[EN] Mutants able to germinate and perform early growth in medium containing a high
NaCl concentration were identified and named salt resistant (sre). The sre mutants also were
able to germinate in high-osmoticum medium, indicating that they are osmotolerant in a
germination assay. Complementation analyses revealed that sre1-1 and sre1-2 were alleles of
the abscisic acid (ABA) biosynthesis ABA2 gene. A map-based cloning strategy allowed the
identification of the ABA2 gene and molecular characterization of the new aba2 alleles. The
ABA2 gene product belongs to the family of short-chain dehydrogenases/reductases, which
are known to be NAD- or NADP-dependent oxidoreductases. Recombinant ABA2 protein
produced in Escherichia coli exhibits a Km value for xanthoxin of 19 µM and catalyzes in a
NAD-dependent manner the conversion of xanthoxin to abscisic aldehyde, as determined by
HPLC-mass spectrometry. The ABA2 mRNA is expressed constitutively in all plant organs
examined and is not upregulated in response to osmotic stress. The results of this work are
discussed in the context of previous genetic and biochemical evidence regarding ABA
biosynthesis, confirming the xanthoxin-->abscisic aldehyde-->ABA transition as the last
steps of the major ABA biosynthetic pathway.
The abscisic aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product of A. thaliana catalyzes the
final step in abscisic acid (ABA) biosynthesis. An aao3-1 mutant in a Landsberg erecta
genetic background exhibited a wilty phenotype in rosette leaves, whereas seed dormancy
was not affected (Seo et al., 2000a). Therefore, it was speculated that a different aldehyde
oxidase would be the major contributor to ABA biosynthesis in seeds (Seo et al., 2000a).
Through a screening based on germination under high-salt concentration, we isolated two
mutants in a Columbia genetic background, initially named sre2-1 and sre2-2.
Complementation tests with different ABA-deficient mutants indicated that sre2-1 and sre2-
2 mutants were allelic to aao3-1, and therefore they were renamed as aao3-2 and aao3-3,
respectively. Indeed, molecular characterization of the aao3-2 mutant revealed a T-DNA
insertional mutation that abolished the transcription of AAO3 gene, while sequence analysis
of AAO3 in aao3-3 mutant revealed a deletion of three nucleotides and several missense
mutations. Physiological characterization of aao3-2 and aao3-3 mutants revealed a wilty
phenotype and osmotolerance in germination assays. In contrast to aao3-1, both aao3-2 and
aao3-3 mutants showed a reduced dormancy. Accordingly, ABA levels were reduced in dry
seeds and rosette leaves of both aao3-2 and aao3-3. Taken together, these results indicate
that AAO3 gene product plays a major role in seed ABA biosynthesis. / [ES] El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona implicada en el control de procesos
vegetales esenciales, principalmente el desarrollo de la semilla así como la respuesta de las
plantas a diferentes estreses ambientales, particularmente frío, sequía y salinidad. En el
presente trabajo se ha realizado la búsqueda en colecciones de Arabidopsis thaliana
mutagenizadas con T-DNA de mutantes capaces de germinar en condiciones de alta sal
(NaCl), identificándose tres loci mutantes, inicialmente denominados sre1, sre2 y sre3 (“salt
resistant”). Los mutantes sre, además de su capacidad para germinar y establecer plántula en
condiciones de estrés osmótico, mostraban una germinación resistente a paclobutrazol,
latencia muy reducida, mayor transpiración y niveles de ABA en hojas de roseta
significativamente menores que plantas silvestres. El análisis de complementación reveló
que los mutantes sre1 eran alélicos al mutante aba2-1, los mutante sre2 eran alélicos al
mutante aao3-1 y el mutante sre3 era alélico al mutante aba1-5. Así, el ABA bloquea la
germinación y el establecimiento de la plántula en condiciones de bajo potencial hídrico, por
lo que mutantes capaces de germinar en condiciones de estrés osmótico representan
frecuentemente mutantes defectivos en la biosíntesis de ABA.
Mediante una combinación de las estrategias de mapeo posicional y gen candidato se
llevó a cabo la identificación del gen ABA2 y de las mutaciones sre1-1/aba2-11 y sre1-
2/aba2-12. El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena corta
dependiente de NAD+
(SDR). La mutación sre1-1/aba2-11 es debida a una deleción de 53 pb
que también supone un cambio en la pauta de lectura, generando un alelo nulo de ABA2. La
mutación sre1-2/aba2-12 conduce a la sustitución Gly28Arg, afectando al sitio de unión del
coenzima. Mediante un análisis HPLC-MS se ha demostrado que la proteína recombinante
ABA2 cataliza la conversión de xantoxina en aldehído abscísico en una reacción dependiente
de NAD+
. Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen inequívocamente que la
conversión de xantoxina en aldehído abscísico representa el penúltimo paso de la ruta de
biosíntesis de ABA y que este es catalizado por el producto génico del gen ABA2
(At1g52340).
