Le monoxyde d'azote (NO) produit par les différentes synthases (NOS), ainsi que ses espèces dérivées, affectent la production de prostanoïdes.Le but de la présente étude est de déterminer l'influence de la NOS inductible (iNOS) sur la production de prostanoïdes endogènes impliqués dans le contrôle de la réactivité plaquettaire en conditions physiologiques ainsi que chez la souris athérosclérosée (ApoE-/-). Dans un premier temps, des souris iNOS-/- et eNOS-/- ont été utilisées pour effectuer une analyse comparative des taux plasmatiques de prostanoïdes et des effets anti-plaquettaires ex vivo de l'endothéline-1 (ET-1) et de la bradykinine (BK). L'injection systémique d'ET-1 augmente les taux plasmatiques de prostacycline (PGI[indice inférieur 2]) et provoque une inhibition de l'agrégation plaquettaire chez les souris de type sauvage (TS) et eNOS-/- mais pas chez les souris iNOS-/-. Nous montrons aussi que l'ET-1 stimule la production de radicaux libres chez les souris de TS mais pas chez les souris iNOS-/-. De plus, l'administration d'un traitement anti-oxydant chez les souris de TS, induit une perte de la capacité de l'ET1 à augmenter significativement les taux plasmatiques de PGI[indice inférieur 2]. Dans un deuxième temps, nous avons tenté de déterminer si les mécanismes endogènes d'inhibition de la fonction plaquettaire étaient intacts chez la souris Apolipoprotéine E-/- (ApoE-/-). Lorsque ces souris sont âgées de 8-10 semaines, on observe que l'ET-1 et la BK induisent une inhibition de l'agrégation plaquettaire ex vivo, alors qu'à l'âge de 18-20 semaines, on assiste à une perte considérable de l'effet anti-plaquettaire des deux peptides. Or, chez ces souris de 18-20 semaines, on observe que l'ET-1 et la BK sont efficaces pour augmenter les taux plasmatiques de PGI[indice inférieur 2]. De plus, un analogue de la PGI[indice inférieur 2] et un donneur de NO réduisent tous deux l'agrégation plaquettaire in vitro chez les souris ApoE-/- à un degré comparable à ce qui est observé chez les souris de TS. D'autre part, les souris ApoE-/-iNOS-/- âgées de 18-20 semaines montrent, tout comme leurs congénères ApoE-/-, une perte importante de la fonction anti-plaquettaire de l'ET-1, bien que l'ET-1 préserve sa capacité à augmenter les taux plasmatiques de PGI[indice inférieur 2]. Ainsi, nous montrons pour la première fois que la iNOS, en conditions physiologiques, est impliquée de façon importante dans la production de PGI[indice inférieur 2] et dans l'inhibition de l'agrégation plaquettaire induites par l'ET-1. De plus, nos résultats montrent une altération des capacités endogènes d'inhibition de la réactivité plaquettaire qui progresse en fonction de l'âge chez les souris ApoE-/- et ApoE-/-iNOS-/-. Enfin, chez les souris souffrant d'athérosclérose, la iNOS ne semble pas avoir une implication aussi importante que celle observée en conditions physiologiques dans l'effet anti-plaquettaire de l'ET-1. Nous suggérons que notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes endogènes régissant l'activité des plaquettes sanguines dans le modèle murin en situations physiologique et pathologique.

