La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie héréditaire qui touche les garçons. Une des approches envisagées pour rétablir l'expression de dystrophine dans le muscle est la thérapie cellulaire. Celle-ci connaît des limitations majeures comme le fort taux de mortalité et le faible potentiel migratoire des cellules transplantées. Dans l'optique de limiter ces obstacles, nous nous sommes intéressés à l'interleukine 13. En effet, il a été prouvé que l'interleukine 13 sécrétée par les fibres musculaires induit l'activation, la différenciation des cellules satellites en myoblastes et leur fusion avec les fibres pour induire l'hypertrophie musculaire. Par ailleurs, les effets de l'interleukine 13 sur les muscles squelettiques sont très peu connus. Résultats : L'étude in vitro des effets du traitement des myoblastes humains avec l'interleukine 13 humaine montre une augmentation du taux de fusion et une amélioration du potentiel migratoire via une action chémo-attractante. De plus, l'interleukine 13 permet d'améliorer la prolifération et la survie des myoblastes suite à l'induction d'un stress oxydatif. Par ailleurs, Le prétraitement et la co-injection de l'interleukine 13 ne montrent pas une amélioration concluante dans le taux de survie post-greffe. Aussi, l'électroporation d'un plasmide contenant le gène de l'interleukine 13 humaine dans les muscles de souris RAG avant la greffe ne semble pas augmenter le potentiel migratoire des cellules transplantées. Conclusions : Les effets de l'interleukine 13 sur les myoblastes observés in vitro semblent très prometteurs. Cependant, ces effets ne sont pas observables in vivo. D est nécessaire d'optimiser les méthodes d'introduction du gène dans les muscles de souris et les méthodes d'investigation pour avoir des résultats plus concluants.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la dystrophie musculaire la plus fréquente et la plus sévère. Reliée au chromosome X, cette maladie affecte 1 garçon sur 3500 dans le monde. Elle est causée par l'absence de dystrophine dans les fibres musculaires, entraînant une dégradation progressive du muscle. La transplantation de myoblastes est l'un des traitements possibles puisqu'elle permet de restaurer l'expression de la dystrophine dans les muscles des patients DMD. De plus, il a été observé que les animaux déficients en myostatine ont une masse musculaire plus élevée et sont plus forts que leurs congénères de type sauvage. Par conséquent, la signalisation induite par la myostatine est une cible de choix pour le développement de thérapie visant à rétablir la force des sujets dystrophiques. Il existe différentes avenues pour bloquer la signalisation de la myostatine, dont une, qui consiste en l'expression d'un propeptide muté de la myostatine. Cette molécule ayant la capacité de séquestrer la myostatine endogène. La greffe de myoblastes normaux combinée à un blocage de la myostatin pourraient s'avérer une bonne combinaison pour traiter le mieux possible les patients. Dans le premier article, nous étudions l'impact de la dystrophine sur les propriétés contractiles du muscle et la résistance aux contractions excentriques de muscles greffés ou non avec des myoblastes. Dans le second article, nous étudions l'effet d'un propeptide muté de la myostatine sur le succès de greffe de myoblastes et sur la force des souris greffées. Les résultats montrent cependant que le propeptide muté de la myostatin nuit à la greffe de myoblastes et au final diminue la force des muscles traités.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie récessive causée par l'absence d'une protéine, la dystrophine. Notre laboratoire travaille sur un traitement potentiel qui consiste à remplacer la protéine manquante en transplantant des myoblastes normaux ou génétiquement modifiés dans le muscle du patient atteint. Par contre, cette technique comporte des limitations; la mort cellulaire précoce, la faible dispersion ainsi que le rejet immunitaire nuisent à son succès. Ce projet de maîtrise vise à améliorer la greffe de myoblastes grâce à l'utilisation de l'epigallocatechin-gallate (EGCG), une composante majeure du thé vert. Récemment, il a été rapporté que l'inhibition de RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mène à une augmentation de la prolifération et de la migration et à une diminution de la différenciation et de la mort par apoptose des myoblastes [3]. L'EGCG, reconnu pour ces propriétés anti-oxydantes, pourrait en plus d'aider à réduire le stress oxydatif et l'inflammation causés lors de la transplantation, permettre une amélioration de la survie des myoblastes transplantés puisqu'elle pourrait avoir un effet sur