Les télomères sont des structures nucléoprotéiques formées de séquences d’ADN répétées associées à des protéines spécialisées assurant la protection des extrémités des chromosomes eucaryotes et leur réplication complète. La télomérase est une ribonucléoprotéine catalysant l’ajout de répétitions télomérique pour contrer la perte de séquences inhérente à la réplication des extrémités des chromosomes linéaires. Plusieurs facteurs jouent des rôles importants dans le maintien de l’intégrité des télomères. Le champ d’étude de la biologie des télomères est toujours en expansion, étant donné les liens étroits entre les télomères, le cancer et le vieillissement. Les travaux présentés dans cette Thèse se divisent en trois parties. Les deux premières utilisent la levure Saccharomyces cerevisiae pour explorer les liens entre le complexe Smc5/6 et le maintien des télomères, ainsi que les mécanismes de terminaison de transcription de la composante ARN de la télomérase (T1c1). La troisième partie est une étude épidémiologique préliminaire examinant la taille des télomères de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Premièrement, les protéines SMC (structural maintenance of chromosomes) forment 3 complexes conservés requis pour la transmission des chromosomes lors des divisions cellulaires. Le complexe Smc5/6 a été impliqué dans la réparation de l’ADN et le maintien des télomères. Les rôles des complexes SMC, en particulier Smc5/6, dans la biologie des télomères ont donc été investigués. Les résultats montrent que les complexes SMC sont importants pour la survie pendant la sénescence en absence de télomérase. Les données obtenues pour Smc5/6 supportent un modèle dans lequel le complexe est requis pour la réplication complète et la réparation adéquate des chromosomes. De fréquentes cassures d’ADN au niveau des répétitions télomériques sont observées en absence du complexe, illustrant l’importance particulière de Smc5/6 pour la séparation des régions télomériques. Deuxièmement, il est établi que l’abondance de la télomérase est critique pour l’homéostasie des télomères. Mais le contrôle de l’expression de l’ARN T1c1 est encore obscur. L’analyse des séquences en 3' du gène TLC1 révèle des signaux reconnus par les 2 voies de terminaison de transcription par l’ARN polymérase II. Les résultats indiquent que la formation de T1c1 est contrôlée par la voie de terminaison des petits ARNs noncodants Nrd1/Nab3. T1c1 existe sous 2 formes, une majeure, non polyadénylée, présente dans la télomérase active, et une mineure, polyadénylée, dont le rôle est inconnu. Les données montrent que la synThèse et la fonction de l’ARN T1c1 mature ne nécessitent pas la forme polyA+ comme précurseur. La terminaison dépendante de la polyadénylation pourrait être un mécanisme de sûreté pour arrêter la transcription. Troisièmement, plusieurs maladies sont associées à des défauts dans le maintien des télomères. La PR est une maladie auto-immune causant une inflammation chronique et une destruction graduelle des articulations. Des études suggèrent que les lymphocytes de patients atteints de PR auraient des télomères anormalement courts. Ensuite, des marqueurs pronostiques fiables identifiant les patients qui développeront une arthrite persistante et sévère font actuellement défaut, mais seraient utiles afin d’élaborer des traitements plus efficaces. Une étude épidémiologique a donc été amorcée pour analyser l’érosion des télomères des lymphocytes dans une cohorte de patients avec arthrite débutante et évaluer de potentielles corrélations avec la progression et la sévérité de la maladie. Les résultats préliminaires obtenus par 3 techniques de mesure de la taille des télomères (TRF, STELA et qPCR) sont incomplets, mais semblent indiquer un défaut dans le maintien des télomères chez les patients. Les observations illustrent aussi les limites des études épidémiologiques longitudinales analysant la taille des télomères.

La terminaison de la transcription est essentielle, aussi bien pour assurer la formation de l’extrémité 3’ de transcrits fonctionnels que pour éviter les phénomènes d’interférence transcriptionnelle entre des régions transcrites adjacentes. Ceci est particulièrement important dans un génome compact comme celui de S. cerevisiae. La terminaison est aussi l’une des stratégies principales que la cellule emploie pour contrôler et limiter la transcription dite envahissante ou cachée. Chez S. cerevisiae, l’ARN polymérase II est responsable de la transcription des ARNm et de nombreuses classes d’ARN non codants tels que les sn(o)ARN et les CUT (Cryptic Unstable Transcripts). Ces derniers représentent une fraction importante des transcrits issus de la transcription cachée. Il existe deux voies canoniques de terminaison de la transcription par cette polymérase. Elles font intervenir le complexe de clivage et de polyadénylation, CPF-CF, notamment pour la terminaison des ARNm ou le complexe NNS pour la terminaison des sn(o)ARN et des CUT. Au cours de ma thèse j’ai étudié deux aspects de la terminaison de la transcription : 1) l’étude des motifs de recrutement du complexe NNS et 2) l’identification et la caractérisation d’une nouvelle voie de terminaison par le facteur Rap1. Les complexes CPF-CF et NNS agissent tous les deux en liant le transcrit naissant et l’ARN pol II. Le complexe NNS lie l’ARN naissant grâce à ses sous-unités Nrd1 et Nab3 qui reconnaissent des motifs spécifiques. Cependant, bien que la séquence de ces motifs soit maintenant connue, leur présence ne permet pas de définir de façon certaine un terminateur. En effet, le nombre de ces motifs varie beaucoup d’un terminateur à l’autre. Afin de mieux comprendre la structure des terminateurs ciblés par le complexe NNS et l’organisation des motifs liés par Nrd1 et Nab3, j’ai recherché les séquences impliquées dans la terminaison d’un CUT modèle en réalisant une mutagenèse aléatoire et j’ai identifié par SELEX des motifs de fixation optimale du dimère Nrd1-Nab3. Un second volet de ma thèse porte sur la caractérisation d’une nouvelle voie de terminaison de la transcription dépendante du facteur Rap1. Rap1 est important pour la structure des télomères et c’est aussi un facteur de transcription ciblant des centaines de promoteurs. Il active ou réprime l’initiation de la transcription notamment en recrutant des complexes de remodelage de la chromatine sur les promoteurs ciblés. De façon surprenante, le motif de fixation de ce facteur a été identifié dans des séquences capables de terminer la transcription isolées au laboratoire. Mes travaux ont permis de caractériser le mécanisme de terminaison par Rap1 et de distinguer cette voie des voies de terminaison canoniques. Ce facteur, lié à l’ADN, agit comme une barrière en bloquant la progression de l’ARN polymérase II par un mécanisme de « road-block ». Les polymérases ainsi arrêtées sont ciblées par une voie qui permet leur élimination lorsqu’elles sont bloquées par des dégâts sur l’ADN, impliquant leur ubiquitination et vraisemblablement leur dégradation par le protéasome. Les ARN libérés sont polyadénylés par la poly(A)-polymérase Trf4 et dégradés par l’exosome nucléaire. Ce mécanisme de terminaison est utilisé dans un contexte naturel puisque j’ai identifié des transcrits endogènes de S. cerevisiae terminés par cette voie. Nous proposons que la terminaison par Rap1 contribue au contrôle de la transcription envahissante. Ce facteur assurerait ainsi au niveau des promoteurs qu’il lie une double fonction de facteur de transcription et de protection de ces promoteurs contre l’interférence transcriptionnelle. / Transcription termination is essential, both for the 3’ end formation of functional transcripts and to avoid transcriptional interference between adjacent transcription units. This is particularly important in a compact genome such as S. cerevisiae. Termination is also one of the main strategies used by the cell to control and limit the “pervasive” or “hidden” transcription. In S. cerevisiae, RNA pol II is responsible for the transcription of the mRNAs and numerous non-coding RNA families such as the sn(o)RNAs and the CUTs (Cryptic Unstable Transcripts). CUTs represent a large fraction of the “pervasive” or “hidden” transcription. There are two canonical transcription termination pathways for this RNA polymerase. They involve the cleavage and polyadenylation complex (CPF-CF), in particular for the mRNAs termination, or the NNS complex for sn(o)RNAs and CUTs termination. During my thesis I studied two aspects or the transcription termination: 1) the motifs involved in the NNS complex recruitment on RNA and 2) the identification and the characterization of a new termination pathway by Rap1. CPF-CF and NNS complex are both recruited on the nascent transcript and on the RNA pol II. The NNS complex binds the RNA through its subunits Nrd1 and Nab3 which recognize specific motifs. Nonetheless, even if these motif sequences are now known, their presence does not elicit the certain identification of NNS dependent terminators. To clarify the NNS dependent terminator structure and the organization of the motifs bound by Nrd1 and Nab3 I looked for the sequences involved in a specific CUT termination doing a random mutagenesis experiment and I identified by SELEX the Nrd1-Nab3 dimer optimal binding motifs. A second part of my thesis concerns the characterization of a new transcription termination pathway dependent on the Rap1 factor. Rap1 is important for the telomere structure and it is also a transcription factor that targets hundred of promoters. It activates or represses transcription initiation recruiting chromatin remodeling complexes on the targeted promoters. Surprisingly, the Rap1 binding motifs have been identified among sequences eliciting termination isolated in the laboratory. My work has led to the characterization of the termination mechanism by Rap1 and distinguished this pathway from the two canonical pathways. This factor, bound to DNA, acts as a barrier blocking the RNA pol II progression by a road-block mechanism. These arrested polymerases are targeted by a pathway responsible for the elimination of RNA pol II blocked by DNA damages, implying their ubiquitination and probably their degradation by the proteasome. The released RNAs are polyadenylated by the poly(A) polymerase Trf4 and degraded by the nuclear exosome. This termination mechanism is used in a natural context since I identified S. cerevisiae endogenous transcripts terminated by this pathway. We propose that the Rap1 termination contributes to the pervasive transcription control. This factor could elicit, on its bound promoters, a double function of both transcription factor and protection of these promoters against transcriptional interference.

Family, twin and adoption studies have clearly demonstrated that genetic factors are important in modulating the vulnerability to alcohol dependence. Several genome-wide association (GWA) studies of alcohol dependence have been conducted; however, few loci have been replicated. A meta-analysis was performed on two GWA studies of 1283 cases of alcohol dependence and 1416 controls in Caucasian populations. Through meta-analysis we identified 131 SNPs associated with alcohol dependence with p<10-4. The best novel signal was rs6701037 (p=1.86 × 10-7) at 1q24-q25 within KIAA0040 gene while the second best novel hit was rs1869324 (p=4.71 × 10-7) at 2q22.1 within THSD7B. The third novel locus was NRD1 at 1p32.2 (the top SNP was rs2842576 with p=7.90 × 10-6). We confirmed the association of PKNOX2 at 11q24.4 with alcohol dependence. The top hit of PKNOX2 (rs750338 with p=1.47 × 10-6) in the meta-analysis was replicated with the Australian Twin-Family Study of 778 families (p=1.39 × 10-2) Furthermore, several flanking SNPs of the top hits in the meta-analysis demonstrated borderline associations with alcohol dependence in the family sample (top SNPs were rs2269655, rs856613, and rs10496768 with p=4.58 × 10-3, 2.1 × 10-4, and 2.86 × 10-3 for KIAA0040, NRD1 and THSD7B, respectively). In addition, ALK, CASC4, and SEMA5A were strongly associated with alcohol dependence (p<2 × 10-5) in the meta-analysis. In conclusion, we identified three new loci (KIAA0040, THSD7B and NRD1) and confirmed the previous association of PKNOX2 with alcohol dependence. These findings offer the potential for new insights into the pathogenesis of alcohol dependence.

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