Des études récentes au laboratoire ont montré que la bradykinine (BK) et l'endothéline-1 (ET-1) administrées de façon systémique chez la souris inhibent l'agrégation plaquettaire ex vivo induite par l'adénosine 5'-diphosphate (ADP). Cette inhibition est dépendante de la relâche endothéliale de prostacycline (PGI[indice inférieur 2]) dans la circulation. La PGI[indice inférieur 2] augmente l'adénosine 3'5'-monophosphate cyclique (AMPc) plaquettaire afin d'empêcher l'activation des plaquettes (LABONTE et al. , 2001). De plus, il a été montré au laboratoire que dans un modèle de souris déficientes pour l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS[indice supérieur -/-]), l'ET-1 perd sa capacité à induire une hausse du stress oxydatif, à induire la relâche endothéliale de PGI[indice inférieur 2] et à inhiber l'agrégation plaquettaire ex vivo (CARRIER et al. , 2007). Nous avons évalué l'effet d'un traitement antioxydant sur l'activité antiplaquettaire de l'ET-1 chez la souris. Nous avons donc voulu évaluer le rôle du stress oxydant dans l'inhibition de l'agrégation plaquettaire par l'ET-1 chez la souris de type sauvage. Les souris soumises à un traitement antioxydant, l'inhibiteur de la NAPDH oxydase, l'apocynine, et le mimétique de la superoxyde dismutase (SOD), le TEMPOL, durant 24 jours répondent de façon semblable aux souris non-traitées à l'ET-1 et à la BK i.v. au. niveau de la pression artérielle moyenne (PAM). Par contre, le traitement antioxydant réduit la capacité de l'ET-1, mais pas celle de la BK, à inhiber l'agrégation plaquettaire ex vivo . De plus, la capacité de l'ET-1 à augmenter les niveaux d'AMPc in vivo est réduite, contrairement à celle de la BK. Nous montrons ainsi l'importance la production du superoxyde dans l'activité antiplaquettaire de l' ET-1. Nous avons ensuite évalué le comportement des plaquettes dans un modèle murin d'athérosclérose qui consiste en des souris déficientes pour l'apolipoprotéine E (ApoE[indice supérieur -/-]). Nous avons d'abord observé une hausse de la réactivité plaquettaire en fonction de l'âge chez les souris ApoE[indice supérieur -/-]. De plus, des résultats dans le laboratoire indiquent que la BK, malgré une relâche normale de PGI[indice inférieur 2] dans la circulation, perd sa capacité à inhiber l'agrégation plaquettaire ex vivo . Nous avons alors évalué l'inhibition de l'agrégation plaquettaire ex vivo suite à l'infusion i.v. de PGI[indice inférieur 2]. Alors que l'infusion de PGI[indice inférieur 2] réduit la PAM de façon similaire chez les souris de type sauvage (WT) et ApoE[indice supérieur -/-], elle inhibe l'agrégation plaquettaire ex vivo chez les souris WT et les souris ApoE[indice supérieur -/-] âgées de 8-10 semaines, mais pas les souris ApoE[indice supérieur -/-] de 18-20 semaines. Étonnamment, autant la BK que la PGI[indice inférieur 2] sont en mesure d'augmenter les niveaux d'AMPc plaquettaire in vivo , autant chez les souris WT ou ApoE[indice supérieur -/-], 8-10 semaines et 18-20 semaines. Nos résultats montrent donc le rôle important du stress oxydatif sur l'activité antiplaquettaire de l'ET-1 ainsi qu'une perte de l'activité antiplaquettaire de la PGI[indice inférieur 2] chez les souris ApoE[indice supérieur -/-] soufrant d'athérosclérose.

La répression génétique complète de l’enzyme de conversion de l’endothéline-1 (ECE) chez la souris ne réduit que de 45% les taux tissulaires du puissant facteur vasoactif suggérant que d’autres enzymes protéolytiques sont impliquées dans la production dudit peptide. Nous avons récemment rapporté (Houde et al., 2013) que la protéase mastocytaire de type 4 (mMCP-4) synthétise l’ET-1 chez la souris anesthésiée in vivo et dans des extraits tissulaires in vitro. La source cellulaire principale de cette activité ECE-indépendante demeure toutefois inexplorée à ce jour. Le but de cette étude est d’évaluer la capacité de la protéase mastocytaire de type 4 (mMCP-4) recombinante, extraite des mastocytes ou in vivo chez la souris consciente, dans la conversion de la big-ET-1 en ET-1 (1-31). Notre hypothèse principale est que la mMCP-4 représente une voie de synthèse significative d’ET-1 tant in vitro que chez la souris consciente. La mMCP-4 recombinante ou extraite de mastocytes péritonéaux de souris de type sauvage, mais non pas de souris mMCP-4 KO, possède une activité de type chymotrypsine sensible à un inhibiteur spécifique des chymases, le TY-51469. De plus, par HPLC et par spectrométrie de masse (Triple-TOF), une production TY-51469 sensible d’ET-1 (1-31) à partir de son précurseur