Le but du travail de recherche présenté dans cette thèse était de déterminer les mécanismes impliqués dans le développement de symptômes neurologiques observés dans une lignée de souris transgénique pour l’expression de la molécule B7.2/CD86. La molécule B7.2 est un des ligands du récepteur CD28 qui transmet des signaux intracellulaires nécessaires à la prolifération des lymphocytes T et au développement de leurs fonctions effectrices. Nos travaux démontrent que ces souris développent spontanément une pathologie démyélinisante auto-immune conséquemment à l’expression transgénique de la molécule B7.2 sur les cellules de la microglie du système nerveux central. Les souris affectées présentent une infiltration de lymphocytes T au niveau du système nerveux central et périphérique proximal et cet infiltrat est prédominé par une population de lymphocytes T CD8[indice supérieur +] mémoires/effectrices. Nos études indiquent que la population de lymphocytes T CD8[indice supérieur +] joue un rôle effecteur dans le développement de la pathologie tandis que la population des lymphocytes T CD4[indice supérieur +] la régulent de façon négative. Nos résultats démontrent également que l’activation des cellules de la microglie survient très tôt lors de la pathogenèse et que cette activation des cellules de la microglie ainsi que le processus de démyélinisation sont entièrement dépendants de la signalisation par le récepteur de l’IFNy. Ce modèle de démyélinisation reflète l’émergence de cellules T autoréactives spécifiques au système nerveux à partir d’un répertoire périphérique polyclonal, un processus immunopathogénique qui se produit possiblement durant la pathogenèse de la sclérose en plaques. De plus, il présente certaines caractéristiques pathologiques similaires à celles de la sclérose en plaques tels que le développement spontané du processus de démyélinisation et de dommages aux axones ainsi qu’une connexité avec l’activité de l’IFNy. Plusieurs données de la littérature suggèrent que les lymphocytes T CD8[indice supérieur +] pourraient jouer un rôle dans les maladies auto-immunes affectant le système nerveux, mais la contribution exacte et les mécanismes pathogéniques spécifiques des lymphocytes T CD8[indice supérieur +] ne sont pas encore clairement établis. Le travail de recherche présenté dans cette thèse a donc permis d’établir que la lignée de souris transgénique qui exprime de façon constitutive le ligand de costimulation B7.2/CD86 sur les cellules de la microglie représente un nouveau modèle animal qui permettra d’étudier et de comprendre ces mécanismes pathogéniques spécifiques aux lymphocytes T CD8[indice supérieur +] ainsi que les processus qui régulent la participation des lymphocytes T CD8[indice supérieur +] dans la destruction de la gaine de myéline.

Bien que la plupart des études se focalisent sur les lymphocytes T CD4+ régulateurs, il a été observé que les lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent jouer un rôle important dans l’induction et le maintien de la tolérance immunitaire. Le transfert adoptif chez la souris et l’induction chez l’homme de lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent inhiber le rejet d’allogreffes et le développement de pathologies autoimmunes. Ces observations suggèrent que l’induction de ces populations peut avoir un potentiel thérapeutique. Des études supplémentaires sont encore nécessaires pour définir les conditions optimales de leur induction. Tant les nouveaux nés humains que murins ont une plus forte capacité que l’adulte à développer des lymphocytes T CD4+ régulateurs induits par une reconnaissance antigénique. La période néonatale serait donc particulièrement appropriée à l’induction de circuits régulateurs. Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié le rôle des lymphocytes T CD8+, induits à la naissance, dans le contrôle de la réponse des lymphocytes T CD4+ de type Th2. Des souris BALB/c sont immunisées à la naissance à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c). Ces cellules persistent dans l’animal, au sein des organes lymphoïdes et stimulent ainsi de manière chronique les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ du receveur et induisent une réponse de type Th2. Suite à l’injection des cellules spléniques semi-allogéniques au nouveau né de souris, nous avons observé l’expansion d’une population de lymphocytes T CD8+CD25+, dont le phénotype se caractérise par l’expression de Foxp3 et la production conjointe