Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), par leurs caractéristiques de pluripotence et de prolifération illimitée, représentent une alternative à l’utilisation de cellules issues de patients : leur différenciation en cellules épithéliales respiratoires pourrait permettre la production illimitée d’épithélium pour le criblage de molécules thérapeutiques.L’objectif de notre travail a été de mettre au point un protocole simple et financièrement acceptable afin de différencier les CSEh en cellules épithéliales de voies aériennes et de produire un épithélium complet. Pour ce faire, nous avons suivi deux voies potentielles de différenciation des CSEh : une voie passant par la production d’endoderme définitif, feuillet embryonnaire à l’origine de l’épithélium respiratoire, et une voie passant par un progéniteur potentiel commun aux lignages respiratoire et épidermique. Différentes combinaisons de protéines matricielles, d’inducteur de différenciation, de temps d’induction et de milieux de culture ont été testées. Nos résultats montrent que la culture des CSEh sur cellules nourricières STO dans un milieu optimisé pour les cellules bronchiques, le BEGM, en présence de Bone Morphenetic Protein 4 et d’acide rétinoïque pendant 6 jours puis en BEGM seul pendant 30 jours conduit à l’obtention de plus de 76% de progéniteurs épithéliaux respiratoires exprimant des marqueurs spécifiques tels que CK13, P63, CXCR4, FOXA2, SOX17, NKX2.1, SOX2 et SOX9. Le passage par la production de cellules de l’endoderme définitif n’a pas permis d’améliorer l’efficacité de ce protocole. L’isolement de ces progéniteurs et la reconstitution d’un épithélium complet restent à mettre au point. / Human embryonic stem cells (hESCs), for to their characteristics of pluripotency and unlimited proliferation, represent an alternative to the use of primary cells from patients: their commitment and differentiation into airway epithelial cells could help to overcome the lack of patient’s cells and could allow the unlimited production of epithelium for the screening of therapeutic molecules.The objective of our work was to develop a simple and financially acceptable protocol to differentiate hESCs into airway epithelial cells and to produce a complete epithelium. To do this, we followed two potential routes of hESC differentiation: a route through the production of definitive endoderm, the germ layer at the origin of the respiratory epithelium, and a route through a common potential progenitor to the respiratory and epidermal lineages. Various combinations of matrix proteins, differentiation inducers, induction time and culture media were tested.Our results show that hESC culture on STO feeder cells in an optimized medium for human bronchial epithelial cells, the BEGM medium, in the presence of Bone Morphenetic Protein 4 and retinoic acid for 6 days then in BEGM medium alone for 30 supplementary days led to the differentiation of more than 76% of respiratory epithelial progenitors expressing specific markers such as CK13, P63, CXCR4, FOXA2, SOX17, NKX2.1, SOX2 and SOX9. The application of these culture conditions to definitive endoderm cells, previously obtained from hESC, failed to improve the effectiveness of this protocol. The isolation of these progenitors and the reconstruction of a complete airway epithelium remain to be developed.

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont des cellules pluripotentes, capables de s'auto-renouveller indéfiniment dans des conditions de culture appropriées. Cela signifie que ces cellules restent dans un état prolifératif et indifferencié en culture et ont le potentiel de se différencier dans les trois feuillets embryonnaires, à savoir l'ectoderme, le mésoderme et l’endoderme, et leurs dérivés. Cette capacité à se différencier dans tous les types cellulaires, souligne la diffculté à contrôler la différenciation des cellules ES in vitro et à les guider vers un lignage spécifique. Mon projet de thèse porte sur la différenciation des cellules ES murines. Une étape importante du développement embryonnaire est le choix entre l’ectoderme et le mésendoderme. Dans ce but, j'ai développé une lignée ES qui permet de suivre exclusivement l'expression de Brachyury (T) dans le mésendoderme à l'exclusion de la notochorde: la lignée TRepV. Pour cela, jai cloné un fragment de 1 kb du promoteur murin de Brachyuryen amont du rapporteur Venus (YFP). Avant d'utiliser cette lignée, j’ai cherché à la valider. Malheureusement l'expression du rapporteur TRepV ne reproduit pas fidèlement l'expression endogène de T. Une hypothèse est que le fragment de 1kb ne contient pas tous les éléments de régulation de T nécessaires pour expression fidèle in vitro. De manière surprenante, j’ai observé que le rapporteur TRepV est exprimé de façon hétérogène dans les cellules ES non différenciées. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à cette expression hétérogène. J'ai montré que les cellules ES TRepV+ représentent une sous-population distincte des cellules souches, qui peut être maintenue séparément exprimant le rapporteur de manère stable, à la difference d'autres gènes exprimés de manière hétérogène dans les cellules ES. Nous avons trouvé un marqueur d'une population distincte parmi les cellules ES et de nouveaux gènes impliqués dans pluripotence, qui seront abordés dans des études futures. / Embryonic stem cells (ESCs) are a powerful system to investigate developmental processes in vitro, and a promising tool to generate specific cell types for cellular therapies and regenerative medicine. ESCs are self-renewing, pluripotent cells, maintaining a proliferative and undifferentiated state in culture, while retaining the capacity to differentiate into the three embryonic lineages: ectoderm, mesoderm and endoderm, and all their derivatives. Here, I established a primitive streak specific Brachyury/T Reporter ESC line (TRepV) to investigate early ESC differentiation. In contrast to previously published Tknock-in line, we established a transgene T ESCs reporter line, in order to avoid the disruption of the T locus, which may result in a hapoinsuficient phenotype. During the validation process, I observed discrepancies in expression between the TRepV and the endogenous T locus. I followed upon these observations with a more detailed analysis and obtained evidence that T is regulated differently in the ESC system compared to in vivo development. Against expectations, I also observed heterogeneous expression of the TRepV reporter in undifferentiated ESCs. Undifferentiated ESCs were found to be a mix of TRepV+ and TRepV- cells. This finding became the focus of my studies: I found TRepV+ cells represent a distinct population of ESCs with a unique identity. Unlike other heterogeneous ESC populations (such as Stella or Nanog), TRepV+ cells do not interconvert in their fate and represent an explicit, stable subpopulation of ESCs. Finally, I performed a microarray analysis of TRepV+ and TRepV- ESCs and identifed new genes which may be involved in the regulation of self-renewal and pluripotency.

Les hépatocytes humains adultes en culture primaire (HHCP) ont de nombreuses applications en physiopathologie hépatique, en pharmacologie et en biothérapie, mais sont limitées par leur faible disponibilité. Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) sont une source prometteuse pour l'obtention d'hépatocytes en grande quantité. Nous avons développé un modèle in vitro de différenciation de hES en hépatocytes en reproduisant toutes les étapes de l'ontogenèse hépatique. Au cours de la différenciation, l'expression de 41 gènes marqueurs du foie a été étudiée et comparée aux HHCP, au foie fœtal et aux progéniteurs hépatiques issus du foie adulte. Les résultats démontrent qu'au bout de 21 jours de différenciation, les cellules souches embryonnaires différenciées en hépatocytes (hES-Hep) ont atteint un état de maturation équivalente aux hépatocytes fœtaux aux alentours de 20 semaines de gestation. L'expression forcée du xénorécepteur CAR dans les hES-Hep a induit l'expression des gènes de la détoxification et la biotransformation de midazolam, un substrat de CYP3A4. Ces résultats pourront contribuer au développement de cultures de hES-Hep comme alternative aux HHCP pour les études du métabolisme des xénobiotiques et pour la thérapie cellulaire. / Primary cultures of human adult hepatocytes (PCHH) have widespread potential applications in liver physiopathology , pharmacology, and cell-based therapies, but are currently limited by poor availability. Human embryonic stem cells (hES) are a promising source for the generation of hepatocytes in large quantities. In this study, we differentiated hES into hepatocytes by mimicking in vitro the various stages of hepatic ontogenesis. We analyzed the expression of a panel of 41 liver marker genes in hepatocyte-like cells derived from hES (hES-Hep) in comparison with PCHH, fetal liver and progenitors obtained from adult liver. The data revealed that after 21 days of differentiation ES-Hep are representative of fetal hepatocytes at around 20 weeks of gestation. The forced expression of the xenoreceptor CAR in hES-Hep induced the expression of detoxification genes as well as the biotransformation of midazolam, a substrate of CYP3A4. These results may contribute to the development of hES-Hep cultures as an alternative to PCHH for studies of xenobiotic metabolism and for cell-based therapies.