la big-ET-1 est démontrée. D’autre part, la cinétique enzymatique de la mMCP-4 contre les substrats Ang I et big-ET-1 a été déterminée (K[indice inférieur M] : 19.31 ± 3.16 et 23.43 ± 5.314 μM respectivement). Cette enzyme a une activité similaire pour ces deux substrats (k[indice inférieur cat]/K[indice inférieur M] Ang I : 7.70 X 10[indice supérieur -3] μM[indice supérieur -1] X sec[indice supérieur -1] et big-ET-1 : 2.189 X 10[indice supérieur -3] μM[indice supérieur -1] X sec[indice supérieur -1]). L’administration systémique de big-ET-1 chez des souris conscientes, instrumentées en radio-télémétrie, montre une réduction d’environ 50 à 80% de la réponse pressive du précurseur chez des souris mMCP-4 KO lorsque comparées aux souris de type sauvage. Les souris conscientes montrent une hypersensibilité très significative par rapport à la souris anesthésiée en réponse à l’ET-1 exogène (déplacement vers la gauche de la courbe dose-réponse de plus de 6 à 7 unités logarithmiques). En contraste, l’affinité apparente (ID[indice inférieur 50]) d’un antagoniste ET[indice inférieur A], l’atrasentan contre l’ET-1, est similaire chez la souris consciente ou anesthésiée (0.8236 et 0.2101 mg/kg respectivement). Cette série de résultats illustrent que la souris consciente répond beaucoup plus efficacement aux agents presseurs et ce, sans altération de l’affinité des récepteurs pour leurs ligands endogènes respectifs. Tous nos résultats nous permettent donc de conclure que la chymase recombinante, dans les mastocytes ou chez la souris consciente convertit dynamiquement la big-ET-1 en ET-1 (1-31).

L'endothéline-1 (ET-1), un peptide de 21 acides aminés, est un puissant vasoconstricteur principalement sécrété par les cellules endothéliales (CEs). Dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLVs), plusieurs études ont rapporté que les effets de l'ET-1 sont relayés via l'activation du récepteur ET[indice inférieur A]. Par contre, il a récemment été démontré que, tout comme le récepteur ET[indice inférieur A], le récepteur ET[indice inférieur B] est aussi présent dans les CMLVs humaines et qu'il contribue à l'effet de l'ET-1 dans ce type cellulaire. Dans les cellules endothéliales vasculaires (CEVs), il a été rapporté que le récepteur ET[indice inférieur B] est le seul récepteur et que les actions de l'ET-1, dont l'excitation-sécrétion, sont relayées via l'activation du récepteur ET[indice inférieur B]. Cependant, toutes ces études ont été faites sur des CEVs d'origine animale et sur des CEs de la veine ombilicale humaine qui ne constituent pas un modèle représentatif des CEVs humaines adultes. Dans cette étude, nous avons voulu vérifier l'hypothèse que, non seulement le récepteur de l'ET-1 de type ET[indice inférieur B] est présent dans les CEVAhs, mais aussi le récepteur ET[indice inférieur A] et que l'activation de ces récepteurs par l'ET-1 module le niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur c] et [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur n]. En utilisant l'immunofluorescence indirecte combinée à la microscopie confocale et des études par immunobuvardage western, nous avons démontré la présence de l'ET-1 et du récepteur ET[indice inférieur B], mais aussi, pour la première fois, la présence du récepteur ET[indice inférieur A] dans les CEVAhs. De plus, la distribution de l'ET-1 et de ses récepteurs s'est avérée hétérogène dans les cellules avec une densité de fluorescence beaucoup plus élevée au niveau nucléaire. De plus, la densité du récepteur ET[indice inférieur A] au niveau cytosolique représente environ 25% de sa densité dans la cellule totale alors que celle d'ET[indice inférieur B] n'est que d'environ 5%. Dans la deuxième partie de notre étude, la mesure du calcium intracellulaire total par l'utilisation de la sonde ratiométrique, le Fura-2, combinée à l'imagerie en 2D, nous a permis de démontrer que l'ET-1 induit une augmentation concentration-dépendante du niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur i] total avec un EC[indice inférieur 50] de près de 10[indice supérieur -10] M. Nous avons aussi démontré, avec la sonde calcique Fluo-3 combinée à la microscopie confocale en 3D, que l'ET-1 induit une augmentation calcique intracellulaire aux niveaux cytosolique et nucléaire avec des valeurs de EC[indice inférieur 50] entre 10[indice supérieur -12] M et 10[indice supérieur -11] M. Ceci suggère que l'augmentation du [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur n] est en grande partie responsable de l'augmentation du [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur c]. Finalement, pour démontrer l'implication des récepteurs dans la modulation calcique, nous avons utilisé des antagonistes non peptidiques spécifiques à chacun des récepteurs soit A-192621 et ABT-627 pour les récepteurs ET[indice inférieur B] et ET[indice inférieur A] respectivement. Ces résultats suggèrent que, dans les CEVAhs, l'augmentation du niveau basal de [Ca[indice supérieur 2+]][indice inférieur i] total induite par l'ET-1 est relayée via le récepteur ET[indice inférieur A] alors que le récepteur ET[indice inférieur B] pourrait agir comme un frein sur le récepteur ET[indice inférieur A], en d'autres termes, comme un antagoniste physiologique. En conclusion, nos résultats ont démontré que le récepteur ET[indice inférieur A] est bien présent au niveau des cellules endothéliales aortiques humaines et que ce récepteur peut jouer un rôle important dans l'excitation-sécrétion dépendant du calcium intracellulaire.

L'ET-1, un peptide de 21 acides aminés, est un des plus puissants vasoconstricteurs isolés à date. Il est présent dans plusieurs tissus et est responsable de nombreuses actions biologiques. Chez l'humain, ces effets sont relayés par deux récepteurs couplés aux protéines G:ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B]. Précédemment, notre groupe a démontré que ces récepteurs sont présents au niveau de la membrane plasmique, du cytosol et du noyau incluant les membranes de l'enveloppe nucléaire des cellules endothéliales endocardiques isolées des ventricules gauche (CEEGs) et droit (CEEDs) du coeur foetal humain âgé de 20 semaines. De plus, notre groupe a montré que suite à l'activation des récepteurs à l'ET-1 situés au niveau de la membrane plasmique, l'ET-1 augmente le niveau de Ca[indices supérieurs 2+] intracellulaire libre des CEEs; les CEEGs étant plus sensibles à l'ET-1 que les CEEDs. Basé sur ces résultats, nous allons tester l'hypothèse que les récepteurs de l'ET-1, et en particulier le récepteur ET[indice inférieur B], présents au niveau des membranes de l'enveloppe nucléaire des CEEs augmentent le Ca[indices supérieurs 2+] nucléoplasmique et que la sensibilité de ces récepteurs nucléaires est différente de celle connue pour les récepteurs à l'ET-1 de la membrane plasmique. De plus, il est possible que l'activation des récepteurs ET[indice inférieur A] et/ou ET[indice inférieur B] de la membrane de surface induit leur internalisation, translocation ainsi que leur synthèse de novo. Nous proposons aussi que ces phénomènes peuvent être différents dans les CEEGs et les CEEDs. Dans la première partie de ce mémoire, nous avons étudié l'effet de concentrations croissantes d'ET-1 cytosolique sur le niveau de calcium nucléoplasmique des CEEGs et des CEEDs. Au niveau des noyaux des CEEDs, nous avons observé que la valeur de EC[indice inférieur 50] obtenue est plus élevée (1000 fois) que celle des noyaux des CEEGs suggérant que les récepteurs à l'ET-1 présents au niveau des membranes de l'enveloppe nucléaire sont plus sensibles à l'ET-1 au niveau des CEEGs par rapport aux CEEDs. Nos résultats montrent également que les récepteurs à l'ET-1 des membranes de l'enveloppe nucléaire des CEEDs et des CEEGs sont plus sensibles à l'ET-1 que ces mêmes récepteurs présents au niveau de la membrane plasmique et ce de 1000 fois pour les CEEGs et de 10 fois pour les CEEDs. De plus, nos résultats montrent qu'au niveau des CEEDs et des CEEGs, l'ET-1 cytosolique induit une augmentation du [Ca[indices supérieurs 2+]][indice inférieur n] qui est relayée par le récepteur ET[indice inférieur B]. Dans la deuxième partie de ce mémoire, nous avons démontré que le traitement des cellules avec l'ET-1 à différents temps pouvait induire la mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B]. Nous avons observé une similarité dans le profil de mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] au niveau des CEEDs suggérant que la cinétique de l'internalisation, de la dégradation et de la synthèse de novo peut être la même indépendamment du type de récepteur activé. De plus, nos résultats montrent que la cinétique et le décours de la mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] est différent dans les CEEGs par rapport aux CEEDs suggérant qu'il est important de considérer l'origine anatomique des CEEs. Nos résultats montrent également que la plupart des augmentations dans les niveaux du récepteur ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] au niveau des CEEs sont dues à des synthèses de novo sensibles à la cycloheximide.