d’IFN- et l’IL-10. Nous avons pu observer que ces cellules sont capables d’inhiber la production de cytokines Th2 produites par les lymphocytes T CD4+ allospécifiques activés. Par contre, ces cellules régulatrices aggravent des réponses Th2 non apparentées. En effet, suite à une sensibilisation à l’ovalbumine, à l’âge adulte, ces souris développent de plus fortes réponses asthmatiques. D’autre part, les nouveaux nés de souris BALB/c ont été immunisés à la naissance à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c) qui activent de manière aigüe leurs lymphocytes T. Ces souris présentent une forte réponse Th1 et Tc1/Tc2 spécifique de l’alloantigène et sont protégées contre le développement d’un asthme induit. Il a aussi été montré dans ce travail que suite à l’immunisation néonatale à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques, le nombre de lymphocytes T CD8+CD44high, CD8+CD62Lhigh et CD8+CD25+ producteurs d’IFN- augmente significativement. L’IFN- produit par ces cellules contrôle l’hyperproduction des IgE spécifiques de l’allergène et la synthèse d’ARNm de l’IL-4 et de l’IL-13 induite dans les poumons des souris allergiques. Des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre comment des lymphocytes T CD8+ régulateurs induits lors de stimulations antigéniques aigües ou chroniques en début de vie peuvent être capables de contrôler l’apparition de pathologies allergiques. De plus, le développement de vaccins capables de cibler les lymphocytes T CD8+ chez le jeune enfant pourrait contribuer à la recherche de nouveaux traitements des allergies et de l’asthme.

L’élucidation des mécanismes permettant l’optimisation de la réponse immunitaire antitumorale correspond à un enjeu majeur pour le développement de stratégies d’immunothérapie efficace. En effet, les réponses immunitaires antitumorales se traduisent rarement par l’éradication de la tumeur. Dans ce contexte, les travaux antérieurs de mon équipe ont démontré que l’interaction de l’intégrine αE(CD103)β7, souvent exprimée par les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL), avec son ligand E-cadhérine, à la surface des cellules tumorales épithéliales, joue un rôle majeur dans la potentialisation de l’activité lytique des cellules T en induisant la polarisation et l’exocytose des granules cytotoxiques. Nos résultats ont indiqué aussi que le TGF-β1, souvent abondant dans les tumeurs, joue un rôle déterminant dans cette induction suite à l’engagement du récepteur des cellules T. Dans ce contexte, nous avons cherché à comprendre les mécanismes de régulation du gène ITGAE qui codent la sous-unité alphaE de l’intégrine CD103. Nos résultats ont montré que les facteurs transcriptionnels Smad2, Smad3 et NFAT-1 sont impliqués dans la régulation de l’expression de la sous-unité αE(CD103). En effet, une costimulation avec du TGF-β1 recombinant et un anticorps anti-CD3 d’un clone T CD103- induit l’expression de cette intégrine qui est accompagnée d’une translocation dans le noyau de Smad2, Smad3 et NFAT-1 qui sont cytoplasmiques à l’état basal. L’inhibition spécifique de ces facteurs transcriptionnels inhibe l’expression de CD103 et abroge le potentiel lytique du clone T vis à vis de sa cible tumorale autologue. De plus, nous avons identifié deux séquences régulatrices du gène ITGAE humain, un promoteur proximal et un enhancer. Par ailleurs, mon équipe a récemment montré que l’interaction de CD103 à la surface des TIL avec une molécule E-cadhérine recombinante est suffisante pour induire la polarisation des granules cytolytiques par un mécanisme dépendant de la PLC-g1 et ERK et que cette intégrine possède non seulement une fonction d’adhérence, mais aussi une fonction de costimulation du signal TCR des TIL antitumoraux. Nous avons cherché à mieux comprendre la signalisation de l’intégrine CD103, en identifiant les domaines intracytoplasmiques de la sous-unité αE impliqués dans son activation. Nous avons ainsi construit une protéine de fusion CD103-GFP et plusieurs mutants du domaine intracytoplasmique de la sous-unité αE qui ont été ensuite transfectés dans la lignée Jurkat Tag CD103-/beta7+. Nos résultats ont montré que le domaine intracytoplasmique de la chaîne alphaE n’est pas nécessaire à la reconnaissance du ligand, la E-cadhérine. Par contre, nous avons montré que ce domaine est impliqué dans le phénomène de clustering de l’intégrine et dans sa polarisation à la zone de contact avec des billes couvertes avec la E-cadhérine-Fc. Nous avons identifié un domaine de 8 acides aminés (ESIRKAQL), contenant une sérine en position 1163 potentiellement phosphorylable, et qui est indispensable pour la signalisation de l’intégrine. De plus, nos travaux ont montré que ce domaine ESIRKAQL, est nécessaire pour la phosphorylation de la ERK1/2 et PLC-g1. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régulant les fonctions de CD103 pourrait contribuer au développement et à l’amélioration de la réponse antitumorale exercée par les CTL. / The elucidation of mechanisms for optimizing the antitumor immune response is a major challenge for the development of strategies for effective immunotherapy. Indeed, the anti-tumor immune responses rarely result in the eradication of the tumor. In this context, the previous work of my team have shown that the interaction of integrin αE(CD103)β7, often expressed by tumor infiltrating lymphocytes (TIL) with its ligand E-cadherin at the cell surface tumor epithelial cells, plays a major role in the potentiation of the lytic activity of T cells by inducing polarization and exocytosis of cytotoxic granules. Our results also indicated that TGF-β1, often abundant in tumors, plays a key role in the induction due to the commitment of the T cell receptor. In this context, we sought to understand the mechanisms regulating ITGAE gene encoding the subunit αE of integrin. Our results showed that the transcription factors Smad2, Smad3 and NFAT-1 are involved in regulating the expression of subunit αE(CD103)β7. Indeed, costimulation with recombinant TGF-β1 and anti-CD3 antibody induces on T cell clone CD103- the expression of this integrin ant the translocation into the nucleus of Smad2, Smad3 and NFAT-1 that are cytoplasmic at baseline. Specific inhibition of these transcription factors inhibits the expression of CD103 and repeals the lytic potential of cloned T with respect to the autologous tumor target. In addition, we identified two regulatory sequences of human ITGAE gene, proximal promoter and enhancer. In addition, my team has recently shown that the interaction of CD103 on the surface of TIL with a recombinant molecule E-cadherin is sufficient to induce the polarization of cytolytic granules by ERK and PLC-γ1 pathway thus this integrin has not only a function of adherence, but also a function of costimulatory signal TCR of TIL. We sought to better understand the signaling of integrin CD103, by identifying the cytoplasmic domains of the subunit αE involved in its activation. We have constructed a fusion protein CD103-GFP and several mutants of intracytoplasmic domain of the subunit αE which were then transfected into the Jurkat Tag cell line CD103-/ β7+. Our results showed that the intracytoplasmic domain of CD103 is not necessary for ligand recognition, E-cadherin. By cons, we have shown that this area is involved in the phenomenon of clustering of integrin and its polarization to the contact area with balls covered with E-cadherin-Fc. We have identified a range of 8 amino acids (ESIRKAQL) containing a potentially phosphorylatable serine in position 1163, which is essential for integrin signaling. In addition, our work has shown that this area ESIRKAQL is necessary for the phosphorylation of ERK1/2 and PLC-g1. Thus, a better understanding of the molecular mechanisms that regulate the functions of CD103 may contribute to the development and improvement of the antitumor response exerted by CTL .

L'immunothérapie cellulaire passive par injection de lymphopcytes T cytotoxiques offre des possibilités thérapeutiques nouvelles dans l'immunité anti-virale et anti-tumorale. Par rapport aux méthodes actuelles de stimulation utilisant des lignées présentatrices d'antigènes, nous essayons de développer une méthode alternative d'amplification des lymphocytes T CD8 à l'aide d'une combinaison de protéines recombinantes immobilisées sur billes.<br />L'interaction 4-1BB/4-1BBL (CD137/CD137L) constitue un des signaux de co-stimulation impliqués dans l'activation des lymphocytes T CD8 effecteurs. Le travail présenté ici décrit pour la première fois la production et la caractérisation d'une forme fonctionnelle de 4-1BBL recombinant soluble. De plus, nous montrons qu'il est possible d'amplifier in vitro des lymphocytes T mémoires anti-CMV et anti-EBV avec des complexes HLA-peptide associés à ce 4-1BBL ou à de l'anticorps anti-CD28. L'intérêt de la co-stimulation du 4-1BB est comparée à celle du CD28 dans les 2 contextes antigéniques étudiés.

De récents progrès dans la compréhension de la régulation de l'interaction moléculaire entre les lymphocytes T CD8 (LT CD8) et les cellules tumorales ont donné lieu à de nouvelles immunothérapies contre le cancer. En effet, les anticorps monoclonaux anti-CTLA-4 et anti-PD-1 (mAb), ciblant des récepteurs inhibiteurs à la surface des LT CD8, ont démontré des bénéfices de survie dans de nombreux cancers. Malheureusement, seule une partie des patients répond à ces traitements. Il est donc crucial de caractériser l'influence d'autres facteurs moléculaires régulant la migration et les activités fonctionnelles des LT CD8 afin d'améliorer les traitements actuels du cancer. Un candidat potentiel impliqué dans cette immunosuppression est le récepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), qui a été initialement identifié dans le système nerveux. Nous avons identifié une large population de LT CD8 infiltrant le mélanome murin (lignée tumorale B16 greffée à des souris C57BL/6), qui exprime des niveaux élevés de Nrp-1. La présence de cette population augmente pendant la croissance tumorale, mais reste indétectable dans les organes lymphoïdes (rate et ganglion lymphatique drainant la tumeur). De plus, les LT CD8 infiltrant la tumeur exprimant Nrp-1 montre des caractéristiques d’épuisement. En parallèle, l’inhibition de la Nrp-1 avec un anticorps neutralisant augmente la capacité des LT CD8 à migrer, et à tuer les cellules tumorales autologues ex vivo. D’autre part, l’inhibition de la Nrp-1 in vivo agit en synergie avec la neutralisation du récepteur PD-1 pour le contrôle de la croissance tumorale et l’amélioration des fonctions effectrices des LT CD8. Nos résultats montrent donc comment le microenvironnement tumoral induit l'expression de la Nrp-1 sur les LT CD8 et comment ce récepteur neuronal peut participer à la régulation des fonctions effectrices des LT CD8 antitumoraux, avec de potentielles implications comme biomarqueur/cible pour une immunothérapie. / Recent advances in understanding the regulation of molecular interaction between CD8 T cell and tumor cells gave rise to novel cancer immunotherapies. Indeed, monoclonal antibodies against CTLA-4 and PD-1 (mAb), targeting inhibitory receptors on the surface of CD8 T cells, have demonstrated survival benefits in many cancers. Unfortunately, only a fraction of patients responds to these treatments. Therefore, it is crucial to characterize the influence of additional molecular factors regulating the migration and the functional activities of CD8 T cells, in order to improve current cancer treatments. A potential candidate involved in this immunosuppression function is the Neuropilin-1 (Nrp-1), which was originally identified in the nervous system. We identified a large subset of CD8 T cells infiltrating B16 melanoma (mouse model), which expresses high levels of Nrp-1. The frequency of Nrp-1+ CD8 T cells increased during tumor growth, but was undetectable in lymphoid organs (spleen and tumor-draining lymph node). Moreover, Nrp-1+ CD8 tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) displayed features of T cell exhaustion. Importantly, blocking of Nrp-1 with a neutralizing mAb, increases the capacity of CD8 T cells to migrate and to kill autologous tumor cells. In addition, the blockade of Nrp-1 in vivo acts synergistically with the neutralization of the inhibitory receptor PD-1 to control tumor growth and restore TIL function. Our findings show how the tumor microenvironment induces Nrp-1 expression on CD8 T cells and how this neuronal receptor may participate in regulating antitumor CD8 T cell response, with potential implications as a biomarker/target for immunotherapeutic intervention.

