The aim of this work has been to unravel the influence of the phytohormone ABA in the molecular mechanisms underlying the postharvest dehydration response and the development and ripening of citrus fruit, taking advantage of the spontaneous fruit-specific ABA-deficient 'Pinalate' mutant, which is more prone to dehydration and to develop non-chilling peel pitting (NCPP) than its wild-type 'Navelate' orange. A comparative transcriptomic analysis highlighted the ability of parental fruit to induce early molecular responses aimed to reduce water loss and its detrimental effects. ABA application to mutant fruit modulated relevant transcriptomic changes but did not substantially modify either dehydration rate or NCPP incidence, which suggested that 'Pinalate' mutant could be insensitive to ABA. Therefore, the ABA perception system components in Citrus were identified and their regulation under developmental and stressful conditions was investigated. Minor differences between varieties were found in the CsPYR/PYL/RCAR ABA receptors and the CsSnRK2s downstream protein kinases transcript levels, whereas CsPP2CAs negative regulators accumulation was lower in the mutant fruit. ABA receptors and CsSnRK2s gene expression patterns depended on the tissue, the stress severity and the source of the ABA signal from a developmental or stressful stimulus, whilst CsPP2CAs displayed a consistent pattern. Overall, this work suggest that the ABA-deficient 'Pinalate' fruit may sense ABA although the hormone signal could be impaired because reduced CsPP2CAs levels causing altered water stress response and higher NCPP susceptibility. / Romero Gascón, F. (2012). ABA-deficiency and molecular mechanisms involved in the dehydration response and ripening of citrus fruit [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/18105 / Palancia

This document refers to research whose main objective was to investigate the relationship among hydraulic, chemical and electrical signals in poor tomato plants ABA production. The document is organized into three chapters: The first chapter presents a detailed extracellular measurement protocol of electrical signals in plants and how to associate these measurements to determine gas exchange using the Infrared gas analyzer (IRGA) and turgor pressure using the patch clamp pressure probe (ZIM-probe). The second chapter refers to recording of the action potential generated spontaneously and evoked by electrical stimulation in ABA-deficient tomato, mutant sitiens. The final chapter presents the results for turgor pressure, gas exchange and electrical signals measurements in mutants notabilis and sitiens in the re-irrigated after a period of drought. The possible role of electrical signals in the plant signalling under stress conditions is discussed. The main conclusions related to chapters 1, 2 and 3 were: Measurement of extracellular electrical signals can be performed with gas exchange and turgor pressure measurements using IRGA ZIM-probe equipment; Electrical signals generated spontaneously in sitiens mutants propagate with amplitude and speed higher than in wild plants. Mutant is less responsive to electrical stimulation showing higher excitation threshold and longer refractory period than wild plants; The mutant plants are more responsive electrically to re-irrigation after drought than wild plants. The electrical signals precede changes in gas exchange in all genotypes, post irrigation. The ZIM-probe was not efficient to evaluate the turgor pressure in mutant plants under stress conditions, but is a promising tool for studies involving hydraulic and electrical signalling in wild plants. / O presente documento refere-se a pesquisa cujo principal objetivo foi investigar a relação entre sinais hidráulicos, químicos e elétricos em plantas de tomate deficientes da produção de ABA. O documento foi organizado em três capítulos: O primeiro capítulo apresenta um detalhado protocolo de medição extracelular de sinais elétricos em plantas e como associar estas medições a determinação de trocas gasosas usando o Analisador de gás por infravermelho (IRGA) e pressão de turgor usando a sonda de pressão (ZIM-probe). O segundo capítulo refere-se ao registro de potenciais de ação gerados espontaneamente e evocados por estímulo elétrico em tomateiro deficiente na produção de ABA, mutante sitiens. O último capítulo apresenta os resultados referentes a medições de pressão de turgor, trocas gasosas e sinais elétricos nos mutantes notabilis e sitiens, deficientes na produção de ABA reirrigadas após um período de déficit hídrico. O possível papel dos sinais elétricos na sinalização em plantas em condições de estresse é discutido. As principais conclusões referentes aos capítulos 1, 2 e 3 foram, respectivamente: As plantas mutantes são mais responsivas eletricamente a re-irrigação, após déficit hídrico com que as plantas selvagens. Medições extracelulares de sinais elétricos podem ser realizadas com medidas de trocas gasosas e pressão de turgor utilizando os equipamentos IRGA e ZIM-probe; Sinais elétricos gerados espontaneamente nos mutantes sitiens se propagam com amplitude e velocidade maiores do que nas plantas selvagens. sitiens é menos responsivo a estímulo elétrico do que plantas selvagens apresentando maior limiar de excitação e período refratário; Os sinais elétricos precedem as alterações nas trocas gasosas pós irrigação em todos os genótipos estudados. A sonda ZIM-probe não se mostrou eficiente para avaliar a pressão de turgor em plantas mutantes sob condições de estresse, mas para as plantas selvagens é uma ferramenta promissora para estudos envolvendo sinalização hidráulica e elétrica.