La chymase est une protéase à sérine issue des mastocytes des tissus conjonctifs, dont l’isoforme chez la souris est la protéase mastocytaire-4 (mMCP-4). Elle clive la Big endothéline 1 (Big ET-1) en ET-1 (1-31), qui doit ensuite être clivée en ET-1 par la néprilysine (NEP) pour être biologiquement active. L’inhibition de la chymase montre l’importance de cette voie dans l’activité de la Big ET-1 exogène chez la souris. La chymase est aussi impliquée dans le développement des lésions athérosclérotiques et de leur rupture dans les modèles animaux et dans l’infarctus du myocarde chez l’humain. Dans des modèles expérimentaux de cette complication, l’inhibition pharmacologique de la chymase améliore la survie, les paramètres hémodynamiques cardiaques et le remodelage ventriculaire. Le but de notre étude était de confirmer le rôle spécifique de la mMCP-4 dans la synthèse de l’ET-1, la progression de l’athérosclérose et les conséquences de l’infarctus du myocarde chez la souris. Nous avons donc évalué l’impact de la répression génétique de la mMCP-4 dans la souris C57BL/6 (souris mMCP-4[indice supérieur -/-]). Les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] montrent une réponse hémodynamique diminuée à la Big ET-1 exogène. La production d’ET-1 et d’ET-1 (1-31) plasmatique est diminuée chez la souris mMCP-4[indice supérieur -/-]. Celle-ci exprime aussi des taux endogènes pulmonaires d’ET 1 réduits. Les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] affichent également une réduction de l’étendue des lésions athérosclérotiques à un stade précoce de la pathologie dans l’aorte de la souris athérosclérotique, la souris déficiente pour l’apolipoprotéine E (ApoE[indice supérieur -/-]). L’antagoniste mixte des récepteurs de l’endothéline, le macitentan, réduit aussi l’étendue des lésions dans les stades plus avancés de la pathologie. La répression de la mMCP-4 améliore les signes de stabilité de l’athérome avancé dans l’artère brachiocéphalique plus efficacement que le macitentan. Enfin, les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] soumises à une ligature permanente de l’artère coronaire antérieure descendante gauche montrent une survie nettement supérieure à celle leurs congénères de type sauvage. L’histochimie montre que le remodelage et l’amincissement aigus sont moins importants dans les ventricules de souris mMCP-4[indice supérieur -/-], les protégeant contre la rupture de la paroi libre du ventricule affectant toutes les souris WT qui n’ont pas complété l’étude de survie. L’imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP) révèle que les ventricules gauches cardiaques des souris mMCP-4[indice supérieur -/-] sont moins dilatés, leur fraction d’éjection est mieux conservée et la zone infarcie est moins grande. L’analyse glycoprotéomique indique que l’apolipoprotéine A1 est augmentée par la répression de la mMCP 4, qui diminue aussi les niveaux pulmonaires d’ET-1 24 h après l’infarctus. En conclusion, nos résultats montrent un rôle important de la mMCP-4 dans la synthèse de l’ET-1, le développement des lésions athérosclérotiques et les dommages causés par l’infarctus du myocarde chez la souris.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal