Divers agents environnementaux peuvent causer des dommages à l’ADN qui, si non réparés, peuvent mener à des mutations et éventuellement le cancer. Des mécanismes de réparation sont donc nécessaires afin de maintenir l’intégrité du génome. Un de ces mécanismes est la réparation par excision de nucléotides (NER) qui va réparer des dommages qui causent une distorsion dans l’hélice d’ADN comme ceux formés par les rayons UV. La NER se divise en deux sous-voies : la réparation global du génome (GGNER), responsable de réparer l’ADN transcriptionnelement inactif ainsi que le brin nontranscrit de gènes actifs, et la réparation couplée à la transcription(TC-NER), responsable de réparer le brin transcrit de gènes actifs. La TC-NER ne diffère de la GG-NER que par la méthode de reconnaissance du dommage et va réparer les dommages plus rapidement que la GG-NER. Chez Saccharomyces cerevisiae, les gènes de l’ARN ribosomal peuvent exister en 2 états distinct dans la cellule, soit actifs et transcrits par l’ARN polymerase I ou soit inactifs et recouverts de nucléosomes. Des études ont démontré que suite à une irradiation aux UV, il y avait fermeture des gènes ribosomaux actifs et réouverture au fur et à mesure que les dommages sont réparés. De plus, il a été démontré, qu’après irradiation, il y avait une présence plus importante d’ARN polymerase I au début du gène qu’à la fin. Ces évidences suggèrent que la TC-NER va réparer les dommages au début du gène et que son influence va diminuer au fur et à mesure qu’on avance dans le gène. Ainsi, les travaux présentés dans ce mémoire vise à évaluer l’impact de la TC-NER sur la cinétique de réparation de l’ADN ribosomal. À cet effet, une série d'extension d’amorces ont été effectuées dans différentes régions du gène de l’ARN ribosmal 35S. Ces analyses ont montré que la réparation des dommages UV au début du gène est médiée par la TCNER alors que plus loin dans le gène, la réparation est médiée en plus grande partie par la GG-NER. De plus, l’analyse de la réparation dans la région terminatrice de la transcription a montré que la TC-NER s’arrête au site principal de terminaison T1 dans une souche WT. Alors que dans une souche ayant un défaut dans le terminaison de la transcription, rpal2A, la TC-NER arrête au site terminaison secondaire T2. Dans une autre souche déficiente dans la terminaison, nsi1[triangle], le TC-NER n’est pas détectable après le site T1, mais une réparation plus rapide est observée après le site T2. [symboles non conformes]

La transcription cachée est un phénomène répandu aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes. Elle se caractérise par une production massive d’ARNs non-codants au niveau de régions non-annotées du génome et est potentiellement dangereuse pour la cellule car elle peut interférer avec l’expression normale des gènes. Chez S. cerevisiae, l’hélicase Sen1 induit la terminaison précoce de la transcription non-codante et joue ainsi un rôle clé dans le contrôle de la transcription cachée. Sen1 est très conservée et des mutations dans son homologue humain, senataxin (SETX), ont été associées à des maladies neurodégénératives. Malgré de nombreuses recherches menées sur ces protéines, leurs propriétés biochimiques ainsi que leurs mécanismes d’action restent peu connus. Durant ma thèse, j’ai étudié le mécanisme de terminaison par Sen1.Premièrement, j’ai caractérisé les activités biochimiques de Sen1 et analysé comment elles permettent d’induire la terminaison. Pour cela, j’ai utilisé un ensemble de techniques in vitro, notamment un système de transcription-terminaison qui contient uniquement des composants purifiés : Sen1, l’ARN polymérase II (Pol II) et les ADN matrices. Ce système permet de modifier les différents éléments de façon contrôlée afin de comprendre leur rôle précis dans la terminaison. J’ai tout d’abord analysé la fonction des différents domaines de Sen1 dans la terminaison. Sen1 est une protéine de taille importante qui possède un domaine central catalytique flanqué par deux domaines impliqués dans l’interaction avec d’autres facteurs. J’ai montré que le domaine hélicase est suffisant pour déclencher la terminaison de la transcription in vitro. Ensuite, j’ai montré que Sen1 utilise l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP pour se déplacer sur des acides nucléiques simple bras (ARN et ADN) dans le sens 5’ vers 3’. J’ai alors étudié le rôle des différents acides nucléiques du système dans la terminaison par Sen1 et j’ai montré que l’interaction de Sen1 avec l’ADN n’est pas nécessaire; en revanche Sen1 doit s’associer à l’ARN naissant et se déplacer vers la polymérase. J’ai aussi montré qu’une fois que Sen1 entre en collision avec la Pol II, elle y exerce une action mécanique qui conduit à la terminaison uniquement quand la Pol II marque une pause. Cela indique que la terminaison est fortement dépendante de la pause transcriptionnelle. Deuxièmement, en collaboration avec le groupe d’E. Conti, nous avons réalisé une analyse structure-fonction du domaine hélicase de Sen1. Nous avons observé que Sen1 présente une organisation similaire à celle d’autres hélicases proches avec un core composé de deux domaines de type RecA avec plusieurs domaines auxiliaires. En général, le core est très conservé au sein des hélicases proches, alors que les domaines accessoires ont des caractéristiques distinctes qui confèrent des propriétés spécifiques aux différentes hélicases. En effet, nous avons identifié un sous-domaine spécifique à Sen1 mais conservé au cours de l’évolution que nous avons appelé le “brace”. Nous avons également détecté des différences notables au niveau d’un autre domaine accessoire que nous avons nommé le “prong”. Nous avons pu montrer que le “prong” est essentiel pour la terminaison par Sen1. Nos données suggèrent que les caractéristiques structurales spécifiques de Sen1 que nous avons révélées sont des déterminants majeurs de son activité dans la terminaison de la transcription. Finalement, nous avons utilisé Sen1 comme modèle pour étudier des mutations dans SETX qui sont associées à des maladies neurodégénératives. Nous avons introduit chez Sen1 une partie des mutations liées à des maladies et nous avons réalisé une caractérisation biochimique complète de chaque mutant. Nous avons ainsi montré que toutes les mutations sont fortement délétères pour la terminaison de la transcription. En conclusion, nos résultats ont permis d’améliorer la compréhension de l’origine des maladies provoquées par des mutations dans SETX. / Pervasive transcription is a common phenomenon both in eukaryotes and prokaryotes that consists in the massive production of non-coding RNAs from non-annotated regions of the genome. Pervasive transcription poses a risk that needs to be controlled since it can interfere with normal transcription of canonical genes. In S.cerevisiae, the helicase Sen1 plays a key role in restricting pervasive transcription by eliciting early termination of non-coding transcription. Sen1 is highly conserved across species and mutations in the human Sen1 orthologue, senataxin (SETX), are associated with two neurological disorders. Despite the major biological relevance of Sen1 proteins, little is known about their biochemical properties and precise mechanisms of action. During my PhD I have studied in detail the mechanisms of termination by Sen1.In a first project, I have characterized the biochemical activities of Sen1 and investigated how these activities partake in termination. To this end I have employed a variety of in vitro approaches, including a minimal transcription-termination system containing only purified Sen1, RNA polymerase II (RNAPII) and DNA transcription templates that allows modifying the different elements of the system in a controlled manner to understand their role in termination. First, we have analysed the function of the different domains of Sen1 in termination. Sen1 is a large protein composed of a central catalytic domain flanked by additional domains with proposed roles in protein-protein interactions. We have demonstrated that the central helicase domain is sufficient to elicit transcription termination in vitro. Next, we have shown that Sen1 can translocate along single-stranded nucleic acids (both RNA and DNA) from 5’ to 3’. Then, we have analysed the role of the different nucleic acid components of the elongation complex (i.e. nascent RNA and DNA transcription templates) in termination. Our results indicate that termination does not involve the interaction of Sen1 with the DNA but requires Sen1 translocation on the nascent RNA towards the RNAPII. Importantly, we show that upon encountering RNAPII, Sen1 can apply a mechanical force on the polymerase that results in transcription termination when RNAPII is paused under certain conditions. This indicates that RNAPII pausing is a strict requirement for Sen1-mediated termination. In a second project, in collaboration with the group of E. Conti we have performed a structure-function analysis of the helicase domain of Sen1. Comparison of Sen1 structure with that of other related helicases has revealed an overall similar organization consisting in two tandem RecA-like domains from which additional accessory subdomains protrude. In general, the core RecA-like domains are very well conserved among related helicases and most variation is found in the accessory subdomains, that often confer specific characteristics to different helicases. Indeed, we have found that Sen1 contains a unique but evolutionary conserved structural feature that we have dubbed the “brace”. In addition, Sen1 is different from other helicases in an auxiliary subdomain that we have named the “prong”. Importantly, we have shown that the integrity of this subdomain is critical transcription termination by Sen1. We propose that the specific features identified in our structural analyses are important determinants of the transcription termination activity of Sen1. Finally, we have used Sen1 as a model to investigate the molecular effect of SETX mutations linked to neurodegenerative diseases. We have introduced disease-associated mutations in Sen1 and performed a complete biochemical characterization of the different mutants in vitro. Importantly, we found that all mutants were severely affected in transcription termination. Taken together, our results elucidate the key structural determinants of the function of Sen1 and shed light on the molecular origin of the diseases associated with SETX mutations.

La transcription bactérienne est un processus dans lequel l'information codée dans l'ADN est transféré à l'ARN messager (ARNm). Au cours de la dernière étape de ce procédé, la terminaison de la transcription, l'ARNm est libéré et peut être utilisé pour la synthèse des protéines. Un type de terminaison de la transcription décrit chez les bactéries est la terminaison Rho-dépendante. Le rôle de Rho a été largement étudié dans le modèle à Gram négatif bactérie, Escherichia coli dans laquelle Rho est une protéine essentiel est abondant. En revanche, la connaissance de Rho chez les bactéries qui il ne sont pas essentiels et est présent en faibles quantités: par exemple Gram-positif Bacillus subtilis reste limité..Pour étudier le rôle de Rho dans le contrôle de l'expression des gènes chez B. subtilis plusieurs analyses à grande échelle ont été réalisées, y compris des tests d'interactions physiques et fonctionnelles et une analyse globale des changements observés dans l'expression des gènes en corrélation avec la production de protéines.En effet, un ensemble des Rho-spécifiques interactions physiques et fonctionnelles ont été établies. En outre, de nouveaux phénotypes de mutant dépourvu de rho ont été décrits ce qui élucider le rôle de Rho dans le contrôle des différents aspects de la physiologie cellulaire. / Bacterial transcription is a process in which the information encoded in DNA is transferred to messenger RNA (mRNA). During the final step of this process, transcription termination, mRNA is released and can be used for protein synthesis. One type of transcription termination described in bacteria is Rho-dependent termination. The role of Rho has been widely investigated in model Gram-negative bacterium, Escherichia coli in which Rho is essential an abundant protein. In contrast, the knowledge about Rho inbacteria in which it is not essential and is present in low amounts, i. e. Gram-positive Bacillus subtilis remains limited.To investigate the role of Rho in control of gene expression in B. subtilis several large-scale analysis were performed. In effect, a set of Rho-specific physical and functional interactions were established. Additionally, new phenotypes of rho-null mutant were described unraveling the role of Rho in control of different aspects of cell physiology.

Le complexe condensine est le moteur de la condensation mitotique des chromosomes, un processus essentiel à la stabilité du génome au cours de la division cellulaire. De nombreuses données publiées indiquent qu’il existe des liens fonctionnels étroits entre le processus de transcription des gènes et le processus d’organisation des chromosomes par condensine. Ces données sont toutefois souvent contradictoires et aucun modèle ne fait actuellement consensus pour expliquer les liens entre transcription et condensine. Au cours de cette thèse, nous avons montré chez la levure Schizosaccharomyces pombe qu’en l’absence de l’hélicase à ADN/ARN Sen1, condensine s’accumule spécifiquement à proximité des gènes transcrits par l’ARN Polymérase III. Nous avons utilisé ces observations pour mieux comprendre les liens entre transcription par l’ARN polymérase III et le positionnement de condensine. Nos données montrent que Sen1 est un cofacteur de l’ARN Polymérase III impliqué dans la terminaison de la transcription. Ce résultat est important car il démontre que les modèles existants qui affirment que l’ARN polymérase III termine de transcrire de façon autonome sont erronés. Nous avons ensuite démontré que les défauts de terminaison de l’ARN polymérase III observés en l’absence de Sen1 suffisent entièrement à expliquer l’accumulation de condensine en ces sites. Cette observation importante démontre que le contrôle de qualité de la transcription est directement impliqué dans le positionnement de condensine sur les chromosomes en mitose. Nos résultats nous permettent de proposer qu’au-delà d’un certain seuil, la densité en ARN polymérases est un obstacle à la translocation de condensine sur les chromosomes. / The condensin complex is a key driver of chromosome condensation in mitosis. The condensin-dependent assembly of highly compacted chromosomes is essential for the faithful transmission of the genome during cell division. Many independent studies have established that gene transcription impacts the association of condensin with chromosomes, but the molecular mechanisms involved are still unclear. This is especially true as a number of sometimes contradictory mechanisms have been proposed so far. Here, we show in Schizosaccharomyces pombe that condensin accumulates specifically in the vicinity of a subset of RNA polymerase III-transcribed genes in the absence of the conserved DNA/RNA helicase Sen1. We demonstrate that Sen1 is a cofactor of RNA polymerase III (RNAPIII) required for efficient transcription termination. These results are important because they fundamentally challenge the pre-existing view that RNAPIII terminates transcription autonomously. Strikingly, we show that the RNAPIII transcription termination defects are directly responsible for the accumulation of condensin in the absence of Sen1. This indicates that the quality control of transcription impacts the distribution of condensin on mitotic chromosomes. We propose that above a certain density threshold, the accumulation of RNAPIII constitutes a barrier for the translocation of condensin on chromosomes.

L’expression des gènes est un ensemble hautement régulé de mécanismes ayant pour objectifs de synthétiser les protéines fonctionnelles dont la cellule a besoin à partir des codes inscrits dans l’ADN. Pour contrôler la quantité de signal utilisé et pour que ce message puisse physiquement traverser la cellule, celle-ci utilise la transcription des ARN messagers comme intermédiaire. Pour assurer la qualité de ce signal et pour contrôler son niveau d’expression, plusieurs mécanismes de dégradation des ARNm se coordonnent dans les organismes en fonction de leurs spécificités propres. La littérature a depuis longtemps démontré les liens entre les machineries de synthèse des ARNm et celles de leur dégradation en identifiant comment ceux-ci travaillent ensemble pour assurer une bonne régulation génique. Un de ces mécanismes induit une terminaison dans la région non-codante en 3’ de certains gènes à partir d’un clivage par la ribonucléase III. Dans ce mémoire, nous voulons démontrer qu’un mécanisme similaire dépendant de la ribonucléase III peut induire une terminaison prémature de la transcription à l’intérieur même de séquences codantes. Ce mécanisme semble être indépendant du promoteur et du terminateur des gènes, préférant réguler sa sélectivité à partir de la structure liée au clivage de l’ARNm. Plusieurs séquences et structures sous forme de tige-boucles d’ARNm peuvent être reconnues par la ribonucléase III. Cependant, il existe des différences fonctionnelles entre les différentes tige-boucles et toutes n’induisent pas un mécanisme de terminaison prématurée. Comme ce type de mécanisme doit être inductible et/ou permissible afin de ne pas empêcher complètement l’expression des gènes cibles, nous pouvons potentiellement faire affaire à un nouveau modèle de régulation génique. / Abstract : Gene expression is a highly regulated coordination of processes with the objective of producing functional proteins from the DNA code of the cell. To control the amount of proteins produced, cells use messenger RNAs as an intermediate to permit genomic information to move across the cell. To assure the quality of this signal and to control the level of gene expression, many RNA degradation mechanisms coordinate together according to their own specificities. Scientific literature has demonstrated long ago the existing interactions between RNA synthesis and RNA degradation pathways and how they closely work together to achieve viable gene expression regulation. One of those mechanisms induces transcription termination in the 3’ untranscribed region of coding genes initiated with a RNA cleavage from a ribonuclease III. In this master thesis, we show that a similar RNase III dependent mechanism can induce premature transcription termination inside the coding sequence. This mechanism seems promotor and terminator independent and depends mostly on the sequence coding for a stem-loop structure in the mRNA. Different sequences can induce a stem-loop structure recognizable by RNase III. However, there are some functional differences between stem-loop structures and not all of them can induce premature transcription termination. Since this mechanism must not happen every time and somehow must be inducible to permit gene expression when needed, this could possibly lead to a new gene regulation model.

L’ARN polymérase II (ARNPII) synthétise des ARNs codants et des ARNs non-codants (ARNnc) tels que les petits ARNs nucléaire/nucléolaire (sn/snoRNAs) et les CUTs (Cryptic Unstable Transcripts). Les CUTs sont des transcrits ubiquitaire souvent produits dans des régions codants dont la transcription peut interférer avec l’expression des gènes. Le contrôle de l’expression des ARNnc est essentiel et se fait aux niveaux de la terminaison de la transcription et la dégradation de l’ARN. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae la terminaison de la transcription des gènes codants est effectuée par le Facteur de Clivage et de Polyadénylation (CPF), tandis que les ARNnc courts sont terminés par le complexe Nrd1p-Nab3p-Sen1p (NNS). La terminaison de la transcription est régulée par la phosphorylation du domaine C-terminal (CTD) de l’ARNPII composé de répétitions du motif Y1S2P3T4S5P6S7. Un niveau élevé de phosphorylation des résidus Ser5 près du promoteur permet l’activité du complexe NNS. La phosphorylation des résidus Ser2 est catalysée durant la transcription par la kinase Ctk1p et ces résidus sont reconnus par des éléments de la voie CPF. Mon travail de thèse a porté sur le mécanisme de terminaison de la transcription par le complexe NNS. La terminaison NNS dépend de la liaison de Nrd1p et Nab3p à des motifs dans l’ARN naissant et l’activité hélicase de Sen1p qui provoque le relarguage de la polymérase. La sous-unité Nrd1p interagit avec le domaine CTD de l’ARNPII phosphorylé sur Ser5 à travers son domaine CID (CTD-interaction domain). Le rôle du CID dans la terminaison à été proposé mais pas encore clairement démontré. En collaboration avec le groupe de P. Cramer (Université Louis-et-Maximilien de Munich Allemagne) nous avons mis en évidence que le CID est requis pour une terminaison efficace par la voie NNS et qu’il est important pour le recrutement de Nrd1p sur l’ARNPII. Le CID est aussi impliqué de manière directe ou indirecte dans l’interaction de Sen1p avec Nrd1p et Nab3p. En parallèle, avec le groupe de F. Holstege (Université Centre Médicale de Utrecht, Pays-Bas) nous avons montré que la phosphorylation en Ser2 du domaine CTD est requise pour une terminaison efficace par la voie NNS. De manière surprenante, ce résidu joue un rôle mineur dans la terminaison des ARNs codants effectuée par le complexe CPF. Les ARNs naissant terminés par le complexe NNS sont rapidement ciblés par le complexe nucléase exosome/Rrp6p et son cofacteur TRAMP ce qui mène a la maturation des sn/snoRNAs et la destruction des CUTs. Le complexe NNS interagit in vivo avec l’exosome et le complexe TRAMP, ce qui facilite la dégradation. Cependant les détails moléculaires de cette interaction restent inconnus. Nous avons montré que le domaine CID est requis et suffisant in vivo et in vitro pour l’interaction de Nrd1p avec la partie C-terminale de la sous-unité Trf4p du complexe TRAMP, que nous avons appelé NIM (Nrd1p-Interaction Motif). En collaboration avec le groupe de R. Stefl (Université Masaryk, République Tchèque) nous avons étudié par spectroscopie RMN la structure de ce motif NIM lié au CID. Nous avons mis en évidence que le CID lie le NIM et le CTD de façon similaire, et que ces interactions sont mutuellement exclusives. Le NIM se lie au CID environ 100 fois plus fortement qu’au CTD. Nous proposons que ces interactions alternatives de Nrd1p définissent des formes différentes du complexe NNS, une qui fonctionne dans la terminaison de la transcription, l’autre qui est active dans la dégradation. In vitro l’interaction du NIM avec le CID stimule l’activité poly(A)-polymérase de Trf4p ce qui suggère une fonction importante de cette interaction dans la dégradation. Nous montrons aussi que Rrp6p interagit directement avec Trf4p et cette liaison in vivo sert à recruter le complexe TRAMP à l’exosome Nous proposons que ce jeu serré d’interactions entre les complexes NNS, TRAMP et