l'expression du récepteur RAGE [4]. Nous nous sommes donc intéressés à l'effet de l'EGCG sur RAGE dans le contexte de la greffe de myoblastes. Notre hypothèse est donc que l'EGCG pourrait inhiber transitoirement l'expression de RAGE et augmenter la prolifération et la migration et diminuer la fusion et la mort par apoptose des myoblastes transplantés pour ainsi améliorer le succès de greffe. Nous avons confirmé que l'EGCG pouvait diminuer le niveau d'expression de RAGE dans les myoblastes et dans les muscles de souris. Nous avons obtenu une augmentation de la survie des myoblastes lorsque confrontés à un stress tel que la glucose oxydase. Nous avons aussi remarqué une diminution de la fusion des myoblastes in vitro mais malheureusement, nous ne pouvons confirmer l'augmentation du succès de greffe. Un test de migration pourrait être effectué pour vérifier l'effet de l'EGCG sur la migration des myoblastes ainsi qu'une autre expérience pour confirmer le succès de greffe.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie causée par l’absence de dystrophine, qui se manifeste par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques et cardiaque. Les garçons atteints ont une espérance de vie d’environ 20 ans. Même si la prise de certains médicaments peut ralentir la progression de la maladie, il n’existe à ce jour aucune thérapie curative. La transplantation autologue de myoblastes génétiquement corrigés peut restaurer l’expression de la dystrophine, mais les myoblastes des patients DMD ont une capacité proliférative très limitée. Leur prolifération nécessite l'immortalisation avec un oncogène viral, un processus augmentant les risques associés à la transplantation de myoblastes. Les protéines fusionnées au domaine de transduction de Tat peuvent transduire les cellules en culture et plusieurs tissus in vivo. La transduction de protéines pourrait s’avérer utile dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Nos objectifs étaient de tester la capacité des protéines de fusion Tat à transduire les fibres musculaires, de mieux comprendre le mécanisme de transduction, d’optimiser le ciblage efficace des cellules en culture et de développer des outils permettant l’immortalisation transitoire des myoblastes avant leur transplantation. In vivo, nos travaux indiquent que les fibres musculaires résistent à l’internalisation des protéines de fusion Tat, qui se retrouvent en périphérie associées à la matrice extracellulaire. In vitro, la distribution intracellulaire ponctuée, la cinétique d’internalisation, la sensibilité aux basses températures et l’augmentation fonctionnelle exercée par les agents lysosomotropiques révèlent un mécanisme d’endocytose classique. Ces données suggèrent que les protéines de fusion Tat, entrent par la voie endosomale, évitent les lysosomes, et sont ensuite séquestrées en périphérie du noyau. Un trafic intracellulaire inadéquat serait le principal facteur limitant l’efficacité de l’internalisation fonctionnelle des cargos fusionnés au domaine de transduction de Tat. Cette meilleure compréhension du mécanisme d’internalisation des protéines de fusion Tat, nous permit de développer une méthode efficace pour immortaliser de façon réversible les myoblastes d'un patient DMD. En utilisant un protéine de fusion Tat-Cre, nous avons déimmortalisé des myoblastes DMD transformés par l'AgT flanqué de sites LoxP. Cette technique permet de proliférer extensivement les myoblastes DMD, tout en rendant plus sécuritaire la déimmortalisation. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by the absence of dystrophin and leads to progressive weakness in heart and skeletal muscles. Affected boys can only hope to live for 20 years since there is still no effective therapy for DMD. Autologous transplantation of genetically modified myoblasts can restore dystrophin expression, but the rapid death, the specific immune response and limited cellular migration severely limit the efficiency of the treatment. Immortalization, although a risky procedure, is necessary to proliferate myoblasts isolated from dystrophic patients, since by age five; their myogenic cells are practically senescent. Proteins and cargos fused to the Tat protein (HIV) can be internalized in cells and living tissue. The mechanism of Tat internalization is still misunderstood and controversial. Our objectives were to test the susceptibility of muscle fibers to be transduced by Tat fusion proteins, to better understand the mechanism of entry of Tat fusions, to optimize intracellular delivery and to develop techniques allowing the immortalization reversal of myoblasts using Tat-fusion proteins. The low susceptibility of muscle fibers to be transduced and the strong interaction between Tat-fusion proteins and the extracellular matrix surrounding muscle fibers resulted in poor protein delivery. Our work shows that the nuclear localization signal comprised in Tat is not sufficient to confer nuclear delivery to eGFP. The punctuate intracellular distribution, the internalization kinetics, the inhibitory effect of low temperatures and the functional increase exerted by lysosomotropic agents are coherent with a classical endocytosis internalisation mechanism. Our data suggests that Tat-fusion proteins proceed through the endosomal pathway, avoid lysosomes and are then sequestered in the periphery of the nucleus. Hence, improper intracellular trafficking is the main factor limiting the efficiency of Tat-mediated protein internalization. With a better understanding of this internalization mechanism, we were able to optimize the delivery of a Tat-Cre fusion protein to mediate the complete and efficient removal of an oncogene necessary for the proliferation of myoblasts isolated from DMD patients. Therefore this technique should help in the design of a successful treatment based on the autologous transplantation genetically-modified cells.

La transplantation de myoblastes (TM) est une des thérapies potentielles des plus prometteuses pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Une des limites de cette approche est le rejet des myoblastes du donneur par le système immunitaire de l’hôte. L’induction d’une tolérance immunologique envers les myoblastes greffés permettrait de contourner les effets secondaires conséquents à une immunosuppression soutenue, aujourd’hui indispensable à la survie de la greffe. Notre objectif est donc d'induire une tolérance immunologique via l’établissement d’un chimérisme mixte par un protocole non-myéloablatif, chez des souris dystrophiques. Le protocole testé a permis d'induire une tolérance périphérique transitoire au donneur ainsi que l'établissement de taux variables de chimérisme mixte. Cependant, il n’a pas permis d’induire une tolérance à la TM. Bien que nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés quant à la TM, des améliorations, telle qu’une association à court terme à la rapamycine, pourraient être envisagées en vue d'une application en clinique. / Myoblast transplantation (MT) is one of the most promising potential therapies for Duchenne muscular dystrophy (DMD). One limitation of this approach is the rejection of the donor myoblast by the host immune system. Induction of donor-specific immune tolerance would avoid the toxicities of chronic immunosuppressive therapy that is currently required to prevent graft rejection. Our objective is to induce immunological tolerance through the establishment of mixed-chimerism using a non-myeloablative protocol, into DMD mice. Our results show that the tested protocol permits the induction of transient peripheral tolerance status to the donor. It also allows the establishment of variable rate of mixed-chimerism. However, this protocol failed to induce tolerance to MT. Although we did not obtain the expected results on the MT, improvements, such as association with a short-term rapamycin treatment, may be considered to enhance the outcome of the proposed protocol in perspective of clinical application for DMD patients.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique caractérisée par l'absence de dystrophine dans les muscles des patients. Un des traitements envisageables est la greffe de myoblastes dans les muscles dystrophiques afin de permettre l'expression de dystrophine. Les cellules souches embryonnaires, qui ont la capacité de se différencier en tous les types de cellules, pourraient servir de source illimitée de cellules pour traiter les patients. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent premièrement qu'il est possible d'obtenir une population de myoblastes dérivées de cellules souches embryonnaires murines. Il est aussi démontré qu'un traitement à l'azacytidine augmente le pourcentage de cellules souches embryonnaires différenciées en cellules myogéniques. De plus, ces cellules différenciées permettent de régénérer la dystrophine lorsque greffées à des souris dystrophiques. Des essais de purification de ces cellules myogéniques ont été tentés et sont toujours en cours d'étude. Une bonne purification des cellules différenciées permettrait en effet d'éviter les risques de formation de tumeurs lors de la greffe des cellules. Les expériences de différenciation, lorsque mises au point, pourraient être appliquées à des cellules souches embryonnaires humaines afin de traiter des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne.