el Ca2+ podria estar implicada en les primeres etapes de la inducció de l'embriogènesi in vitro de les plantes, però el paper real del Ca2+ en aquest procés encara és desconegut. Per això, el principal objectiu de la present Tesi és l'estudi del paper del Ca2+ en l'embriogènesi in vitro mitjançant dos sistemes in vitro: l'embriogènesi somàtica i l'embriogènesi de micròspores. Per tal de determinar la importància de l'homeòstasi del Ca2+ en la inducció de l'embriogènesi i les dinàmiques dels nivells de Ca2+ durant la inducció i l'establiment d'embrions somàtics i derivats de micròspores, es van utilitzar tractaments químics i es van detectar els nivells de Ca2+ mitjançant sondes fluorescents i sensors de cameleon codificats genèticament, visualitzats amb microscòpia fluorescent i confocal. Vam observar que l'augment de Ca2+ és un marcador primerenc en la inducció de l'embriogènesi in vitro i que els nivells de Ca2+ durant l'embriogènesi in vitro són dinàmics en tots els sistemes estudiats. A més, les oscil·lacions en els nivells de Ca2+ podrien estar relacionades amb els processos de diferenciació que tenen lloc en les cèl·lules induïdes una vegada uneix el Ca2+ a la calmodulina. Vam mostrar que un augment de Ca2+ dins d'un rang definit de concentració té un efecte positiu, depenent del sistema, en la producció d'embrions, essent més sensibles aquells sistemes basats en suspensions de cèl·lules aïllades que aquells que usen teixits com a explants. Finalment, vam estudiar el paper de la cal·losa durant l'embriogènesi somàtica, i vam observar que la inhibició de la deposició de cal·losa impedeix el desenvolupament embrionari, la qual cosa suggereix una relació entre la formació d'una barrera de cal·losa i l'establiment de la identitat embrionària en les cèl·lules somàtiques. / [EN] Calcium (Ca2+) is an essential cation that plays fundamental roles in all living organisms. From a functional point of view, Ca2+ acts as a second messenger that regulates different cellular processes. Previous works point to the fact that Ca2+ signaling may be involved in the early stages of induction of in vitro plant embryogenesis, but the actual role of Ca2+ in this process remained unveiled. Thus, the main goal of the present Thesis is to study the role of Ca2+ in in vitro embryogenesis using two in vitro systems: somatic embryogenesis and microspore embryogenesis. Chemical treatments and detection of Ca2+ with fluorescent probes and genetically-encoded cameleon sensors imaged by fluorescence and confocal microscopy were performed to determine the importance of Ca2+ homeostasis for induction of embryogenesis and the dynamics of Ca2+ levels during the induction and establishment of somatic and microspore-derived embryos. We observed that Ca2+ increase is an early marker of induction of in vitro embryogenesis and Ca2+ levels during in vitro embryogenesis are dynamic in all the systems we studied. Moreover, Ca2+ oscillations might be related to the differentiation processes that take place in the induced cells upon binding to calmodulin. We showed that Ca2+ increase within a defined range has system-specific positive effects in embryo yield, being more sensitive those systems using isolated cell suspensions rather than those using tissues as explants. Finally, we studied the role of callose during somatic embryogenesis, and we observed that inhibiting callose deposition prevents embryo development, which suggests a relationship between the formation of a callose barrier and the establishment of embryo identity in somatic cells. / Calabuig Serna, A. (2023). Multidisciplinary study of the role of calcium in plant in vitro embryogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196022