Guzmania monostachia é uma bromélia tanque epífita C3-CAM facultativa, constituindo-se em um modelo muito interessante para estudar a sinalização que ocorre na transição da fotossíntese C3 para CAM. Baseado em resultados obtidos pelo Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, constatou-se que a mudança em questão se dá de forma diferente ao longo do comprimento das folhas dessa espécie, sendo muito mais pronunciada na região apical do que na basal. Outra pesquisa, desenvolvida anteriormente no mesmo laboratório, sugere fortemente que na indução ao CAM, em plantas jovens de abacaxizeiro C3, o óxido nítrico (NO) e o ácido abscísico (ABA) atuam como mediadores dessa resposta. Levando em conta esses fatos, o presente trabalho visou caracterizar a participação do NO e do ABA como sinalizadores do CAM em uma bromélia que é reconhecidamente C3-CAM facultativa na natureza. Além disso, suas folhas apresentam diferentes níveis de expressão do CAM ao longo do comprimento, podendo, assim, constituir-se em um ótimo modelo para estudos de sinalização. Também se buscou, nesta pesquisa,saber se seria possível reduzir o modelo de estudo para folhas destacadas, não necessitando empregar a planta inteira nos experimentais. Após a comparação da fotossíntese entre folhas pertencentes a plantas inteiras e folhas destacadas, concluiu-se que é viável trabalhar com as folhas isoladas.Essas foram induzidas ao CAM por déficit hídrico, proporcionado por uma solução de polietilenoglicol (PEG) na concentração de 30%. O acúmulo noturno de acidez e a atividade das enzimas fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) e malato desidrogenase (MDH) em três porções foliares (porção basal, mediana e apical) foram usadas para caracterizar o grau de expressão do CAM. O conteúdo d\'água (expresso em porcentagem)foi usado como um indicativo da perda d\'água pelo tecido foliar.A participação do NO no processo de indução ao CAM foi avaliado por meio de dosagens por quimioluminescência, espectrofluorimetria e localização in situ por microscopia de fluorescência. Também foi usado um doador desse radical livre, o nitroprissiato de sódio (SNP). O ABA foi quantificado pela técnica de cromatografia a gás acoplada a espectrômetro de massas (GC-MS). As folhas mudaram seu metabolismo fotossintético de C3 para CAM no sexto dia de incubação com PEG (segundo o acúmulo noturno de ácidos e a atividade da enzima PEPC), mas a primeira queda detectável no teor d\'água ocorreu logo nas 12 primeiras horas, aumentando até 24ª hora. Nos dias seguintes (até o 7º), o menor teor de água foi encontrado na região basal da folha, enquanto que o CAM se expressou com maior intensidade na porção apical, sugerindo a existência de uma sinalização da redução hídrica entre a parte basal e a apical da folha. De fato, foram detectados maiores quantidades de ABA, em resposta ao déficit hídrico imposto pelo PEG, ao longo de todo o comprimento foliar, com maior quantidade na região apical. Teores significativamente maiores de NO foram detectados por espectrofluorimetria nos últimos três dias de experimento, apenas na região apical. A citolocalização do NO corroborou a quantificação por espectrofluorimetria, mostrando um aumento a partir do sexto dia nos ápices foliares. Conclui-se, portanto, que tanto o NO quanto o ABA parecem participar da sinalização do CAM. Possivelmente, o ABA desempenha um papel decisivo quanto à sinalização da diminuição do teor d\'água, devido ao seu aumento em todo o comprimento da folha,enquanto que o NO parece atuar como um mensageiro secundário, importante à indução do CAM na porção apical foliar. / Guzmania monostachia is a C3-CAM facultative epiphyte tank bromeliad and a very promising model to study the C3 to CAM transition. Results obtained on the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP showed that this transition occurs differently along the leaf blade o this species, as it is much stronger on the apical portion of the leaf, when compared to the basal one. Another research, from the same group, strongly suggests that on the induction of CAM in young pineapple plants is mediated by abscisic acid (ABA) and nitric oxide (NO). Based on both of these results, this work intends to characterize the role of NO and ABA in CAM signaling, using as a model of study a species which is generally accepted to be a facultative CAM on natural conditions. Besides that, G. Monostachia shows different degrees of CAM along the leaf blade, which makes an interesting model of it for signaling studies. It was also attempted to use detached leaves as a valid model of study for this species. Since no remarkable differences were detected between an experiment performed with whole plants or detached leaves alone, it was chosen to carry over the work using only detached leaves. The induction of CAM was performed by drought, using a 30% polyethyleneglycol (PEG) solution. The nocturnal acid accumulation and the activity of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) and malate dehydrogenase (MDH) enzymes were measured in three portions of the leaf (basal, middle and apical). The water amount was indicative of the water loss on foliar tissues. NO participation was assessed through chemioluminescence, spectrofluorimetry and in situ localization by fluorescence microscopy. A NO donor was also used. ABA was quantified by gas chromatography associated with mass spectrometry (GC-MS). The leaves changed the photosynthetic metabolism from C3 to CAM on the sixth day after the beginning of PEG exposure (as stated by the nocturnal acid accumulation and PEPC activity), but the decrease in water amount values started soon, after 12 hours of exposure, and stabilizing after 24 hours. The major loss of water percentage was detected on the basal portion, persisting until the seventh day, while on the apical portion, after two days the control and PEG-treated leaves remained similar. Since the C3-CAM change occurred in the apical portion, it is possible to suggest a signal transport from the base to the apex of the leaf in response to water loss. Indeed, the ABA levels remained higher with the water loss along the whole leaf, but with greater intensity on the apical portion. Higher NO levels were also detected on PEG-treated leaves, but only on the apical portion. The in situ localization of NO corroborates the spectrofluorimetry, showing an increase on the sixth day after PEG exposure on the leaf apex. In conclusion, both NO and ABA seem to participate on the signaling of CAM. Possibly, ABA plays a decisive role on indicating drought, because it increases on the whole leaf subjected to PEG, while NO is, maybe, a secondary signal, specific to processes that occur only on the apical portion, such as the CAM induction.

Um dos graves obstáculos para a manutenção e estabilidade da produção nacional de arroz (Oryza sativa) reside na susceptibilidade dos genótipos existentes a estresses abióticos. Tendo em vista a importância social e econômica do arroz e os efeitos extremamente danosos desses estresses sobre a agricultura, o conhecimento detalhado das interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais faz-se necessário. O alumínio (Al) é considerado um dos principais fatores limitantes na produção agrícola, inibindo o crescimento das raízes e a absorção de minerais. A toxicidade do Al em plantas ocorre pela sua solubilização em solos com pH baixo ou solos ácidos. Os genes ASR (ABA, Stress and Ripening) são induzidos por estresse e ácido abscísico (ABA) em plantas, e seus níveis de expressão são rapidamente aumentados em resposta à salinidade e seca. Recentemente, foi demonstrado que o gene que codifica a proteína ASR5 é responsivo ao Al em raízes de arroz. Apesar do arroz ser considerado um dos cereais mais resistentes a Al, os mecanismos básicos de tolerância a este metal são pouco conhecidos no arroz em comparação a outros cereais. Por meio do presente trabalho objetivamos: i) a caracterização funcional dos membros da família gênica ASR de arroz em reposta ao Al; e ii) a construção de vetores binários de transformação de plantas visando o estudo da localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsASR5, e o silenciamento gênico da família ASR de arroz. As análises dos transcritos por qRT-PCR mostraram que todos os genes da família ASR de arroz ssp Japonica respondem ao Al. Por outro lado, OsASR5 não sofre modulação de sua expressão em resposta ao Al em raízes de arroz ssp Indica. Essas diferenças de respostas dos genes OsASR5 em distintas variedades pode refletir diferenças no grau de tolerância ao Al de cada um desses genótipos. / One of the major obstacles to maintain the stability of the national production of rice (Oryza sativa) lies on the susceptibility of the different genotypes to abiotic stress. In view of the social and economic importance of rice and due to the extremely harmful effects of stress in agriculture, detailed knowledge of the interactions between these stresses and plant responses to environmental stimuli is necessary. Aluminum (Al) is considered one of the main limitation factors for agricultural productivity, inhibiting root growth and mineral absorption. Al toxicity occurs by its solubilization in soils with low pH or acid soils. The ASR (ABA, Stress and Ripening) genes are induced by stress and abscisic acid (ABA) in plants, and their expression levels are quickly increased in response to salinity and drought. Recently, it was demonstrated that the ASR5 gene is responsive to Al in rice roots. Despite the fact that rice is considered one of the most resistant crops to Al, the basic mechanisms of tolerance to this metal are poorly known when compared to other crops. This study aimed the functional characterization of the gene expression of rice ASR family members in response to Al, and the construction of binary vectors for the subcellular localization of the protein codified by the OsASR5 gene, and the construction of a gene silencing binary vector for the ASR family. Analyses of transcripts by qRT-PCR showed that in the ssp Japonica, all ASR genes responded to Al. In contrast, OsASR5 do not suffer expression modulation in response to Al in rice roots of ssp Indica. These differences in response of the OsASR5 gene in distinct varieties may reflect differences in the degree of Al tolerance in each genotype.

Um dos graves obstáculos para a manutenção e estabilidade da produção nacional de arroz (Oryza sativa) reside na susceptibilidade dos genótipos existentes a estresses abióticos. Tendo em vista a importância social e econômica do arroz e os efeitos extremamente danosos desses estresses sobre a agricultura, o conhecimento detalhado das interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais faz-se necessário. O alumínio (Al) é considerado um dos principais fatores limitantes na produção agrícola, inibindo o crescimento das raízes e a absorção de minerais. A toxicidade do Al em plantas ocorre pela sua solubilização em solos com pH baixo ou solos ácidos. Os genes ASR (ABA, Stress and Ripening) são induzidos por estresse e ácido abscísico (ABA) em plantas, e seus níveis de expressão são rapidamente aumentados em resposta à salinidade e seca. Recentemente, foi demonstrado que o gene que codifica a proteína ASR5 é responsivo ao Al em raízes de arroz. Apesar do arroz ser considerado um dos cereais mais resistentes a Al, os mecanismos básicos de tolerância a este metal são pouco conhecidos no arroz em comparação a outros cereais. Por meio do presente trabalho objetivamos: i) a caracterização funcional dos membros da família gênica ASR de arroz em reposta ao Al; e ii) a construção de vetores binários de transformação de plantas visando o estudo da localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsASR5, e o silenciamento gênico da família ASR de arroz. As análises dos transcritos por qRT-PCR mostraram que todos os genes da família ASR de arroz ssp Japonica respondem ao Al. Por outro lado, OsASR5 não sofre modulação de sua expressão em resposta ao Al em raízes de arroz ssp Indica. Essas diferenças de respostas dos genes OsASR5 em distintas variedades pode refletir diferenças no grau de tolerância ao Al de cada um desses genótipos. / One of the major obstacles to maintain the stability of the national production of rice (Oryza sativa) lies on the susceptibility of the different genotypes to abiotic stress. In view of the social and economic importance of rice and due to the extremely harmful effects of stress in agriculture, detailed knowledge of the interactions between these stresses and plant responses to environmental stimuli is necessary. Aluminum (Al) is considered one of the main limitation factors for agricultural productivity, inhibiting root growth and mineral absorption. Al toxicity occurs by its solubilization in soils with low pH or acid soils. The ASR (ABA, Stress and Ripening) genes are induced by stress and abscisic acid (ABA) in plants, and their expression levels are quickly increased in response to salinity and drought. Recently, it was demonstrated that the ASR5 gene is responsive to Al in rice roots. Despite the fact that rice is considered one of the most resistant crops to Al, the basic mechanisms of tolerance to this metal are poorly known when compared to other crops. This study aimed the functional characterization of the gene expression of rice ASR family members in response to Al, and the construction of binary vectors for the subcellular localization of the protein codified by the OsASR5 gene, and the construction of a gene silencing binary vector for the ASR family. Analyses of transcripts by qRT-PCR showed that in the ssp Japonica, all ASR genes responded to Al. In contrast, OsASR5 do not suffer expression modulation in response to Al in rice roots of ssp Indica. These differences in response of the OsASR5 gene in distinct varieties may reflect differences in the degree of Al tolerance in each genotype.

REBOUÇAS, D. M. Efeito do ácido abscísico nas bombas de prótons vacuolares e enzimas antioxidantes em Vigna unguiculata (L.) Walp. 2011. 67 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-26T21:29:35Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_dmrebouças.pdf: 1242528 bytes, checksum: 64e827398a79fef2785d3fdba8efdf5b (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-19T21:11:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_dmrebouças.pdf: 1242528 bytes, checksum: 64e827398a79fef2785d3fdba8efdf5b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-19T21:11:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_dmrebouças.pdf: 1242528 bytes, checksum: 64e827398a79fef2785d3fdba8efdf5b (MD5) Previous issue date: 2011 / Abscisic acid (ABA) is a phytohormone that plays critical roles in regulating plant responses to growth and development. The vacuole of higher plants is an organelle that occupies a larger part of the cell. The acidic condition is maintained by two distinct proton pumps, VATPase and V-PPase. It is known these proton pumps play essential roles in plant responses to environmental changes. The electrochemical gradient promoted by these enzymes is the driving force for the accumulation of ions and other solutes in the vacuole, being important to maintain cytosolic ion homeostasis and cellular metabolism. Antioxidant enzymes constitute a defense system against reactive oxygen species, which can cause damage to plant development. The aim of this study was to study the effect of the abscisic acid in the growth and physiological parameters, as well as the effect on vacuolar proton pumps and antioxidant enzymes (SOD, CAT and APX) from Vigna unguiculata cv. Pitiuba. The seeds of V. unguiculata were germinated in sand and grown for 15 days, with application of Hoagland solution in the absence (control) or presence of 0.1 µM ABA in the third, seventh and tenth days after germination.The effects of the abscisic acid (ABA) on the growth, stomatal conductance, transpiration, photosynthesis, internal CO2 concentration, V-ATPase subunit A and V-PPase activities and expression and antioxidant enzymes activities of Vigna unguiculata were analyzed. ABA increased the plants growth but did not affect the physiological parameters; induced an increase on V-ATPase hidrolytyc activity in leaves and on V-PPase in roots; ABA increased the transcripts of VuVHA-A and VuVHP in leaves and decreased the VuVHA-A transcripts in roots; caused increase in the leaves and roots catalase activity. These results suggest that the abscisic acid regulate the activity and the genes expression of the vacuolar proton pumps, as well as the antioxidant enzymes activity, being thus important effectors that regulate the development of V. unguiculata plants. / O ácido abscísico (ABA) é um fitohormônio que desempenha papéis críticos na regulação das respostas das plantas ao crescimento e desenvolvimento. O vacúolo de plantas superiores é uma organela que ocupa a maior parte da célula. A condição de acidez é mantida por duas bombas de prótons distintas, V-ATPase e V-PPase. Sabe-se que estas bombas de prótons desempenham um papel essencial nas respostas das plantas às mudanças ambientais. O gradiente eletroquímico promovido por essas enzimas é a força motriz para o acúmulo de íons e outros solutos no vacúolo, sendo importante para manter a homeostase citosólica de íons e o metabolismo celular. As enzimas antioxidantes constituem um sistema de defesa contra as espécies reativas de oxigênio, que podem provocar danos ao desenvolvimento das plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do ácido abscísico nos parâmetros de crescimento e fisiológicos, bem como o efeito na atividade hidrolítica e na expressão de transcritos das bombas de prótons vacuolares e na atividade de enzimas antioxidantes de plantas de Vigna unguiculata. As sementes de V. unguiculata foram germinadas em areia, onde cresceram por 15 dias, com aplicação de solução nutritiva de Hoagland na ausência (controle) ou presença de ABA 0,1 µM no terceiro, no sétimo e no décimo dias após a germinação. Os efeitos do ácido abscísico (ABA) sobre o crescimento, a condutância estomática, a transpiração, a fotossíntese, a concentração interna de CO2, a atividade e a expressão da subunidade A da V-ATPase e da V-PPase e a atividade de enzimas antioxidantes de Vigna unguiculata foram analisados. ABA aumentou o crescimento das plantas, mas não afetou os parâmetros fisiológicos; induziu um aumento na atividade hidrolítica da V-ATPase em folhas e da V- PPase em raízes; aumentou os transcritos de VuVHA-A e de VuVHP em folhas e diminuiu os transcritos de VuVHA-A em raízes e, por fim, causou aumento na atividade da catalase de folhas e de raízes. Esses resultados sugerem que o ácido abscísico regula a atividade e a expressão dos genes das bombas de prótons vacuolares, bem como as atividades de enzimas antioxidantes, sendo portanto importantes efetores que regulam o desenvolvimento de plantas de V. unguiculata.

Um dos graves obstáculos para a manutenção e estabilidade da produção nacional de arroz (Oryza sativa) reside na susceptibilidade dos genótipos existentes a estresses abióticos. Tendo em vista a importância social e econômica do arroz e os efeitos extremamente danosos desses estresses sobre a agricultura, o conhecimento detalhado das interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais faz-se necessário. O alumínio (Al) é considerado um dos principais fatores limitantes na produção agrícola, inibindo o crescimento das raízes e a absorção de minerais. A toxicidade do Al em plantas ocorre pela sua solubilização em solos com pH baixo ou solos ácidos. Os genes ASR (ABA, Stress and Ripening) são induzidos por estresse e ácido abscísico (ABA) em plantas, e seus níveis de expressão são rapidamente aumentados em resposta à salinidade e seca. Recentemente, foi demonstrado que o gene que codifica a proteína ASR5 é responsivo ao Al em raízes de arroz. Apesar do arroz ser considerado um dos cereais mais resistentes a Al, os mecanismos básicos de tolerância a este metal são pouco conhecidos no arroz em comparação a outros cereais. Por meio do presente trabalho objetivamos: i) a caracterização funcional dos membros da família gênica ASR de arroz em reposta ao Al; e ii) a construção de vetores binários de transformação de plantas visando o estudo da localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsASR5, e o silenciamento gênico da família ASR de arroz. As análises dos transcritos por qRT-PCR mostraram que todos os genes da família ASR de arroz ssp Japonica respondem ao Al. Por outro lado, OsASR5 não sofre modulação de sua expressão em resposta ao Al em raízes de arroz ssp Indica. Essas diferenças de respostas dos genes OsASR5 em distintas variedades pode refletir diferenças no grau de tolerância ao Al de cada um desses genótipos. / One of the major obstacles to maintain the stability of the national production of rice (Oryza sativa) lies on the susceptibility of the different genotypes to abiotic stress. In view of the social and economic importance of rice and due to the extremely harmful effects of stress in agriculture, detailed knowledge of the interactions between these stresses and plant responses to environmental stimuli is necessary. Aluminum (Al) is considered one of the main limitation factors for agricultural productivity, inhibiting root growth and mineral absorption. Al toxicity occurs by its solubilization in soils with low pH or acid soils. The ASR (ABA, Stress and Ripening) genes are induced by stress and abscisic acid (ABA) in plants, and their expression levels are quickly increased in response to salinity and drought. Recently, it was demonstrated that the ASR5 gene is responsive to Al in rice roots. Despite the fact that rice is considered one of the most resistant crops to Al, the basic mechanisms of tolerance to this metal are poorly known when compared to other crops. This study aimed the functional characterization of the gene expression of rice ASR family members in response to Al, and the construction of binary vectors for the subcellular localization of the protein codified by the OsASR5 gene, and the construction of a gene silencing binary vector for the ASR family. Analyses of transcripts by qRT-PCR showed that in the ssp Japonica, all ASR genes responded to Al. In contrast, OsASR5 do not suffer expression modulation in response to Al in rice roots of ssp Indica. These differences in response of the OsASR5 gene in distinct varieties may reflect differences in the degree of Al tolerance in each genotype.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1640977 bytes, checksum: 4fdd6a8d2b89afc2024e929b0c838240 (MD5) Previous issue date: 2010-11-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os metais pesados, especialmente o cádmio, têm se tornado um dos principais agentes de estresse abiótico em plantas superiores em função de sua alta toxicidade e aumento dos níveis de liberação no meio ambiente. Apesar toxicidade destes elementos, as plantas desenvolveram mecanismos que lhes conferem aumento na tolerância a esta condição de estresse através de adaptações físicas e ativação de uma rede integrada de respostas celulares e moleculares que começam a atuar após o início do estresse. Relatos de alterações fito hormonais durante o processo de aclimatação ao Cd envolvendo o ácido abscísico (ABA) são escassos na literatura, e os poucos existentes são relativos a toxicidade aguda, uma situação distinta daquela que normalmente ocorre no meio ambiente. Em vista disso, esta pesquisa propôs-se a elucidar um potencial papel do ABA sobre os mecanismos bioquímicos e fisiológicos de aclimatação e tolerância ao estresse crônico por Cd, utilizando para tanto o tomateiro mutante notabilis deficient em ABA, uma linhagem transgênica complementada notabilis complemented 13, e seu tipo selvagem. Um padrão de resposta distinta das plantas notabilis pode ser apontado pelo aumento da absorção de Cd, uma elevada taxa de transpiração e redução do potencial hídrico foliar, combinado a inalterações da taxa de concentração de CO2 entre a câmara sub- estomática e a ambiente (Ci/Ca), e da composição isotópica de carbono (δ13C), além de redução da condutância estomática (gs) e da eficiência do uso da água (WUE), sob tratamento com este metal pesado. Apesar da maior atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) na ausência de Cd, notabilis teve maior peroxidação lipídica em suas raízes. Limitações da gs causadas pelo Cd aparentam ser o principal motivo da redução da taxa líquida de assimilação de carbono (A) em plantas do tipo selvagem e notabilis complemented 13, ao passo que notabilis apresenta várias alterações negativas nos parâmetros fotoquímicos da fotossíntese, implicando em uma redução transitória no potencial de absorção da luz, reduzida conversão de energia para fotoquímica, e maior perda regulada de energia no fotossistema II, que podem explicar, pelo menos em parte, a redução da A. A complementação do mutante demonstrou recuperação do fenótipo para vários parâmetros para um patamar semelhante ao das plantas do vi tipo selvagem, reforçando a hipótese que a síntese de ABA desempenha um papel chave na aclimatação das plantas ao metal. / Heavy metals, especially cadmium have become one of the main abiotic stress agents for higher plants because of their high toxicity and increasing levels released in the environment. Despite the poisonous of these elements, plants have evolved mechanisms by which they increase their tolerance to this stress condition through both physical adaptations and activation of an interactive network of cellular and molecular responses that begin after the onset of stress. Information about phytohormonal changes during the Cd acclimation process involving abscisic acid (ABA) are scarce in literature, and the few existent depict the acute toxicity, a distinct situation from that which normally occurs in the environment. In view of that, this research purposed to find out a potential role of ABA on physiological and biochemical acclimation mechanisms and tolerance to chronic Cd stress, using the tomato plants ABA-deficient mutant notabilis, a transgenic complemented line notabilis complemented 13, and their wild type. A different response pattern of notabilis plants could be pointed due increased Cd uptake, an elevated transpiration rate and reduced leaf water potential, combined with unaltered sub-stomatal- toambient CO2 concentration ratio (Ci/Ca) and carbon isotopic composition (δ13C), a reduced effect on stomatal conductance (gs), and on water use efficiency (WUE) under treatment with this heavy metal. Despite the higher activity of the antioxidative enzymes superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in absence of Cd, notabilis have higher lipid peroxidation in their roots. Limitations in gs caused by Cd appear to be the main reason of reduction in net carbon assimilation rate (A) of wild type and notabilis complemented 13 plants, whereas notabilis has several negative changes in photosynthesis photochemistry parameters that implicate in transient reduction in light absorption potential, lower photochemical energy conversion, and increased energy loss in photosystem II through a regulated non-photochemical mechanism that may explain, at least in part, the reduction in A. The complementation of the mutant showed to recovery several phenotype parameters close to wild type plants, strengthening the hypothesis that ABA synthesis has a key function in plant acclimation to Cd.

Guzmania monostachia é uma bromélia tanque epífita C3-CAM facultativa, constituindo-se em um modelo muito interessante para estudar a sinalização que ocorre na transição da fotossíntese C3 para CAM. Baseado em resultados obtidos pelo Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, constatou-se que a mudança em questão se dá de forma diferente ao longo do comprimento das folhas dessa espécie, sendo muito mais pronunciada na região apical do que na basal. Outra pesquisa, desenvolvida anteriormente no mesmo laboratório, sugere fortemente que na indução ao CAM, em plantas jovens de abacaxizeiro C3, o óxido nítrico (NO) e o ácido abscísico (ABA) atuam como mediadores dessa resposta. Levando em conta esses fatos, o presente trabalho visou caracterizar a participação do NO e do ABA como sinalizadores do CAM em uma bromélia que é reconhecidamente C3-CAM facultativa na natureza. Além disso, suas folhas apresentam diferentes níveis de expressão do CAM ao longo do comprimento, podendo, assim, constituir-se em um ótimo modelo para estudos de sinalização. Também se buscou, nesta pesquisa,saber se seria possível reduzir o modelo de estudo para folhas destacadas, não necessitando empregar a planta inteira nos experimentais. Após a comparação da fotossíntese entre folhas pertencentes a plantas inteiras e folhas destacadas, concluiu-se que é viável trabalhar com as folhas isoladas.Essas foram induzidas ao CAM por déficit hídrico, proporcionado por uma solução de polietilenoglicol (PEG) na concentração de 30%. O acúmulo noturno de acidez e a atividade das enzimas fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) e malato desidrogenase (MDH) em três porções foliares (porção basal, mediana e apical) foram usadas para caracterizar o grau de expressão do CAM. O conteúdo d\'água (expresso em porcentagem)foi usado como um indicativo da perda d\'água pelo tecido foliar.A participação do NO no processo de indução ao CAM foi avaliado por meio de dosagens por quimioluminescência, espectrofluorimetria e localização in situ por microscopia de fluorescência. Também foi usado um doador desse radical livre, o nitroprissiato de sódio (SNP). O ABA foi quantificado pela técnica de cromatografia a gás acoplada a espectrômetro de massas (GC-MS). As folhas mudaram seu metabolismo fotossintético de C3 para CAM no sexto dia de incubação com PEG (segundo o acúmulo noturno de ácidos e a atividade da enzima PEPC), mas a primeira queda detectável no teor d\'água ocorreu logo nas 12 primeiras horas, aumentando até 24ª hora. Nos dias seguintes (até o 7º), o menor teor de água foi encontrado na região basal da folha, enquanto que o CAM se expressou com maior intensidade na porção apical, sugerindo a existência de uma sinalização da redução hídrica entre a parte basal e a apical da folha. De fato, foram detectados maiores quantidades de ABA, em resposta ao déficit hídrico imposto pelo PEG, ao longo de todo o comprimento foliar, com maior quantidade na região apical. Teores significativamente maiores de NO foram detectados por espectrofluorimetria nos últimos três dias de experimento, apenas na região apical. A citolocalização do NO corroborou a quantificação por espectrofluorimetria, mostrando um aumento a partir do sexto dia nos ápices foliares. Conclui-se, portanto, que tanto o NO quanto o ABA parecem participar da sinalização do CAM. Possivelmente, o ABA desempenha um papel decisivo quanto à sinalização da diminuição do teor d\'água, devido ao seu aumento em todo o comprimento da folha,enquanto que o NO parece atuar como um mensageiro secundário, importante à indução do CAM na porção apical foliar. / Guzmania monostachia is a C3-CAM facultative epiphyte tank bromeliad and a very promising model to study the C3 to CAM transition. Results obtained on the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP showed that this transition occurs differently along the leaf blade o this species, as it is much stronger on the apical portion of the leaf, when compared to the basal one. Another research, from the same group, strongly suggests that on the induction of CAM in young pineapple plants is mediated by abscisic acid (ABA) and nitric oxide (NO). Based on both of these results, this work intends to characterize the role of NO and ABA in CAM signaling, using as a model of study a species which is generally accepted to be a facultative CAM on natural conditions. Besides that, G. Monostachia shows different degrees of CAM along the leaf blade, which makes an interesting model of it for signaling studies. It was also attempted to use detached leaves as a valid model of study for this species. Since no remarkable differences were detected between an experiment performed with whole plants or detached leaves alone, it was chosen to carry over the work using only detached leaves. The induction of CAM was performed by drought, using a 30% polyethyleneglycol (PEG) solution. The nocturnal acid accumulation and the activity of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) and malate dehydrogenase (MDH) enzymes were measured in three portions of the leaf (basal, middle and apical). The water amount was indicative of the water loss on foliar tissues. NO participation was assessed through chemioluminescence, spectrofluorimetry and in situ localization by fluorescence microscopy. A NO donor was also used. ABA was quantified by gas chromatography associated with mass spectrometry (GC-MS). The leaves changed the photosynthetic metabolism from C3 to CAM on the sixth day after the beginning of PEG exposure (as stated by the nocturnal acid accumulation and PEPC activity), but the decrease in water amount values started soon, after 12 hours of exposure, and stabilizing after 24 hours. The major loss of water percentage was detected on the basal portion, persisting until the seventh day, while on the apical portion, after two days the control and PEG-treated leaves remained similar. Since the C3-CAM change occurred in the apical portion, it is possible to suggest a signal transport from the base to the apex of the leaf in response to water loss. Indeed, the ABA levels remained higher with the water loss along the whole leaf, but with greater intensity on the apical portion. Higher NO levels were also detected on PEG-treated leaves, but only on the apical portion. The in situ localization of NO corroborates the spectrofluorimetry, showing an increase on the sixth day after PEG exposure on the leaf apex. In conclusion, both NO and ABA seem to participate on the signaling of CAM. Possibly, ABA plays a decisive role on indicating drought, because it increases on the whole leaf subjected to PEG, while NO is, maybe, a secondary signal, specific to processes that occur only on the apical portion, such as the CAM induction.

This document refers to research whose main objective was to investigate the relationship among hydraulic, chemical and electrical signals in poor tomato plants ABA production. The document is organized into three chapters: The first chapter presents a detailed extracellular measurement protocol of electrical signals in plants and how to associate these measurements to determine gas exchange using the Infrared gas analyzer (IRGA) and turgor pressure using the patch clamp pressure probe (ZIM-probe). The second chapter refers to recording of the action potential generated spontaneously and evoked by electrical stimulation in ABA-deficient tomato, mutant sitiens. The final chapter presents the results for turgor pressure, gas exchange and electrical signals measurements in mutants notabilis and sitiens in the re-irrigated after a period of drought. The possible role of electrical signals in the plant signalling under stress conditions is discussed. The main conclusions related to chapters 1, 2 and 3 were: Measurement of extracellular electrical signals can be performed with gas exchange and turgor pressure measurements using IRGA ZIM-probe equipment; Electrical signals generated spontaneously in sitiens mutants propagate with amplitude and speed higher than in wild plants. Mutant is less responsive to electrical stimulation showing higher excitation threshold and longer refractory period than wild plants; The mutant plants are more responsive electrically to re-irrigation after drought than wild plants. The electrical signals precede changes in gas exchange in all genotypes, post irrigation. The ZIM-probe was not efficient to evaluate the turgor pressure in mutant plants under stress conditions, but is a promising tool for studies involving hydraulic and electrical signalling in wild plants. / O presente documento refere-se a pesquisa cujo principal objetivo foi investigar a relação entre sinais hidráulicos, químicos e elétricos em plantas de tomate deficientes da produção de ABA. O documento foi organizado em três capítulos: O primeiro capítulo apresenta um detalhado protocolo de medição extracelular de sinais elétricos em plantas e como associar estas medições a determinação de trocas gasosas usando o Analisador de gás por infravermelho (IRGA) e pressão de turgor usando a sonda de pressão (ZIM-probe). O segundo capítulo refere-se ao registro de potenciais de ação gerados espontaneamente e evocados por estímulo elétrico em tomateiro deficiente na produção de ABA, mutante sitiens. O último capítulo apresenta os resultados referentes a medições de pressão de turgor, trocas gasosas e sinais elétricos nos mutantes notabilis e sitiens, deficientes na produção de ABA reirrigadas após um período de déficit hídrico. O possível papel dos sinais elétricos na sinalização em plantas em condições de estresse é discutido. As principais conclusões referentes aos capítulos 1, 2 e 3 foram, respectivamente: As plantas mutantes são mais responsivas eletricamente a re-irrigação, após déficit hídrico com que as plantas selvagens. Medições extracelulares de sinais elétricos podem ser realizadas com medidas de trocas gasosas e pressão de turgor utilizando os equipamentos IRGA e ZIM-probe; Sinais elétricos gerados espontaneamente nos mutantes sitiens se propagam com amplitude e velocidade maiores do que nas plantas selvagens. sitiens é menos responsivo a estímulo elétrico do que plantas selvagens apresentando maior limiar de excitação e período refratário; Os sinais elétricos precedem as alterações nas trocas gasosas pós irrigação em todos os genótipos estudados. A sonda ZIM-probe não se mostrou eficiente para avaliar a pressão de turgor em plantas mutantes sob condições de estresse, mas para as plantas selvagens é uma ferramenta promissora para estudos envolvendo sinalização hidráulica e elétrica.