La transcription cachée est un phénomène répandu aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes. Elle se caractérise par une production massive d’ARNs non-codants au niveau de régions non-annotées du génome et est potentiellement dangereuse pour la cellule car elle peut interférer avec l’expression normale des gènes. Chez S. cerevisiae, l’hélicase Sen1 induit la terminaison précoce de la transcription non-codante et joue ainsi un rôle clé dans le contrôle de la transcription cachée. Sen1 est très conservée et des mutations dans son homologue humain, senataxin (SETX), ont été associées à des maladies neurodégénératives. Malgré de nombreuses recherches menées sur ces protéines, leurs propriétés biochimiques ainsi que leurs mécanismes d’action restent peu connus. Durant ma thèse, j’ai étudié le mécanisme de terminaison par Sen1.Premièrement, j’ai caractérisé les activités biochimiques de Sen1 et analysé comment elles permettent d’induire la terminaison. Pour cela, j’ai utilisé un ensemble de techniques in vitro, notamment un système de transcription-terminaison qui contient uniquement des composants purifiés : Sen1, l’ARN polymérase II (Pol II) et les ADN matrices. Ce système permet de modifier les différents éléments de façon contrôlée afin de comprendre leur rôle précis dans la terminaison. J’ai tout d’abord analysé la fonction des différents domaines de Sen1 dans la terminaison. Sen1 est une protéine de taille importante qui possède un domaine central catalytique flanqué par deux domaines impliqués dans l’interaction avec d’autres facteurs. J’ai montré que le domaine hélicase est suffisant pour déclencher la terminaison de la transcription in vitro. Ensuite, j’ai montré que Sen1 utilise l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP pour se déplacer sur des acides nucléiques simple bras (ARN et ADN) dans le sens 5’ vers 3’. J’ai alors étudié le rôle des différents acides nucléiques du système dans la terminaison par Sen1 et j’ai montré que l’interaction de Sen1 avec l’ADN n’est pas nécessaire; en revanche Sen1 doit s’associer à l’ARN naissant et se déplacer vers la polymérase. J’ai aussi montré qu’une fois que Sen1 entre en collision avec la Pol II, elle y exerce une action mécanique qui conduit à la terminaison uniquement quand la Pol II marque une pause. Cela indique que la terminaison est fortement dépendante de la pause transcriptionnelle. Deuxièmement, en collaboration avec le groupe d’E. Conti, nous avons réalisé une analyse structure-fonction du domaine hélicase de Sen1. Nous avons observé que Sen1 présente une organisation similaire à celle d’autres hélicases proches avec un core composé de deux domaines de type RecA avec plusieurs domaines auxiliaires. En général, le core est très conservé au sein des hélicases proches, alors que les domaines accessoires ont des caractéristiques distinctes qui confèrent des propriétés spécifiques aux différentes hélicases. En effet, nous avons identifié un sous-domaine spécifique à Sen1 mais conservé au cours de l’évolution que nous avons appelé le “brace”. Nous avons également détecté des différences notables au niveau d’un autre domaine accessoire que nous avons nommé le “prong”. Nous avons pu montrer que le “prong” est essentiel pour la terminaison par Sen1. Nos données suggèrent que les caractéristiques structurales spécifiques de Sen1 que nous avons révélées sont des déterminants majeurs de son activité dans la terminaison de la transcription. Finalement, nous avons utilisé Sen1 comme modèle pour étudier des mutations dans SETX qui sont associées à des maladies neurodégénératives. Nous avons introduit chez Sen1 une partie des mutations liées à des maladies et nous avons réalisé une caractérisation biochimique complète de chaque mutant. Nous avons ainsi montré que toutes les mutations sont fortement délétères pour la terminaison de la transcription. En conclusion, nos résultats ont permis d’améliorer la compréhension de l’origine des maladies provoquées par des mutations dans SETX. / Pervasive transcription is a common phenomenon both in eukaryotes and prokaryotes that consists in the massive production of non-coding RNAs from non-annotated regions of the genome. Pervasive transcription poses a risk that needs to be controlled since it can interfere with normal transcription of canonical genes. In S.cerevisiae, the helicase Sen1 plays a key role in restricting pervasive transcription by eliciting early termination of non-coding transcription. Sen1 is highly conserved across species and mutations in the human Sen1 orthologue, senataxin (SETX), are associated with two neurological disorders. Despite the major biological relevance of Sen1 proteins, little is known about their biochemical properties and precise mechanisms of action. During my PhD I have studied in detail the mechanisms of termination by Sen1.In a first project, I have characterized the biochemical activities of Sen1 and investigated how these activities partake in termination. To this end I have employed a variety of in vitro approaches, including a minimal transcription-termination system containing only purified Sen1, RNA polymerase II (RNAPII) and DNA transcription templates that allows modifying the different elements of the system in a controlled manner to understand their role in termination. First, we have analysed the function of the different domains of Sen1 in termination. Sen1 is a large protein composed of a central catalytic domain flanked by additional domains with proposed roles in protein-protein interactions. We have demonstrated that the central helicase domain is sufficient to elicit transcription termination in vitro. Next, we have shown that Sen1 can translocate along single-stranded nucleic acids (both RNA and DNA) from 5’ to 3’. Then, we have analysed the role of the different nucleic acid components of the elongation complex (i.e. nascent RNA and DNA transcription templates) in termination. Our results indicate that termination does not involve the interaction of Sen1 with the DNA but requires Sen1 translocation on the nascent RNA towards the RNAPII. Importantly, we show that upon encountering RNAPII, Sen1 can apply a mechanical force on the polymerase that results in transcription termination when RNAPII is paused under certain conditions. This indicates that RNAPII pausing is a strict requirement for Sen1-mediated termination. In a second project, in collaboration with the group of E. Conti we have performed a structure-function analysis of the helicase domain of Sen1. Comparison of Sen1 structure with that of other related helicases has revealed an overall similar organization consisting in two tandem RecA-like domains from which additional accessory subdomains protrude. In general, the core RecA-like domains are very well conserved among related helicases and most variation is found in the accessory subdomains, that often confer specific characteristics to different helicases. Indeed, we have found that Sen1 contains a unique but evolutionary conserved structural feature that we have dubbed the “brace”. In addition, Sen1 is different from other helicases in an auxiliary subdomain that we have named the “prong”. Importantly, we have shown that the integrity of this subdomain is critical transcription termination by Sen1. We propose that the specific features identified in our structural analyses are important determinants of the transcription termination activity of Sen1. Finally, we have used Sen1 as a model to investigate the molecular effect of SETX mutations linked to neurodegenerative diseases. We have introduced disease-associated mutations in Sen1 and performed a complete biochemical characterization of the different mutants in vitro. Importantly, we found that all mutants were severely affected in transcription termination. Taken together, our results elucidate the key structural determinants of the function of Sen1 and shed light on the molecular origin of the diseases associated with SETX mutations.

Sen1 est une hélicase ARN/ADN impliquée dans la protection du génome de la levure en résolvant les hybrides ARN/ADN et dans la terminaison de la transcription de courts ARN non codants. Malgré la demande cellulaire généralisée pour l'action Sen1, son abondance cellulaire est très faible, ce qui suggère que des mécanismes régulent les niveaux de protéine Sen1 dans la cellule. Nous avons confirmé que Sen1 est dégradé via une voie dépendante du protéasome. Ce mécanisme dépend de l’activité catalytique de Glc7, une protéine phosphatase dont il a été précédemment démontré qu’elle déphosphoryle Sen1 in vitro et qu’elle interagit avec Sen1 via un motif RVxF selon des expériences à deux hybrides. Notre hypothèse de travail est que Glc7 contrôle les niveaux de protéine Sen1 via la déphosphorylation d'un phospho-dégron. Fait intéressant, un site potentiel dans la région N-terminale de Sen1 (sérine 863) qui peut fonctionner comme un phospho-dégron a été identifié dans une analyse à l'échelle du protéome de la co-occurrence de phosphorylation et d'ubiquitylation. Afin d'identifier les sites de phosphorylation Sen1 qui sont enrichis en l'absence de Glc7, nous avons réalisé une immunoprécipitation de Sen1 suivie d'une spectrométrie de masse. Cette analyse a identifié un site de phosphorylation dans Sen1 à la sérine 1505 qui pourrait agir comme un site de dégron potentiel. A noter que ce site, a également été signalé dans les études antérieures phosphoprotéomiques sur la levure. De plus, l'interaction entre Sen1 et Glc7 et l’importance du motif RVxF (par la mutation du résidu F2003) pour cette interaction ont été confirmée par co-immunoprécipitation. De manière surprenante, la prévention de cette interaction n'affecte pas la stabilité de Sen1 ou la croissance cellulaire. Dans l'ensemble, nous avons identifié un petit groupe de sites de phosphorylation Sen1 avec une pertinence biologique potentielle. Nos résultats confirment également que la mutation du motif RVxF de Sen1 altère l'interaction avec Glc7 in vivo. Ces données approfondissent notre compréhension de la régulation de la protéine Sen1 par Glc7 dans les cellules de levure qui peuvent fournir des indices sur le rôle de la sénataxine, orthologue humaine, dans les troubles neurodégénératifs. / Sen1 is an RNA/DNA helicase involved in protecting the yeast genome by resolving RNA/DNA hybrids and in the transcription termination of short non-coding RNAs. Despite the widespread cellular demand for Sen1 action, its cellular abundance is very low, suggesting that mechanisms regulate Sen1 protein levels in the cell. We have confirmed that Sen1 is degraded via a proteasome-dependent pathway. This mechanism depends on the catalytic activity of Glc7, a protein phosphatase that was previously shown to dephosphorylate Sen1 in vitro, and to interact with Sen1 through an ‘RVxF’ motif. Our working hypothesis is that Glc7 controls Sen1 protein levels via dephosphorylation of a phospho-degron. Interestingly, a potential site in the N-terminal region of Sen1 (serine 863) that may work as a phospho-degron has been identified in a proteome-wide analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk. In order to identify Sen1 phosphorylation sites enriched in the absence of Glc7, we conducted immunoprecipitation of Sen1 followed by mass spectrometry. This analysis identified one phosphorylation site within Sen1 at serine 1505 that could act as a potential degron site. Note that this site has also been reported in previous phosphoproteomic studies on yeast. Furthermore, the interaction between Sen1 and Glc7 and the importance of the RVxF motif (by mutation of residue F2003) for this interaction was confirmed by co-immunoprecipitation. Surprisingly, prevention of this interaction does not affect the stability of Sen1 or cell growth. Overall, we have identified a small group of Sen1 phosphorylation sites with potential biological relevance. Our findings also confirm that mutating the RVxF motif of Sen1 impairs the interaction with Glc7 in vivo. These data further our understanding of Sen1 protein regulation by Glc7 in yeast cells that may provide clues to the role of senataxin, human orthologue, in neurodegenerative disorders.

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