Le LIF (Leukemia Inhibitory factor), une cytokine de la famille de l’Interleukine 6, permet le maintien de la pluripotence des cellules souches embryonnaires murines (CSEm) in vitro. Dans le but de comprendre les mécanismes d’action du LIF dans ce modèle d’étude, une analyse sur puces à ADN a été réalisée et a permis d’identifier trois « signatures LIF » : les gènes « Pluri » (pour Pluripotence), dont le niveau d’expression relatif chute suite au retrait de cette cytokine, et deux catégories de gènes « Lifind » (pour LIF induit) dont le niveau d’expression relatif augmente suite à un ajout de LIF après une culture de 24 ou 48 heures sans cette cytokine. Nous avons mis au point des tests fonctionnels permettant d’étudier la fonction des gènes cibles du LIF dans notre modèle d’étude. Ainsi, nous avons mis en évidence le rôle d’un gène « Pluri », Mras/Rras3, une petite GTPase de la famille Ras, dans la régulation de l’expression d’une part de marqueurs de pluripotence, tels que Oct4 et Nanog et d’autre part de marqueurs de différenciation, tels que Lef1 et Fgf5. / LIF (Leukemia Inhibitory factor), a cytokine Interleukin 6 family, allows maintaining the pluripotency of murine embryonic stem cells (mESC) in vitro. To understand the mechanisms of action of the LIF in this model, a microarray analysis was conducted and identified three « signatures LIF » : the « Pluri » (for Pluripotency) genes, whose the relative level of expression falls following the withdrawal of this cytokine, and two classes of « Lifind » (for LIF induced) genes, whose the relative expression level increases as a result of LIF addition after a culture of 24 or 48 hours without this cytokine. We have developed functional tests to study the function of the target genes of LIF in our study model. Thus, we have investigated the role of a « Pluri » gene, Mras/Rras3, a small GTPase of the Ras family, in the regulation of the expression on the one hand of markers of pluripotency, such as Oct4 and Nanog, and on the other hand of differentiation markers, such as Lef1 and Fgf5.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC. / Stem cells have captured public’s attention in the last years, thanks to their involvement in cancer therapies and also their huge theoretical potential in the regenerative medicine field. In order to translate this new technology to the clinic, a better understanding of their regulatory mechanisms is still needed. It is well established that mouse embryonic stem cell (ESC) fate is highly regulated by core pluripotency factors. However, it is conceivable that novel self-renewal or differentiation regulators are not yet described. To investigate this possibility, we used a viral-based approach to generate a collection of ESC with nested chromosomal deletions called DelES (Deletion in ES cells). This library contains more than a thousand independent ESC clones highly enriched in chromosomal deletions which together cover ~25% of the mouse genome. Using this resource, we conducted an embryoid body (EB) differentiation screen and showed that several clones were having an abnormal EB formation phenotype. Complementation studies later identified Rps14-a ribosomal protein (RP) coding gene- as a novel haploinsufficient gene in EB formation from undifferentiated ESC. Further analyses of our screen results showed a strong bias for a subset of small subunit ribosomal protein genes which are critical for ESC differentiation but not for their self-renewal activity. Interestingly, the most severe differentiation phenotypes were found with ribosomal proteins associated to the ribosome’s mRNA exit site, namely Rps5, Rps14 and Rps28. While RP gene imbalance often leads to a p53 response that can be corrected by p53 suppression, ESC clones with decreased expression of mRNA exit site RP genes were surprisingly insensitive to p53 reduction, but were rescued by BAC or cDNA complementation, thus confirming the causative nature of these genes in the ESC phenotype. Finally, polysomal profiling and RNA-Seq studies showed that Rps5 deleted ESC exhibit an abnormal mesodermal gene signature. Together, our work presents a highly valuable resource for functional genomic studies in ESC and also highlights a novel p53-independent role linked to RP gene imbalance. Our results shed light on the relevance of these subunits for the developmental transition of ESC from a pluripotent to a differentiated state.

Les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) et maintenant de cellules souches induites à la pluripotence (hiPS) sont des cellules qui présentent deux caractéristiques uniques : elles sont d'une part capables de s'auto-renouveler de manière continue en culture ce qui permet de générer de grande quantité de cellules et d'autre part, elles présentent la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule de l'organisme lorsqu'elles sont soumises à un environnement permissif adéquat. Ces deux propriétés permettent d'envisager de nombreuses applications médicales comme la thérapie cellulaire mais aussi des applications dans le domaine de l'industrie pharmaceutique grâce au développement de modèles cellulaires innovants. Ce mémoire de thèse a pour objectif de présenter les caractéristiques biologiques principales de ces cellules et les enjeux médicaux et pharmaceutiques qu'elles représentent pour le futur, notamment pour le pharmacien.

Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l'utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d'une maladie monogénique, obtenues au cours d'un diagnostique pré-implantatoire. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l'utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d'obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j'ai ensuite comparé le profil d'expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J'ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d'utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J'ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l'observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J'ai également étudié l'expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d'Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l'équipe, permettent d'apporter la preuve de concept de l'intérêt d'un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques.

L’hypothyroïdie congénitale est un des troubles endocriniens les plus fréquents chez l’enfant, touchant un nouveau-né sur 2500.[1] Toutefois, même si quatre facteurs de transcription principaux, NKX2.1, PAX8, FOXE1 et HHEX, sont connus pour être impliqués et nécessaires au développement de la glande thyroïde, seuls 2% des patients atteints de dysgénésies thyroïdiennes sont reliés à une mutation au niveau d’un de ces quatre facteurs de transcription. Ceci suggère que d’autres facteurs, encore inconnus, pourraient jouer un rôle important durant l’organogenèse de la glande thyroïde.[1]Les mécanismes moléculaires contrôlant les différentes étapes du développement thyroïdien étant encore très peu connus, l’objectif de ce projet vise à décrypter le réseau génique contrôlant le développement thyroïdien. Pour se faire, la mise au point d’un protocole d’invalidation de gènes candidats impliqués dans le développement thyroïdien au sein de cellules souches embryonnaires murines à l’aide de la technologie des Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) a été mis au point. Ce nouveau protocole d’édition ciblée du génome de cellules souches embryonnaires permet la modélisation des différentes mutations identifiées au sein de patients atteints d’hypothyroïdisme congénital mais aussi la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le développement de la glande thyroïde lorsque ce protocole est couplé avec notre modèle in vitro de différenciation de cellules souches embryonnaires murines en cellules folliculaires thyroïdiennes. Grâce à l’utilisation combinée de ces deux protocoles, nous avons pu mettre en évidence la nécessité du gène Foxe1 pour la différenciation in vitro correcte des progéniteurs NKX2.1+ en cellules folliculaires thyroïdiennes. Toutefois, il a été démontré qu’une faible proportion de cellules sont toujours capables de générer des follicules thyroïdiens en l’absence du gène Foxe1. Enfin, la génération inattendue de structures pulmonaires tridimensionnelles parmi les cellules Foxe1 KO différenciées avec du 8-br-cAMP a été observée. Cette génération de structures pulmonaires ne semble pas être une conséquence directe de la diminution d’expression du gène Pax8 observée au sein de ces lignées Foxe1 KO mais pourrait refléter un potentiel rôle épigénétique du gène Foxe1 permettant ou non le recrutement de certaines protéines au sein de la chromatine. Le gène Foxe1 semble à la fois jouer un rôle de facteur « pioneer » et de « Gatekeeper » en orientant le destin cellulaire des progéniteurs NKX2.1+ vers une différenciation thyroïdienne à défaut d’une différenciation pulmonaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished