Les myosites sont des maladies auto-immunes, caractérisées par des atteintes musculaires et extra musculaires. Le diagnostic des myosites peut être difficile et nécessite de l’expertise, afin d’éviter l’administration de thérapie inapproprié. Les mécanismes impliqués au cours des myosites sont peu connus. Notre but était de décrire le profil immunitaire des patients, afin d’identifier des biomarqueurs. Nous avons utilisé un panel de 36 marqueurs pour caractériser les PBMC issus de patients actifs (MIs, SAS anti-Jo1, myopathies anti-SRP et anti-HMGCR) et de sujets sains par cytométrie de masse combiné au « barcoding ». Tout d’abord, nous avons mis au point une procédure technique pour la détection simultanée de cibles extracellulaires et intracellulaires. En utilisant différents outils bio-informatiques, nous avons isolé une fréquence de lymphocytes CD8+T-bet+ > 51.5% comme étant un biomarqueur spécifique de la MIs en comparaison aux autres myosites, avec une sensibilité de 94,74% et une spécificité de 88,46%. De plus, nous avons identifié un profil immunitaire CD8+T-bet+ CD57- activé, potentiellement capable de prolifération et de maintien de mécanismes auto-immuns chez les patients atteints de MIs. Chez les patients anti-Jo1, nous avons observé une dérégulation de l’homéostasie des lymphocytes B, caractérisée par une diminution des lymphocytes B mémoires circulants. La présence de ces derniers dans le muscle des patients suggère qu’ils se nichent dans le muscle afin d’éviter l’action des immunosuppresseurs. Ces travaux ont permis l’identification de biomarqueurs et de phénotypes cellulaires potentiellement impliqués au cours de la MIs et du SAS anti-Jo1. / Myositis is an autoimmune disease characterized by muscular and extra-muscular disorders. In the early stages of the disease, the diagnosis of myositis can be misleading and requires expertise, in order to avoid the administration of inappropriate treatment. The mechanisms involved in these diseases are poorly understood. Our aim was to describe the immune profile specific to each patient group, in order to identify biomarkers that may be useful for diagnosis and management of patients. We used a panel of 36 markers by mass cytometry to characterize PBMCs derived from active patients (sIBM, anti-Jo1 ASyS, anti-SRP and anti-HMGCR myopathies) and healthy subjects. First, we developed and optimized a technical procedure for the simultaneous detection of extracellular and intracellular targets by mass cytometry. Using different bioinformatics tools, we isolated a frequency of CD8 +T-bet + cells > 51.5% as a specific biomarker for sIBM compared to other myositis, with a sensitivity of 94.74% and a specificity of 88. , 46%. In addition, we identified an activated CD8 + T-bet + CD57- immune profile, potentially capable of proliferation and the maintenance of autoimmune mechanisms in patients with sIBM. In anti-Jo1 patients, we observed a dysregulation of B cell homeostasis, characterized by a decrease in circulating memory B cells. The presence of the latter in the muscle of patients suggests that they nest in the muscle to avoid immunosuppressants. This work allowed the identification of a biomarker that could enhance the diagnosis of MIs compared to other myositis and the identification of cells potentially involved during sIBM and anti-Jo1 ASyS.

La cytométrie de masse CMM) a révolutionné l'étude de la diversité cellulaire et phénotypique, en augmentant de manière significative le nombre de marqueurs pouvant être analysés simultanément (41 à ce jour). En permettant de définir précisément l'état des populations de lymphocytes, notamment en ce qui concerne leur différenciation, activation et leur entrée dans le cycle cellulaire, la CMM a mis au jour de petits sous-ensembles jusqu'ici inconnus. Dans cette étude, la CMM a été utilisée pour tenter de mieux caractériser les réservoirs du VIH. Avec l'introduction de la thérapie antirétrovirale combinée (ART) en 1996, l'infection par le VIH est passée d'un destin fatal à une maladie chronique gérable avec une durée de vie normale grâce à une réduction de la réplication virale active (la quantité de virus est en deçà des limites de détection optimales). Cependant, si le traitement est interrompu, la charge virale chez le patient augmente à nouveau du fait des réservoirs de provirus viables localisés dans des populations de cellules à longue durée de vie et qui ne peuvent pas être éliminées par les traitements actuels. Ces cellules infectées réservoirs constituent un obstacle majeur à l'éradication du VIH. Le réservoir le mieux caractérisé est celui des lymphocytes T CD4+ et est principalement hébergé dans les TCM, les TTM, les TSCM et les Tfh. Une première étude nous a permis d’évaluer les stades du cycle cellulaire en association à des marqueurs de différenciation, d'activation et d'épuisement, pour aboutir à une évaluation poussée de l'état de quiescence des lymphocytes T CD4 susceptibles d’abriter les réservoirs latents de VIH. Cette large analyse multiplexe démontre que certains sous-ensembles des LTCD4+CD25-HLA-DR- classiquement considérés "au repos"- contiennent en fait des quantités notables de cellules en cycle ou exprimant des récepteurs inhibiteurs, ouvrant de nouvelles voies pour une redéfinition des cellules T CD4 quiescentes du sang périphérique. Une deuxième étude avait pour but de définir les populations de LT CD4 produisant du VIH in vivo. Nous avons développé une analyse multiparamétrique sur des cellules de patients VIH+ sous ART et en phase d’interruption thérapeutique (ATI). Cette étude met en évidence que les cellules CD3+CD4+CD32high expriment un fort taux de marqueurs d’activation et reçoivent d’importants signaux d’activation via des cytokines, à l'inverse des cellules CD32a-. D'autre part, l'analyse des LTCD4+ producteurs de VIH (exprimant la protéine de capside p24), nous a permis de détecter un très faible nombre de cellules positives p24+ (inférieur à 0,004% en phase d’ATI mais aucun avant). Le phénotype des cellules productrices a ensuite été mis en évidence. Il s’agit de lymphocytes T n’exprimant pas de CD8, enrichis d’un facteur 4 en cellules TSCM, et d'un facteur 2 en TFH. Ces populations sont très enrichies en cellules activées co-exprimant 3 marqueurs d’activation (augmentés d’un facteur 20) et sont en cycle (Ki67+) et/ou sur-expriment des molécules de contrôle immunitaire (ICP) avec un enrichissement d’un facteur 500. Ceci nous permet de détecter des cellules productrices avec des fréquences beaucoup plus élevées dans ces populations TCD3+CD8- en cycle à hauteur de 0,08%, et en phase G2 (2,46%), mais également dans les cellules présentant une poly-expression des 4 immune-checkpoints (2,27%). L’avènement de la cytométrie de masse a augmenté de façon exponentielle les informations que nous pouvions obtenir sur une cellule. Grâce à cet outil, l’identification du cycle cellulaire, en corrélation avec différents marqueurs phénotypiques, permet d’explorer des informations jusque-là inaccessibles, entre autre l’analyse des réservoirs latents et productif du VIH. Ce travail permet ainsi de caractériser le plus précisément possible ces cellules productrices de VIH, mais aussi les cellules latentes, et potentiellement réservoirs du virus. / Mass cytometry (CMM) has revolutionized the study of cell and phenotypic diversity, significantly increasing the number of markers that can be analyzed simultaneously (41 to date). By making it possible to precisely define the state of the lymphocyte populations, particularly regarding their differentiation, activation and entry into the cell cycle, the CMM has revealed small subsets so far unknown. In this study, the CMM was used to try to better characterize the HIV’s reservoirs. With the introduction in 1996 of Combined Antiretroviral Therapy (ART), HIV infection has shifted from a fatal destiny to a manageable chronic disease with a normal life span through a reduction in active viral replication (the amount of virus is below optimal detection limits). However, if treatment is interrupted, the viral load increases again in the patient due to viable provirus reservoirs located in long-lived cell populations that cannot be eliminated by current treatments. These reservoirs constitute a major obstacle to the eradication of HIV. The best characterized reservoir is that of CD4+ T cells and is mainly hosted in TCM, TTM, TSCM and Tfh. A first study allowed us to evaluate the stages of the cell cycle in association with markers of differentiation, activation and exhaustion, leading to a thorough assessment of the quiescent state of CD4 T cells likely to harbour latent reservoirs of HIV. This broad multiplex analysis demonstrates that some subsets of LTCD4+CD25-HLA-DR- classically considered "at rest" – do actually contain significant amounts of cells in cycling or expressing inhibitory receptors, opening new pathways for redefining CD4 T quiescent cells from peripheral blood. A second study aimed to define CD4+ T Cells populations producing HIV in vivo. We have developed a multiparametric analysis on cells of HIV+ patients under ART and in therapeutic interruption phase (ATI). This study shows that CD3+CD4+CD32high cells express a high level of activation markers and receive important activation signals via cytokines, unlike CD32a- cells. On the other hand, the analysis of HIV-producing LTCD4+ (expressing the p24 capsid protein), allowed us to detect a very small number of p24+ positive cells (less than 0.004% in ATI phase but none before). The phenotype of the producing cells was then highlighted. These are T lymphocytes that do not express CD8, enriched with a factor 4 in TSCM cells, and a factor 2 in TFH. These populations are highly enriched in activated cells co-expressing 3 activation markers (increased by a factor of 20) and are in cycle (Ki67+) and/or over-express immune control molecules (ICPs) with an enrichment of a factor of 500. This allows us to detect producing cells with much higher frequencies in these TCD3+CD8- populations in cycles up to 0.08%, and in G2 phase (2.46%), but also in cells with poly-expression of 4 immune-checkpoints (2.27%). The advent of mass cytometry has exponentially increased the information we could get on a cell. Thanks to this tool, cell cycle identification, in correlation with different phenotypic markers, makes possible the exploration of previously inaccessible information, including the analysis of latent and productive reservoirs of HIV. This work enables us to characterize as precisely as possible these HIV-producing cells, but also the latent cells, and potentially reservoirs of the virus.

Le sepsis est un problème mondial de santé publique du fait de son incidence croissante et de sa mortalité importante. Après une première phase très inflammatoire, les patients septiques présentent une profonde immunodépression, objectivée par un risque accru d’infections secondaires et de décès. Dans ce contexte, des thérapeutiques immunostimulantes sont actuellement testées. Afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes et des biomarqueurs permettant l’individualisation des traitements, la description exhaustive des mécanismes immunosuppresseurs mis en jeu est primordiale. Les lymphocytes B ont été peu étudiés au cours du sepsis. Des données récentes ont révélé l’existence de cellules B régulatrices dans différents contextes cliniques. Ainsi, nous avons fait l’hypothèse que des lymphocytes B / plasmocytes régulateurs pouvaient être impliqués dans l’établissement de l’immunodépression induite par le sepsis.Chez les patients en choc septique, nous avons montré que les lymphocytes B présentent une perte de leur fonction de prolifération et un phénotype d’épuisement cellulaire. Ils produisent de l’IL-10, cytokine suppressive (Journal of Immunology 2018). Enfin, une plasmocytose circulante apparait, confirmée par cytométrie de masse (Scientific Reports 2018). Dans un modèle murin de sepsis, ces plasmocytes inhibent la prolifération des lymphocytes T ex vivo et expriment des marqueurs phénotypiques suggérant pour la première fois la présence de plasmocytes régulateurs dans le sepsis.L’importance clinique des plasmocytes régulateurs reste à définir (mécanismes régulateurs, liens avec les paramètres cliniques, association avec les réactivations virales…). Elle pourrait conduire à l’établissement de nouveaux biomarqueurs pour le suivi immunitaire des patients et à de nouvelles approches thérapeutiques / Sepsis in a major health problem associated with rising incidence and high mortality rate. In septic patients, an initial proinflammatory response causing life-threatening organ failures is followed by the development of a deep immunosuppression, associated with increased risk of secondary infections and death. In this context, immunostimulating therapies are currently tested. However, success of this strategy requires identification of relevant therapeutical targets and biomarkers allowing individualisation of treatments. B lymphocytes have been poorly studied in sepsis. Moreover, existence of regulatory B cells was recently revealed in several clinical contexts. Thus, we made the assumption that regulatory B lymphocytes or plasma cells could be implied in sepsis-induced immunosuppression establishment.In septic shock patients, we showed that B cells present with decreased proliferation capacity and exhausted-like profile, and are able to produce immunosuppressive IL-10 (Journal of Immunology 2018). We also observed blood plasmacytosis in patients, confirmed by mass cytometry analysis (Scientific Reports 2018). In a murine model of sepsis, the ability of plasma cells to inhibit T cell proliferation ex vivo, and their phenotypic profile suggest for the first time the existence of regulatory plasma cells in sepsis.The role of regulatory plasma cells within sepsis-induced immunosuppression has to be further explored in patients (underlying regulatory mechanisms, associations with clinical outcomes and viral reactivations…). It could highlight novel biomarkers for patients’ monitoring and innovative therapeutical approaches

La vaccination est l'un des plus grands progrès réalisés en santé publique. Toutefois, malgré de nombreuses connaissances sur le système immunitaire, de nombreux pans d’ombre empêchent la conception de vaccins contre des pathogènes complexes. Pour pallier ce problème, une meilleure compréhension des modes d'action des vaccins est requise. En particulier, la plupart des vaccins nécessitent plusieurs immunisations pour induire une mémoire immunitaire adaptative au long terme, mais l'impact du délai entre primo-vaccination, induisant une mémoire primaire, et rappel(s) la restimulant pour générer une mémoire secondaire, est peu défini. De plus, la réponse immunitaire innée, induite à chaque immunisation et façonnant l'immunité adaptative, reste peu caractérisée dans ce contexte vaccinal. En vaccinant des macaques cynomolgus avec le virus de la vaccine modifiée Ankara, selon un schéma de primo-vaccination suivie d’un rappel homologue à deux mois, et en utilisant la cytométrie de masse couplée à des analyses bio-informatiques, nous avons caractérisé la réponse innée induite par chaque immunisation. Les réponses innées diffèrent entre primo-vaccination et rappel, avec induction par la primo-vaccination d’une modification phénotypique tardive des cellules innées, suggérant une meilleure capacité à répondre au rappel. De surcroît, la réduction à deux semaines du délai entre primo-vaccination et rappel abroge la mobilisation de ces cellules innées phénotypiquement modifiées et altère la qualité de la réponse humorale. En définitive, en plus de la réponse innée précoce, ce projet a mis en évidence l'induction par la primo-vaccination d'un vraisemblable entraînement inné tardif, un concept émergent traduisant la capacité de mémorisation des cellules innées via des modifications épigénétiques. Ce vraisemblable entraînement, non seulement des monocytes et cellules tueuses naturelles, mais aussi des cellules dendritiques et surprenamment des neutrophiles, est corrélé à la qualité de la mémoire immunitaire adaptative, de manière hautement dépendante du délai entre primo-vaccination et rappel. Ces résultats contribuent à ouvrir la voie vers l’optimisation rationnelle des futurs vaccins, via l'optimisation des calendriers vaccinaux et la valorisation de l'entraînement inné. / Vaccination is one of the best achievements made in public health. However, designing vaccines against complex pathogens is currently challenging. The immune system is indeed uncompletely characterized, despite large amount of accumulated knowledges. A better understanding of vaccine-induced immunity is then required to optimize vaccine design. In particular, while most vaccines require several immunizations to induce a long-lasting adaptive immune memory, little is known on the impact of the delay beween the prime inducing a primary memory and the boost restimulating it to induce a secondary memory. Also, the innate immunity induced by each immunization and shaping the adaptative immunity is poorly characterized in this vaccine context.We studied the innate immune responses in cynomolgus macaques immunized with the modified vaccinia virus Ankara, following an homologous prime-boost vaccination at two months apart. We applied mass cytometry and bioinformatic analyses to characterize the innate response induced by each immunization. We showed that prime and boost vaccination triggered distinct innate responses. Actually, prime induced late phenotypic modifications of innate cells. These phenotypic changes suggest a stronger ability to react to the boost. Moreover, reducing the delay between prime and boost to two weeks impeded the mobilization of these phenotypically modified innate cells, and qualitatively altered humoral response.In conclusion, beyond the early innate responses, these results highlight the late induction by the prime of "likely trained" innate cells. This emerging concept corresponds to the ability of innate cells to display memory features based on epigenetic modifications. This "likely training" occured not only on monocytes and NK cells, but also on dendritic cells and strikingly on neutrophils. It was deeply connected with adaptive immune memory establishment, in a prime-boost delay dependant fashion. These findings contribute to pave the way towards to the rationale design of future vaccines, via vaccine schedule optimization and harnessment of innate training.