l’exosome/Rrp6p contribue à augmenter l’efficacité de dégradation de l’ARN in vivo / The RNA polymerase II (RNAPII) synthesizes protein-coding RNAs and many non-coding RNAs (ncRNAs) such as small nuclear/nucleolar (sn-/snoRNAs) and Cryptic Unstable Transcripts (CUTs). CUTs are ubiquitously transcribed including overlapping and antisense to genes, which can interfere with gene expression. Control of ncRNA expression is vital and also operates at the level of transcription termination and RNA degradation.In yeast Saccharomyces cerevisiae transcription of protein-coding genes is terminated by the Cleavage and Polyadenylation Factor (CPF), while short ncRNAs are generated by transcription termination dependent from the Nrd1p-Nab3p-Sen1p (NNS) complex. Transcription termination is regulated by phosphorylation of the carboxy-terminal domain (CTD) of the Rpb1p subunit of RNAPII, composed of repeats of the Y1S2P3T4S5P6S7 motif. Promoter-proximal high levels of serine 5 phosphorylated (Ser5P) CTD favors the function of the NNS pathway while the Ser2 phosphorylated mark (Ser2P), which is gradually introduced during transcription by Ctk1p, is recognized by components of the CPF pathway. The study of the mechanism of action of the NNS complex was the subject of my PhD work.NNS-dependent transcription termination is driven by the recognition of four nucleotide motifs in the nascent RNA by Nrd1p and Nab3p and the release of the RNAPII by the Sen1p helicase. Nrd1p interacts with the CTD-Ser5P via its CTD-interaction domain (CID). Thus a role of the CID in termination was anticipated but not demonstrated. In collaboration with the group of P. Cramer (Ludwig Maximilian University of Munich, Germany), we have shown that the Nrd1p CID domain is required for efficient transcription termination at most NNS-target genes and that it is important for the recruitment of Nrd1p to the RNAPII. This domain is also involved, directly or indirectly, in the interaction of the Sen1p helicase with Nrd1p and Nab3p. In the second project, in collaboration with F. Holstege group (University Medical Center Utrecht, Netherlands), we have shown that the CTD-Ser2P mark is important for efficient transcription termination by the NNS pathway but, surprisingly, it appears to play a minor role in termination of mRNA-coding genes by the CPF-complex.Shortly after NNS-dependent termination, the released ncRNAs are targeted by the nuclear exosome/Rrp6p nuclease complex and its cofactor the TRAMP which results in trimming of sn-/snoRNAs to a mature form and complete degradation of CUTs. The NNS complex co-purifies in vivo with the TRAMP/exosome, which is believed to facilitate subsequent degradation and processing. However, the molecular details of this interaction are unknown. We show that the CID is required and sufficient in vivo and in vitro for the interaction of Nrd1p with a motif present in the C-terminal region of Trf4p, which we called NIM (for Nrd1p-Interaction Motif). In collaboration with the group of R. Stefl (Masaryk University, Czech Republic), we obtained the NMR structure of the CID bound to the NIM and demonstrated that the CID binds in a similar manner to the CTD and the NIM. The CID interacts with the CTD and the NIM in a mutually exclusive manner and the former interaction is roughly 100 times stronger than the first. We propose that these alternative interactions represent two forms of the NNS complex, one functioning in termination and the other in degradation. Importantly, the NIM-CID interaction is likely to be functionally relevant since in vitro it results in the stimulation of the polyA polymerase activity of the Trf4p. We further show that Trf4p interacts directly with Rrp6p, which in vivo serves to recruit the TRAMP to the core exosome complex. This tight interplay between the NNS, TRAMP and exosome/Rrp6p complexes most likely accounts for the efficiency of RNA degradation in vivo.