Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína quinasa CK1 es una familia de proteínas a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas (α, β, δ, ε, γ-1, γ-2 y γ-3). En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1α y CK1ε en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para ello, hemos analizado los patrones de expresión de estos genes mediante hibridización in situ y RT-PCR. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera diferencial temporal y espacialmente durante el desarrollo embrionario. CK1α se detecta desde la primera hora post fertilización y presenta un patrón de expresión ubicuo en los primeros estadíos para luego restringirse a la región cefálica y a las aletas pectorales, mientras que CK1ε no presenta un componente materno y el mRNA cigótico es detectado después de las 12 horas post fertilización con un patrón de expresión restringido exclusivamente al cerebro. Para analizar la función de ambas isoformas se realizaron estudios de sobrexpresión mediante la inyección del mRNA codificante para CK1α y CK1ε y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección de las dominantes negativas de cada isoforma. Para CK1α también se utilizó la inyección del morfolino oligo antientido que silencia específicamente la actividad de éste gen. Estos experimentos anteriormente mencionados se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula. Posteriormente los embriones fueron incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores en embriones inyectados con el Morfolino Anti CK1α, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podría estar involucrada esta ultima isoforma. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que CK1α, a diferencia de CK1ε, está involucrada en los procesos que regulan la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente en las que se encuentran ubicadas en el límite entre cerebro medio y posterior (cerebelo y cuarto ventrículo). En cambio, CK1ε solo tendría participación en la formación de estructuras cerebrales sin afectar la formación de los ejes en el embrión en desarrollo / La realización de esta tesis fue financiada en parte por el proyecto FONDECYT N° 1020753

La Proteína Quinasa C (PKC) juega un papel fundamental en la regulación del crecimiento celular. Estas proteínas están implicadas en diferentes vías intracelulares que son consideradas como dianas para el tratamiento contra el cáncer. Atendiendo a las propiedades enzimáticas, las PKC se clasifican en tres grandes subfamilias: clásicas, nuevas y atípicas. En las PKC clásicas, el dominio C2 es un motivo regulador que responde a señales de Ca2+ intracelulares. Este dominio presenta un motivo denominado región rica en lisinas que interacciona con fosfolípidos acídicos. Los resultados de esta tesis demuestran que la afinidad de este dominio por fosfolípidos como el PIP2 es mayor frente a otros de la misma naturaleza. El dominio C2 de las PKC nuevas se une a fosfolípidos cargados negativamente de modo Ca2+-independiente. Nuestro estudio demuestra que la interacción de este dominio con las membranas es principalmente electrostática con una pequeña contribución de interacciones hidrofóbicas. Por otra parte, el estudio de la estructura secundaria del dominio catalítico de la PKC mostró una elevada proporción de hélice . La adición de Mg2+-ATP provocó un mayor efecto protector frente a la desnaturalización térmica. / Protein kinase C (PKC) is a family of related protein kinases that plays an important role in regulating cell growth. These protein kinases are involved in several intracellular pathways that end in transcription and are considered to be potential targets for anticancer therapy. The mammalian isoenzymes have been grouped into three subfamilies according to their enzymatic properties: classical, novel and atypical.The C2 domain is a regulatory sequence motif and is a targeting domain that responds to intracellular Ca2+ signals in classical protein kinases. This domain presents a motif named the lysine-rich cluster that interacts with acidic phospholipids. The results demonstrate that PIP2 interacts with the C2 domain of PKCα in a different way to that described for other phospolipids.C2 domain in novel PKC binds to negatively charged phospholipid vesicles in a Ca2+-independent manner. Our study confirms that the main way in which C2-PKC interacts with membranes is electrostatic in nature, with a very small contribution on the part of hydrophobic interactions.The secondary structure of catalytic domain from atypical PKC showed a high contribution of -helix component. In addition, Mg2+-ATP significantly altered the denaturation pattern of this domain because it protected against denaturation.

La Proteína Quinasa C (PKC) participa en numerosas funciones fisiológicas a través de distintas rutas de señalización celular. Las isoenzimas clásicas están reguladas por diacilglicerol, ésteres de forbol, calcio y fosfolípidos aniónicos. La presencia de insaturaciones en los diacilgliceroles de la membrana modifica la activación de la PKC alfa.Los dominios C2 de PKC clásicas presentan dos tipos de sitios de unión de calcio y enlazan tres cationes de manera similar. La desnaturalización térmica de estos dominios se desplazó hacia mayores temperaturas con concentraciones crecientes de calcio, siendo mayor el efecto en presencia de fosfolípidos aniónicos. La estructura secundaria de los dominios C2 de PKC clásicas así como de la PKC alfa completa mostró una elevada proporción de hoja beta. La adición de fosfolípidos aniónicos y PMA respectivamente provocó un mayor efecto protector frente a la desnaturalización térmica que sólo con calcio. / Protein Kinase C (PKC) plays a key role in several physiological functions through different celullar signalling pathways. The classical isoenzymes are regulated by diacylglycerol, phorbol esters, calcium, and anionic phospholipids.The presence of insaturations in the membrane diacylglycerols modifies the PKC alpha activation.C2 domains of classical PKC have two different binding sites for calcium, and bind three molecules in a similar way. The thermal denaturation of these domains moved to higher temperatures with increasing calcium concentrations, being this effect hingher in the presence of anionic phospholipids. The secondary structure of both C2 domains from classical PKC and PKC alpha showed a high contribution of beta-sheet component. The addition of anionic phospholipids and PMA produced the main protection against thermal denaturation, respectively