Dans la première partie de cette thèse effectuée en collaboration avec le groupe expérimental de C. Chazaud (Clermont Université), nous avons étudié théoriquement un processus de différenciation cellulaire intervenant avant l’implantation de l’embryon dans l’utérus. Il s’agit de la spécification des cellules de la masse cellulaire interne (MCI) en épiblaste (EPI) et en endoderme primitif (EPr), processus dans lequel les facteurs de transcription Nanog et Gata6 jouent un rôle essentiel. En effet, en absence de Nanog, les cellules de la MCI acquièrent toutes une identité EPr, tandis qu’en absence de Gata6, elles se différencient toutes en EPI. De plus, la voie de signalisation Fgf/Erk active l’expression de Gata6 et inhibe celle de Nanog. Enfin, Nanog active la sécrétion dans le milieu extracellulaire de Fgf4, une molécule qui active la voie de signalisation Fgf/Erk en se liant au FgfR2. Nous avons développé un modèle mathématique pour ce réseau de régulations, fondé sur des équations différentielles ordinaires décrivant l’évolution temporelle des niveaux de protéines Nanog, Gata6, Fgf4 et Fgfr2 et de l’activité de la voie Fgf-Erk. Nous avons validé ce modèle en montrant qu’il récapitule les résultats expérimentaux obtenus in vivo, dans les embryons wild-type et dans les mutants Nanog-/- et Gata6-/-. De plus, l’analyse des résultats du modèle permet de proposer un nouveau mécanisme pour l’émergence d’une population mixte de cellules EPI et EPr au sein de la MCI. Ce mécanisme repose sur le fait que le système décrit par notre modèle peut présenter trois états stationnaires stables, dont les niveaux d’expression de Nanog et Gata6 correspondent à l’EPI, l’EPr et la MCI non-différenciée, respectivement. De plus, le modèle a été utilisé afin d’interpréter des résultats expérimentaux récents et contre-intuitifs, concernant les embryons hétérozygotes Gata6+/-. Enfin, nous avons établi des prédictions théoriques, dont certaines ont été ultérieurement vérifiées en laboratoire. <p>Dans la seconde partie de la thèse, effectuée dans le laboratoire d’O. Pourquié (Université de Strasbourg), nous avons étudié un processus de différenciation in vitro, par une approche expérimentale. Il s’agit de la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES) en cellules de mésoderme paraxial, un tissu dont dérivent –au cours du développement embryonnaire– les cellules formant notamment les vertèbres, les côtes, la peau et les muscles squelettiques du dos.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez la souris, le Leukemia Inhibitory Factor (LIF) joue un rôle clé dans le maintien des cellules souches embryonnaires (ES) à l’état pluripotent. Le LIF agit en activant le facteur de transcription STAT3 via les kinases Jak. Cette activation est nécessaire et suffisante au maintien des cellules ES en autorenouvellement en présence de sérum. Une étude du transcriptome de STAT3 réalisée au laboratoire a permis d’identifier plusieurs gènes cibles de ce facteur, parmi lesquels plusieurs gènes inconnus. L’un d’eux, le gène 1456160_at, est fortement exprimé dans les cellules ES de souris et son expression diminue après induction de la différenciation. Ce gène a été appelé Asgard pour Another Self-renewal GuARDian. La caractérisation et le séquençage de ce gène ont permis de mettre en évidence qu'Asgard code pour un microARN. De nombreux microARNs jouent un rôle clé dans le maintien de l'autorenouvellement des cellules ES et dans le contrôle de la différenciation. Des expériences d’inhibition et de surexpression ont permis de montrer que Asgard est impliqué dans la régulation de la différenciation endoderme versus mésoderme. Des analyses préliminaires ont permis d’identifier Pbx3, FoxA2 et Sox17 comme cibles potentielles. Bien que les mécanismes d’action du microARN Asgard restent à confirmer, ce travail a permis d’identifier un nouveau gène clé de l'autorenouvellement des cellules ES de souris / The Leukemia Inhibitory Factor (LIF) activates the transcription factor STAT3, which results in the maintenance of mouse embryonic stem cells in the undifferentiated state by inhibiting mesodermal and endodermal differentiation. We identified several target genes of STAT3 by transcriptomic analysis. Among them, we focused on an unknown gene referred as 1456160_at on Affymetrix array. This gene is highly expressed in embryonic stem cells and its expression level decreases during differentiation. We named this gene Asgard for Another Self-renewal GuARDian. Its characterization and sequencing revealed that Asgard encodes for a microRNA sequence. Several microRNAs have been shown to play key role in the maintenance of self-renewal of mouse ES cells and in the control of differentiation. Inhibition and overexpression assays showed that Asgard inhibits endodermal differentiation in order to maintain self-renewal. Through preliminary analysis, we identified Pbx3, FoxA2 and Sox17 as potential targets of the microRNA Asgard. Our work enables us to identify a new key gene of self-renewal of mouse ES cells

