La androgénesis es un proceso experimental que permite la obtención de líneas puras doble haploides a través de embriogénesis o callogénesis inducida partiendo, en la mayoría de los casos, del gametófito masculino (polen bicelular joven) o en la mayoría de los casos, su precursor, la microspora. Desde una perspectiva biotecnológica, esta posibilidad adquiere gran relevancia, pues las líneas puras son la base del proceso de obtención de semilla híbrida, y este proceso permite reducir a una sola generación, las 8 o 9 generalmente necesarias en el caso de utilizar métodos de mejora genética clásica para obtener las líneas puras. En la presente Tesis Doctoral se aborda el estudio de la inducción de androgénesis aplicando en paralelo dos abordajes: uno básico, mediante el estudio de factores que influyen y cambios que tienen lugar en la microspora al ser inducida, y uno aplicado, orientado a mejorar la eficiencia de inducción en especies recalcitrantes. El estudio se lleva a cabo en tres especies: la colza (Brassica napus), utilizada como sistema modelo para el estudio básico, y dos recalcitrantes, tomate (Solanum Lycopersicum), y berenjena (Solanum melongena). En resumen, mediante los estudios planteados en esta Tesis, se pretende conocer mejor algunos de los procesos de la androgénesis mediante su estudio en especies modelo como la colza, y recalcitrantes como el tomate. Además se pretende mejorar la eficiencia de la obtención de doble haploides en berenjena, desarrollando un método eficiente de cultivo de microsporas aisladas de berenjena. / Corral Martínez, P. (2013). Obtención de doble haploides en especies de interés agronómico: análisis de agentes y mecanismos celulares implicados en la inducción androgénica en berenjena, colza y tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31643 / TESIS

Tesis por compendio / Androgenesis induction is an experimental procedure by which microspores are diverted from their original gametophytic pathway towards embryogenesis by applying specific stresses in vitro. It allows for the production of doubled haploid (DH) pure lines through anther culture or isolated microspore culture followed by chromosome doubling. DH technology is interesting for both basic research and plant breeding. In this Thesis, we studied microspore embryogenesis with two parallel approaches: (I) an applied study directed to the development of the first eggplant (Solanum melongena) highly embryogenic line and the improvement of the efficiency of eggplant microspore cultures; and (II) a fundamental research study focused on the relationship between microspore embryogenesis ability, intracellular Ca2+ levels and the dynamics of callose and cellulose deposition for cell wall formation in microspore-derived structures, using rapeseed (Brassica napus) as a model species. As an applied research, we developed and evaluated an eggplant DH population from a commercial hybrid, and identified and characterized the first eggplant highly androgenic DH line (DH36), which may be used to facilitate the study of eggplant androgenesis and for both basic and applied research. In addition, we evaluated different factors involved in microspore embryogenesis induction efficiency in eggplant and optimized the regeneration protocol for DH production via microspore culture. Together, the applied research on eggplant microspore embryogenesis made in this Thesis resulted in the most efficient protocol existing to date for DH production in eggplant. As a fundamental research, we studied the dynamics of Ca2+ during in vivo microsporogenesis and microgametogenesis, as well as during the first stages of in vitro-induced microspore embryogenesis, establishing a link between microspore embryogenesis and changes in Ca2+ levels and subcellular distribution. In addition, we studied the deposition of callose and cellulose during the first stages of microspore embryogenesis and demonstrated that the abnormally increased callose deposition and the inhibition of cellulose deposition observed in embryogenic microspores is most likely caused by a transient increase in the intracellular Ca2+ levels that occurs right after microspore induction. We also found that this particular dynamics of callose and cellulose deposition is related to microspore embryogenesis ability, and is essential for proper progression and success of microspore embryogenesis. In summary, the research made in this Thesis helps to further understand the basis underlying microspore embryogenesis and cell totipotency, and to apply the powerful DH technology to an economically important crop such as eggplant. / La inducción de androgénesis es un procedimiento experimental en el cual las microsporas se desvían de su vía gametofítica original hacia embriogénesis, mediante la aplicación de estreses específicos in vitro. Este fenómeno permite la producción de líneas puras dobles haploides (DH) mediante cultivo de anteras o cultivo de microsporas aisladas seguidos de duplicación cromosómica. La tecnología DH es interesante tanto para la investigación básica como para su aplicación a la mejora genética vegetal. En esta Tesis se estudia la embriogénesis de microsporas y la obtención de DHs con dos enfoques paralelos: (I) un estudio aplicado dirigido al desarrollo de la primera línea de berenjena (Solanum melongena) con alta respuesta androgénica y a la mejora de la eficiencia de los cultivos de microsporas de berenjena; y (II) un estudio de investigación básica centrado en la relación entre la habilidad para la embriogénesis de microsporas, los niveles intracelulares de Ca2+ y la dinámica de la deposición de calosa y celulosa para la formación de paredes celulares en estructuras derivadas de microsporas, utilizando como especie modelo la colza (Brassica napus). Como investigación aplicada, se desarrolló y evaluó una población DH de berenjena a partir de un híbrido comercial, y se identificó y caracterizó la primera línea DH altamente androgénica de berenjena (DH36), que puede usarse para facilitar el estudio de la androgénesis en berenjena y para otros estudios aplicados o básicos. Además, se evaluaron diferentes factores implicados en la eficiencia de la inducción de embriogénesis de microsporas en berenjena, y se optimizó el protocolo de regeneración para la producción de DH mediante cultivo de microsporas. En conjunto, la investigación aplicada sobre la embriogénesis de microsporas realizada en esta Tesis proporciona el protocolo más eficiente existente hasta la fecha para la producción de DH en berenjena. Como investigación fundamental, se estudió la dinámica del Ca2+ durante la microsporogénesis y la microgametogénesis in vivo, así como durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas inducida in vitro, y se estableció un vínculo entre la embriogénesis de microsporas y los cambios en el nivel y distribución intracelular de Ca2+. Además, se estudió la deposición de calosa y celulosa durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas y se demostró que la excesiva deposición de calosa y la inhibición de la deposición de celulosa, exclusivas de las microsporas embriogénicas, están causadas por el aumento transitorio de Ca2+ intracelular que se produce justo tras la inducción. Hemos demostrado que esta particular dinámica de la deposición de calosa y celulosa está relacionada con la capacidad androgénica, y que es fundamental para la correcta progresión y éxito de la embriogénesis de microsporas. En resumen, la investigación realizada en esta Tesis ayuda a comprender mejor la base de la embriogénesis de microsporas y de la totipotencia celular, y a aplicar la potente tecnología DH a un cultivo económicamente importante como es la berenjena. / La inducció d'androgènesi és un procediment experimental en el qual les microspores es desvien de la seua via gametofítica original cap a un nou destí embriogènic, mitjançant l'aplicació d'estressos específics in vitro. Aquest fenomen permet la producció de línies pures dobles haploides (DH) mitjançant cultiu d'anteres o cultiu de microsporas aïllades seguits de duplicació cromosòmica. La tecnologia DH és interessant tant per a la recerca bàsica com per a la seua aplicació a la millora genètica vegetal. En aquesta Tesi s'estudia l'embriogènesi de microspores i l'obtenció de DHs amb dos enfocaments paral·lels: (I) un estudi aplicat dirigit al desenvolupament de la primera línia d'albergina (Solanum melongena) amb alta resposta androgènica i a la millora de l'eficiència dels cultius de microspores d'albergina; i (II) un estudi de recerca bàsica centrat en la relació entre la capacitat per a l'embriogènesi de microspores, els nivells intracel·lulars de Ca2+ i la dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa per a la formació de parets cel·lulars en estructures derivades de microsporas, utilitzant com a espècie model la colza (Brassica napus). Com a recerca aplicada, es va desenvolupar i avaluar una població DH d'albergina a partir d'un híbrid comercial, i es va identificar i caracteritzar la primera línia DH altament androgènica d'albergina (DH36), que pot usar-se per a facilitar l'estudi de l'androgènesi en albergina i per a altres estudis aplicats o bàsics. A més, es van avaluar diferents factors implicats en l'eficiència de la inducció d'embriogènesi de microspores en albergina, i es va optimitzar el protocol de regeneració per a la producció de DH mitjançant cultiu de microspores. En conjunt, la recerca aplicada sobre l'embriogènesi de microspores realitzada en aquesta Tesi proporciona el protocol més eficient existent fins avui per a la producció de DH en albergina. Com a recerca fonamental, es va estudiar la dinàmica del Ca2+ durant la microsporogènesi i la microgametogènesi in vivo, així com durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores induïda in vitro, i es va establir un vincle entre l'embriogènesi de microspores i els canvis en el nivell i distribució intracel·lular de Ca2+. A més, es va estudiar la deposició de cal·losa i cel·lulosa durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores i es va demostrar que l'excessiva deposició de cal·losa i la inhibició de la deposició de cel·lulosa, exclusives de les microspores embriogèniques, estan causades per l'increment transitori del Ca2+ intracel·lular que es produeix just després de la inducció. Hem demostrat que aquesta particular dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa està relacionada amb la capacitat androgènica, i que és fonamental per a la correcta progressió i èxit de l'embriogènesi de microspores. En resum, la recerca realitzada en aquesta Tesi ajuda a comprendre millor la base de l'embriogènesi de microspores i de la totipotència cel·lular, i a aplicar la potent tecnologia DH a un cultiu econòmicament important com és l'albergina. / Rivas Sendra, A. (2017). Calcium and cell wall dynamics during microspore embryogenesis and double haploid production in rapeseed and eggplant [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/85548 / TESIS / Compendio

La embriogénesis derivada de microsporas es la ruta androgénica más empleada para la obtención de individuos dobles haploides (DHs), 100% homocigotos, que pueden ser utilizados como líneas puras. Este proceso es una alternativa biotecnológica a los programas clásicos de mejora que permite reducir el tiempo y los recursos necesarios para la obtención de híbridos comerciales. Gracias a los avances realizados en los últimos 30 años, hay determinadas especies que pueden ser consideradas modelo debido a la elevada eficiencia que presentan en la obtención de individuos DHs. Sin embargo, aun existen muchas especies, interesantes desde un punto de vista agrícola y comercial, que permanecen recalcitrantes a la embriogénesis de microsporas. Debido al elevado potencial biotecnológico de esta técnica es fundamental mejorar el proceso en este tipo de especies en las que la androgénesis no está puesta a punto. Para ello es esencial realizar estudios en los que se combine un enfoque más aplicado, tratando de conseguir las condiciones experimentales más adecuadas, y en paralelo, un enfoque más básico, orientado a investigar las bases de la reprogramación de las microsporas y de este modo, tener una mayor posibilidad de influir en el proceso. En esta Tesis se han empleado ambos enfoques, empleando la colza como especie modelo y el pimiento como especie recalcitrante a la androgénesis. En pimiento, el estudio de factores clave para la inducción de la androgénesis nos ha permitido optimizar un protocolo de cultivo de anteras aplicable a diferentes genotipos. Proponemos el uso combinado de la relación sépalo/yema (80-90% de la yema cubierta por los sépalos) junto con la pigmentación de las anteras (extremo apical morado) como marcadores morfológicos fiables y fáciles de medir para determinar qué yemas y anteras contienen las microsporas en su estadio idóneo para la inducción. También se ha demostrado que la presencia de callos de origen somático es más dependiente de las condiciones de cultivo que del genotipo, lo cual nos ha permitido obtener un protocolo que reduzca la presencia de estos callos e incremente el número de embriones obtenidos. En los estudios de investigación básica realizados con colza, el uso de la fijación por alta presión combinada con la criosustitución ha permitido observar cambios ultraestructurales en las microsporas inducidas nunca antes descritos. Se ha estudiado la arquitectura y composición de las paredes celulares que se forman de novo en las microsporas embriogénicas y se han observado paredes celulares incompletas y deformes que podrían estar favoreciendo fenómenos de fusión nuclear, que a su vez da lugar a la duplicación cromosómica típica de los DHs. Se ha comprobado que estas paredes presentan elevados niveles de calosa y ausencia de celulosa. También se ha estudiado la arquitectura de diferentes orgánulos presentes en las microsporas recién inducidas y se ha demostrado que los plastidios presentes en las microsporas embriogénicas actúan como plastolisomas. Estos estudios ultraestructurales han servido para extraer dos nuevos marcadores de embriogénesis: la presencia de calosa en las nuevas paredes y en las placas celulares en formación y plastolisomas que posiblemente actúen como parte de un mecanismo más general de limpieza del citoplasma, en paralelo a la reprogramación. / Parra Vega, V. (2015). Aspectos básicos y aplicados de la inducción de embriogénesis en microsporas de pimiento y colza [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48518 / TESIS

[ES] El calcio (Ca2+) es un catión esencial que juega un papel fundamental en todos los organismos vivos. Desde el punto de vista funcional, el Ca2+ actúa como un segundo mensajero que regula distintos procesos celulares. Trabajos anteriores indican que la señalización mediante Ca2+ podría estar implicada en las primeras etapas de la inducción de la embriogénesis in vitro de las plantas, pero el verdadero papel del Ca2+ en este proceso es aún desconocido. Por eso, el principal objetivo de la presente Tesis es el estudio del papel del Ca2+ en la embriogénesis in vitro mediante dos sistemas in vitro: la embriogénesis somática y la embriogénesis de microsporas. Para determinar la importancia de la homeostasis del Ca2+ en la inducción de la embriogénesis y las dinámicas de los niveles de Ca2+ durante la inducción y el establecimiento de embriones somáticos y derivados de microsporas, se utilizaron tratamientos químicos y se detectaron los niveles de Ca2+ mediante sondas fluorescentes y sensores cameleon codificados genéticamente, visualizados con microscopía fluorescente y confocal. Observamos que el aumento de Ca2+ es un marcador temprano en la inducción de la embriogénesis in vitro y que los niveles de Ca2+ durante la embriogénesis in vitro son dinámicos en todos los sistemas estudiados. Además, las oscilaciones en los niveles de Ca2+ podrían estar relacionadas con los procesos de diferenciación que ocurren en las células inducidas una vez une el Ca2+ a la calmodulina. Mostramos que un aumento de Ca2+ dentro de un rango definido de concentración tiene un efecto positivo, dependiendo del sistema, en la producción de embriones, siendo más sensibles aquellos sistemas basados en suspensiones de células aisladas que aquellos que usan tejidos como explantes. Finalmente, estudiamos el papel de la calosa durante la embriogénesis somática, observando que la inhibición de la deposición de calosa impide el desarrollo embrionario, lo que sugiere una relación entre la formación de una barrera de calosa y el establecimiento de la identidad embrionaria en las células somáticas. / [CAT] El calci (Ca2+) és un catió essencial que juga un paper fonamental en tots els organismes vius. Des del punt de vista funcional, el Ca2+ actua com a un segon missatger que regula diferents processos cel·lulars. Treballs anteriors indiquen que la senyalització mitjançant el Ca2+ podria estar implicada en les primeres etapes de la inducció de l'embriogènesi in vitro de les plantes, però el paper real del Ca2+ en aquest procés encara és desconegut. Per això, el principal objectiu de la present Tesi és l'estudi del paper del Ca2+ en l'embriogènesi in vitro mitjançant dos sistemes in vitro: l'embriogènesi somàtica i l'embriogènesi de micròspores. Per tal de determinar la importància de l'homeòstasi del Ca2+ en la inducció de l'embriogènesi i les dinàmiques dels nivells de Ca2+ durant la inducció i l'establiment d'embrions somàtics i derivats de micròspores, es van utilitzar tractaments químics i es van detectar els nivells de Ca2+ mitjançant sondes fluorescents i sensors de cameleon codificats genèticament, visualitzats amb microscòpia fluorescent i confocal. Vam observar que l'augment de Ca2+ és un marcador primerenc en la inducció de l'embriogènesi in vitro i que els nivells de Ca2+ durant l'embriogènesi in vitro són dinàmics en tots els sistemes estudiats. A més, les oscil·lacions en els nivells de Ca2+ podrien estar relacionades amb els processos de diferenciació que tenen lloc en les cèl·lules induïdes una vegada uneix el Ca2+ a la calmodulina. Vam mostrar que un augment de Ca2+ dins d'un rang definit de concentració té un efecte positiu, depenent del sistema, en la producció d'embrions, essent més sensibles aquells sistemes basats en suspensions de cèl·lules aïllades que aquells que usen teixits com a explants. Finalment, vam estudiar el paper de la cal·losa durant l'embriogènesi somàtica, i vam observar que la inhibició de la deposició de cal·losa impedeix el desenvolupament embrionari, la qual cosa suggereix una relació entre la formació d'una barrera de cal·losa i l'establiment de la identitat embrionària en les cèl·lules somàtiques. / [EN] Calcium (Ca2+) is an essential cation that plays fundamental roles in all living organisms. From a functional point of view, Ca2+ acts as a second messenger that regulates different cellular processes. Previous works point to the fact that Ca2+ signaling may be involved in the early stages of induction of in vitro plant embryogenesis, but the actual role of Ca2+ in this process remained unveiled. Thus, the main goal of the present Thesis is to study the role of Ca2+ in in vitro embryogenesis using two in vitro systems: somatic embryogenesis and microspore embryogenesis. Chemical treatments and detection of Ca2+ with fluorescent probes and genetically-encoded cameleon sensors imaged by fluorescence and confocal microscopy were performed to determine the importance of Ca2+ homeostasis for induction of embryogenesis and the dynamics of Ca2+ levels during the induction and establishment of somatic and microspore-derived embryos. We observed that Ca2+ increase is an early marker of induction of in vitro embryogenesis and Ca2+ levels during in vitro embryogenesis are dynamic in all the systems we studied. Moreover, Ca2+ oscillations might be related to the differentiation processes that take place in the induced cells upon binding to calmodulin. We showed that Ca2+ increase within a defined range has system-specific positive effects in embryo yield, being more sensitive those systems using isolated cell suspensions rather than those using tissues as explants. Finally, we studied the role of callose during somatic embryogenesis, and we observed that inhibiting callose deposition prevents embryo development, which suggests a relationship between the formation of a callose barrier and the establishment of embryo identity in somatic cells. / Calabuig Serna, A. (2023). Multidisciplinary study of the role of calcium in plant in vitro embryogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196022