El último paso de la ruta de biosíntesis de ABA es la conversión de aldehído abscísico
en ácido abscísico. Este paso está catalizado en Arabidopsis por el producto génico del gen
AAO3. Los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutante aao3-1, muestran
una reducción en los niveles de ABA en hojas de roseta y una mayor transpiración que las
plantas silvestres. Además, y contrariamente el mutante aao3-1, muestran un fenotipo de
osmotolerancia en germinación y establecimiento de plántula, germinación resistente a
paclobutrazol, latencia reducida y poseen una reducción del 65% en los niveles de ABA en
semillas. La caracterización molecular de la mutación sre2-1/aao3-2 revela una inserción de
T-DNA que elimina la transcripción del gen AAO3, constituyendo por tanto un alelo nulo.
La secuenciación del gen AAO3 en el mutante sre2-2/aao3-3 revela una deleción de tres
nucleótidos y varias mutaciones de cambio de sentido. La evidencia genética y bioquímica
resultante del análisis de los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aaao3-3 indica que lesiones en
el gen AAO3 conducen a niveles reducidos de ABA y fenotipos característicos en semillas.
Por consiguiente, queda demostrado que el gen AAO3 desempeña un papel crucial en la
biosíntesis de ABA en semillas. / [CA] L´àcid abscísic (ABA) és una fitohormona que ha estat implicada en el control de
processos vegetals essencials, principalment en el desenvolupament de la llavor així com en
la resposta de les plantes a diferents estressos ambientals, particularment fred, sequera i
salinitat. En el present treball de tesi doctoral s´ha fet la recerca en coleccions d´Arabidopsis
thaliana mutagenizades amb T-DNA de mutants capaços de germinar en condicions
d´elevada sal (NaCl), identificant-se tres loci mutants, inicialment denominats sre1,sre2 i
sre3 (“salt resistant”). Els mutants sre, a més de la seva capacitat per a germinar i establir
plàntula en condicions d´estrès osmòtic, mostraven una germinació resistent a paclobutrazol,
latència molt reduïda, major transpiració i nivells d´ABA en fulles de roseta
significativament menors que les plantes silvestres. L´anàlisi de complementació va mostrar
que els mutants sre1 eren al·lèlics al mutant aba2-1, els mutants sre2 eren al·lèlics al mutant
aao3-1 i el mutant sre3 era al·lèlic al mutant aba1-5. Així, l´ABA bloqueja la germinació i
l´establiment de la plàntula en condicions de baix potencial hídric, i aleshores mutants
capaços de germinar en condicions d´estrès osmòtic representen normalment mutants amb
defectes en la biosíntesi d´ABA.
Mitjançant una combinació de les estratègies de mapeig posicional i gen
candidat s´ha realitzat la identificació del gen ABA2 y de les mutacions sre1-1/aba2-
11 y sre1-2/aba2-12.El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de
cadena curta dependent de NAD+
(SDR). La mutació sre1-1/aba2-11 es deguda a una
deleció de 53 pb que també suposa un camvi en la pauta de lectura, generant un al·lel nul de
ABA2. La mutació sre1-2/aba2-12 produeix a la substitució Gly28Arg, afectant al lloc
d´unió del coenzima. Mitjançant un anàlisi HPLC-MS s´ha demostrat que la proteïna
recombinant ABA2 catalitza la conversió de xantoxina en aldehid abscísic en una reacció
dependent de NAD+
. Els resultats obtinguts en el present treball estableixen inequívocament
que la conversió de xantoxina en aldehíd abscísic representa el penúltim pas de la ruta de
biosíntesi d´ABA i que està catalitzat pel producte gènic del gen ABA2 (At1g52340).
L´últim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA és la conversió de l´aldehid abscísic en
àcid abscísic. Aquest pas està catalitzat en A. thaliana pel producte gènic del gen AAO3. Els
mutants sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutant aao3-1, mostraven una reducció
en els nivells d´ABA en fulles de roseta i una major transpiració que las plantes silvestres. A
més, i contràriament al mutant aao3-1, mostraven un fenotip de osmotolerancia en
germinació i establiment de plàntula, germinació resistent a paclobutrazol, latència reduïda i
posseeixen una reducció del 65% en els nivells d´ABA en llavors. La caracterització
molecular de la mutació sre2-1/aao3-2 revela una inserció de T-DNA que elimina la
transcripció del gen AAO3, constituint por tant un al·lel nul. La secuenciació del gen AAO3
en el mutant sre2-2/aao3-3 va revelar una deleció de tres nucleòtids i vàries mutacions de
canvi de sentit. L´evidencia genètica i bioquímica resultant de l´anàlisi dels mutants sre2-
1/aao3-2 i sre2-2/aaao3-3 indica que lesions en el gen AAO3 condueixen a nivells reduïts
d´ABA i fenotips característics en llavors. Aleshores, queda demostrat que el gen AAO3
poseeix un paper crucial en la biosíntesi d´ABA en llavors. / González Guzmán, M. (2005). Genética molecular de la biosíntesis del ácido abscísico. Clonación y caracterización del gen ABA2 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/135830 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/135830 |
| Date | 18 December 2019 |
| Creators | González Guzmán, Miguel |
| Contributors | Rodríguez Egea, Pedro Luís, Serrano Salom, Ramón, Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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