De l’organisme unicellulaire aux organismes multicellulaires complexes, la spécification cellulaires est un aspect fondamental de la biologie de l'adaptation et du développement. Les cellules souches pluripotentes (CSP) telles que les embryonnaires (CSE) fournissent un modèle approprié pour étudier les mécanismes de régulation et la spécification du sort des cellules chez les mammifères. Les ESC de souris sont connus pour être de nature hétérogènes et sont rapportées comme étant composées de multiples états de cellules souches ressemblant à des stades distincts du développement embryonnaire précoce, tels que totipotentes, pluripotentes, préparées et endoderme primitif. Malgré des études approfondies sur les CSE, les mécanismes moléculaires régulant leur hétérogénéité et l'état totipotent, en particulier, ne sont pas bien compris. Le travail présenté dans cette thèse utilise les CSE de souris comme modèle intéressant pour déterminer les mécanismes de signalisation et de régulation génique qui conduisent à l'hétérogénéité cellulaire et l'état cellulaire totipotent des CSE. Dans une première étude, nous avons utilisé la cytométrie en flux de masse pour analyser simultanément de multiples protéines régulatrices des cellules souches, en mettant l'accent sur les facteurs de transcription clés, les protéines de signalisation et les modificateurs de la chromatine qui régissent les CSE de souris. Les données de cytométrie en flux de masse ont révélé des variations dans les niveaux protéiques cellulaires individuels des régulateurs des cellules souches et ont souligné la vaste coactivation des voies de signalisation cellulaire dans des conditions de culture définies des CSE. De plus, l'application de la cytométrie en flux de masse a facilité l'identification d'états cellulaires distincts et de leurs caractéristiques moléculaires au sein des CSE, offrant des aperçus de leurs variations selon différentes conditions de culture, validant ainsi la présence d'hétérogénéité cellulaire dans les CSE de souris. Dans une deuxième étude, nous avons identifié la signalisation du facteur de croissance des os (BMP) comme inducteur de l'état totipotent. Nous avons également constaté que le rôle du BMP dans la totipotence est réprimé par la coactivation des voies FGF, NODAL et WNT. En inhibant ces voies coactivées, nous démontrons l'amélioration de l'induction de cellules totipotentes et la suppression des états préparés et d'endoderme primitif. Nous avons validé les changements d'état cellulaire au niveau cellulaire unique grâce à un séquençage d'ARNm à cellule unique. De plus, nous avons également démontré que les cellules totipotentes reprogrammées in vitro imitent les cellules totipotentes de l'embryon préimplantatoire avec la capacité de générer des blastocystes in vitro (Blastoïdes) et de s'intégrer dans les lignées embryonnaires et extra-embryonnaires chez la souris. Ensemble, ces résultats ont révélé les mécanismes de signalisation du BMP pour réguler à la fois l'état totipotent et l'hétérogénéité des CSE. Pour la troisième étude, nous avons utilisé les observations clés de nos données de cytométrie en flux de masse (première étude) pour évaluer le rôle des protéines régulatrices clés pour promouvoir l'état cellulaire totipotent. Ici, nous démontrons que NACC1, un régulateur transcriptionnel des CSE, agit également comme un régulateur important des cellules totipotentes. Après avoir identifié NACC1 comme un régulateur potentiel à partir de données de protéines cellulaires à cellule unique et de transcriptome en vrac, nous avons validé sa fonction en utilisant une suppression médiée par CRISPR en combinaison avec des conditions de reprogrammation cellulaire pluripotente à totipotente. Ensuite, nous avons intégré une combinaison d'approches génomiques pour étudier les changements au niveau du système dépendants de NACC1 dans le transcriptome, l'accessibilité à la chromatine et la liaison à l'ADN génomique. Ensemble, ces données ont révélé que NACC1 induit à la fois les programmes d'expression génique codant et de gènes de rétrotransposons pour promouvoir l'état cellulaire totipotent. Enfin, nous avons montré que NACC1 régule les éléments rétrotransposables MERVL-int et MT2_Mm pour moduler l'expression des gènes codants de l'état totipotent. En conclusion, cette thèse révèle la nature hétérogène des CSE de souris au niveau protéique à cellule unique, élucide le rôle significatif et les mécanismes de la voie de signalisation BMP pour réguler l'état totipotent et l'hétérogénéité des CSE, et dévoile les mécanismes de régulation génique dépendants de NACC1 pour promouvoir l'état totipotent. Ces résultats ouvrent la voie à des études ultérieures visant à comprendre la spécification de l'état des cellules souches et leur transition via la modulation des voies de signalisation / facteurs de transcription. De plus, ces mécanismes peuvent réguler l'état cellulaire totipotent chez l'homme, éclairant l'hétérogénéité cellulaire dans les CSE humaines et dans des contextes pathologiques, tels que le cancer. / From unicellular entities to intricate multicellular organisms, the omnipresent process of cell fate specification is a fundamental aspect of adaptation and developmental biology. Pluripotent stem cells (PSCs) such as embryonic stem cells (ESCs) provide a suitable model to study the regulatory mechanisms and cell fate specification in mammals. Intriguingly, mouse ESCs are known to be heterogenous in nature and are reported to consist of multiple stem cell states resembling distinct stages of early embryogenesis, such as totipotent, pluripotent, primed, and primitive endoderm. Despite extensive study of ESCs, the molecular mechanisms regulating their heterogeneity and the totipotent state in particular are not well understood. The work presented in this thesis utilizes mouse ESCs as an attractive model to delineate the signaling and gene regulatory mechanisms driving the cellular heterogeneity and the totipotent cell state of ESCs. In the first study, we utilized mass cytometry (cytometry by time of flight) to concurrently analyse multiple stem cell regulatory proteins, focusing on key transcription factors, signaling proteins, and chromatin modifiers that govern mouse ESCs. Mass cytometry data revealed variations in the single-cell protein levels of stem cell regulators and highlighted the extensive cross-activation of cell signaling pathways across defined culture conditions of ESCs. Furthermore, the application of mass cytometry facilitated the identification of distinct cell states and their molecular features within ESCs, offering insights into their variations across different culture conditions, thereby validating the presence of cellular heterogeneity in mouse ESCs. In the second study, we identified bone morphogenetic protein (BMP) signaling as an inducer of the totipotent state. We also found that, BMP’s role for totipotency is repressed by the cross-activation of FGF, NODAL, and WNT pathways. Through rational inhibition of these cross-activated pathways, we demonstrate the enhancement in the induction of totipotent cells and suppression of primed and primitive endoderm states. We validated the cell state changes at the single-cell level through single-cell mRNA sequencing. Furthermore, we also demonstrate that the in-vitro reprogrammed totipotent cells mimic the totipotent cells of preimplantation embryo with the potency to generate in-vitro blastocyst (Blastoids) and to integrate into both embryonic and extra-embryonic lineages in the mice. Together these results revealed BMP signaling mechanisms to regulate both the totipotent state and the heterogeneity of ESCs. For our third study, we utilized the key observations from our mass cytometry data (first study) to evaluate the role of key regulatory proteins to promote the totipotent cell state. Here, we demonstrate that NACC1, a transcriptional regulator of ESCs, also acts as an important regulator of totipotent cells. Following identification of NACC1 as a potential regulator from both single-cell protein and bulk transcriptome data, we validated its function using CRISPR-mediated knock-out in combination with pluripotent-to-totipotent cell reprogramming conditions. Next, we integrated a combination of genomic approaches to study the NACC1 dependent system’s level changes in the transcriptome, chromatin accessibility and genomic DNA binding. Together, these data revealed that NACC1 induces both the coding gene and retrotransposon gene expression programs to promote the totipotent cell state. Finally, we showed that NACC1 regulates MERVL-int and MT2_Mm retrotransposable elements to modulate the expression of coding genes of the totipotent state. In conclusion, this thesis reveals the heterogeneous nature of mouse ESCs at the single-cell protein level, elucidates the significant role and mechanisms of BMP signaling pathway to regulate the totipotent state and ESC heterogeneity, and unveils NACC1 dependent gene regulatory mechanisms to promote the totipotent state. These findings open the door for subsequent studies aimed at understanding stem cell state specification and their transition occurring via modulation of signaling pathways / transcription factors. Moreover, these mechanisms may regulate the totipotent cell state in humans, shedding light on the cellular heterogeneity in human ESCs and in disease contexts, such as cancer.

La thérapie cellulaire pourrait représenter une alternative à la transplantation hépatique dans certaines pathologies comme les maladies métaboliques sévères. Toutefois, la pénurie de donneurs d’organes implique la nécessité de trouver de nouvelles sources de cellules hépatiques comme les cellules souches pluripotentes qui peuvent être amplifiées extensivement et différenciées en tout type cellulaire. Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) générées à partir des cellules somatiques de patients puis différenciées en hépatocytes représentent une source potentielle d’hépatocytes. Ces cellules permettent en outre d’envisager la transplantation d’hépatocytes autologues génétiquement modifiés comme alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies génétiques du foie. L’hypercholestérolémie familiale (HF) est une maladie autosomale dominante due à des mutations dans le gène codant le Récepteur aux Low Density Lipoproteins (RLDL) qui est à l’origine d’un taux élevé de cholestérol sanguin de patients HF. Les patients homozygotes doivent épurer leur sérum par LDL-aphérèse en moyenne deux fois par mois dès le plus jeune âge pour éviter les infarctus mortels survenant dès l’enfance. Les hépatocytes différenciées à partir des iPSC de patients et leur correction in vitro, permettent d'évaluer la faisabilité de la transplantation d'hépatocytes autologues génétiquement modifiés pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale.Au cours du développement du foie, des hépatocytes et des cholangiocytes, les deux types de cellules épithéliales hépatiques, dérivent de progéniteurs hépatiques bipotents (les hépatoblastes). Bien que les cholangiocytes formant les canaux biliaires intrahépatiques ne représentent qu'une petite fraction de la population cellulaire totale du foie (3%), ces cellules régulent activement la composition de la bile par réabsorption des acides biliaires, un processus qui est important dans des maladies choléstatiques du foie. Dans la première partie de cette étude nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches pluripotentes (hESC et hiPSC) en cholangiocytes fonctionnels. Ces cellules serviront à la modélisation des maladies génétiques touchant les cholangiocytes formant des canaux biliaires. Dans la deuxième partie, nous avons généré des iPSC spécifiques de patients HF (HF-iPSC), différenciées en hépatocytes et corrigé le défaut phénotypique par transfert lentiviral de l’ADNc codant le LDLR dans les HF-iPSC. / Cell therapy can be an alternative to liver transplantation in some cases such as severe metabolic diseases. However, the shortage of organ donors implies the need to find new sources of liver cells such as hepatocytes derived from pluripotent stem cells that can be amplified and differentiated extensively into any cell type. Human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) generated from somatic cells of patients and then differentiated into hepatocytes represent a potential source of transplantable hepatocytes. These cells now make it possible to consider the transplantation of genetically modified autologous hepatocytes as an alternative to liver transplantation for the treatment of genetic diseases of the liver.Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder caused by mutations in the gene encoding the receptor for Low Density Lipoproteins (LDLR), which is the cause of high blood cholesterol in these patients. Homozygous patients should purify their serum LDL-apheresis on average twice a month starting at a young age to avoid fatal myocardial infarction occurring in childhood.Human hepatocytes differentiated from patient’s induced pluripotent stem cells (iPSCs) allow assessing the feasibility to transplant genetically modified autologous hepatocytes as treatment of familial hypercholesterolemia.During the liver development, hepatocytes and cholangiocytes, the two types of hepatic epithelial cells, derive from bipotent hepatic progenitors (hepatoblasts). Although cholangiocytes, forming intrahepatic bile ducts, represent a small fraction of the total liver cell population (3%), they actively regulate bile composition by secretion and reabsorption of bile acids, a process that is important in cholestatic liver diseases. In the first part of this study we developed an approach to differentiate pluripotent stem cells (hESC and hiPSC) into functional cholangiocytes. These cells could be used for the modeling of genetic biliary diseases. In the second part, we generated FH patient specific iPSCs (HF-iPSC), differentiated them into hepatocytes and tried to correct the disease phenotype by lentiviral introduction of LDLR cDNA cassette in HF-iPSC.

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont pluripotentes et ont donc le potentiel de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, ainsi qu’en cellules de la lignée germinale. Ces propriétés en font un modèle pour l’étude des mécanismes de prolifération et de différenciation. Le facteur de transcription Lmx1b est impliqué dans la maintenance du phénotype différencié des neurones dopaminergiques mésencéphaliques. Et il a aussi été montré comme un facteur clef dans la différenciation et la maintenance des neurones sérotoninergiques du rhombencéphale générés dans les noyaux du Raphé. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux capacités de Lmx1b d’influencer la différenciation des cellules ES de souris en neurones sérotoninergiques. La première stratégie adoptée a résulté en une expression ectopique stable de Lmx1b dans les cellules ES et leurs dérivés. Le niveau d’expression de Lmx1b a fortement influencé les capacités de différenciation neuronale des cellules. Puis, l’analyse de marqueurs de différenciation spécifiques a montré une augmentation de l’expression des marqueurs sérotoninergiques, au contraire des marqueurs dopaminergiques ou de neurones moteur. La seconde stratégie a consisté en une surexpression inductible de Lmx1b dans les précurseurs neuraux dérivés de cellules ES pour mimer l’expression physiologique de Lmx1b. Après induction, Lmx1b était bien exprimé dans les cellules durant toutes les étapes de différenciation neuronale. L’activation de l’expression de Lmx1b au stade des colonies neuroépithéliales a aussi résulté en une amélioration de la différenciation sérotoninergique. Les résultats de ce travail soulignent les capacités de Lmx1b à diriger la différenciation des précurseurs neuraux dérivés de cellules ES vers la voie sérotoninergique in vitro. / Pluripotent Embryonic Stem Cells (ESC) have the potential to develop into cells of the three germ layers and of the germ line. Therefore, they are used as a model to study the proliferation and differentiation mechanisms. The LIM homeodomain transcription factor Lmx1b is involved in the maintenance of the differentiated phenotype of midbrain dopaminergic neurons. And it has been also demonstrated to be a key factor in differentiation and maintenance of hindbrain serotonergic neurons generated in the Raphe Nuclei. Here, we explored the capacity of Lmx1b to direct differentiation of mouse ESC (mESC) into serotonergic neurons. In the first approach, stable ectopic expression of Lmx1b was achieved. First, the level of Lmx1b expression was found to strongly influence the capacity of mESC to accomplish neuronal differentiation. Then, analysis of lineage-specific differentiation markers showed an increase in serotonergic markers’ expression by contrast to dopaminergic or motor neurons markers. In the second approach, Lmx1b was over-expressed in mESC-derived neural precursors by an inducible system in order to mimic the physiological onset of Lmx1b expression. After induction, Lmx1b was found to be stably expressed throughout neuronal differentiation. Activation of Lmx1b expression in neuroepithelial colonies resulted in enhancement of serotonergic differentiation, consistently with the stable system results. The results of this work highlight the capacity of Lmx1b to promote the shift of mESC-derived neural precursors toward a serotonergic fate in vitro.