La nécrolyse épidermique toxique (NET) est une réaction cutanée médicamenteuse (CADR - Cutaneous Adverse Drug Reaction) rare et sévère qui se caractérise par une nécrose brutale de l’épiderme, entraînant un décollement cutané plus ou moins étendu. Il s’agit d’une urgence vitale avec jusqu’à 30% de décès à la phase aiguë. L’importance de la surface décollée définit deux entités cliniques : le syndrome de Stevens-Johnson quand le décollement est inférieur à 10% et le syndrome de Lyell quand il est supérieur à 30%. A distance, le risque de complications, notamment sous forme de synéchies des muqueuses, est particulièrement élevé et doit être prévenu systématiquement. Le mécanisme physiopathologique repose essentiellement sur une réaction d’hypersensibilité médicamenteuse retardée dans laquelle les lymphocytes cytotoxiques jouent un rôle majeur. Le terrain génétique intervient également avec des associations HLA-médicament maintenant bien décrites, notamment dans les populations asiatiques. La question du traitement reste encore très débattue : il repose essentiellement sur la corticothérapie systémique, la ciclosporine ou encore les immunoglobulines IV. Quelques études suggèrent également un intérêt des anti-TNF-alpha. Le but de ce travail est de comprendre les mécanismes à l’origine des CADRs les plus sévères, à travers la caractérisation de patients atteints de NET à la phase aiguë et en les comparant à une CADR bénigne comme l’EMP. Nous avons dans un premier temps déterminé quelles étaient les principales populations CD45+ présentes à la phase aiguë des NET et de patients ayant présenté un exanthème maculo-papuleux (EMP) bénin, à la fois dans la peau et dans le sang. Nous avons cherché à déterminer la présence de populations cellulaires spécifiques de ces pathologies, notamment au sein des lymphocytes T CD8+ qui étaient la population majoritaire dans ces deux CADRs. Nous avons notamment montré qu’il existait une expansion majeure de lymphocytes T CD8+ effecteurs mémoires et polycytotoxiques au cours de la NET comparativement à l’EMP. Puis, nous nous sommes intéressés à la clonalité de ces populations lymphocytaires T CD8+ au travers de l’analyse de leurs séquences V-béta puis au moyen d’un séquençage ADN haut débit : nous avons notamment montré que ces expansions lymphocytaires T CD8+ étaient clonotypiques dans la peau. Nous avons également étudié l’expansion de ces clones cutanés dans le sang des patients atteints de NET et avons montré que leur expansion sanguine était directement corrélé à la sévérité clinique. Enfin, nous avons pu démontré in vitro chez deux patients que ces clones étaient spécifiques du médicament inducteur. / Toxic epidermal necrolysis (TEN) is a rare and severe cutaneous adverse drug reaction (CADR). The histologic hallmark of this reaction is necrosis with detachment of the epidermis resulting in skin blistering. This is a vital emergency with up to 30% deaths at the acute phase. The percentage of blistering skin determines two clinical entities: Stevens-Johnson syndrome when detachment represents less than 10% and Lyell's syndrome when it is greater than 30%. The development of late complications, notably mucous synechiae, is frequent and must be systematically prevented. Pathophysiologic mechanism consists in a delayed drug hypersensitivity reaction in which cytotoxic T lymphocytes play a major role. Genetic background is also very important with HLA-drug associations which have been reported, notably in asian ppopulations. Treatment remains very debated : systemic steroids, ciclosporin or intravenous immunoglobulins are commonly used. Some studies also suggest that TNF-alpha inhibitors are of interest in treating this disease. The aim of this work is to understand the mechanisms underlying the most severe CADRs, through the characterization of TEN patients. We first determined the main CD45+ populations present in the acute phase of both TEN and patients who devloped a benign maculo-papular exanthema (MPE). We sought to determine the presence of cell populations specific to these pathologies, particularly within CD8+ T lymphocytes, which were the majority population in these two CADRs. In particular, we have shown that there is a major expansion of CD8+ T lymphocytes in memory and polycytotoxic effectors during TEN compared to MPE. Then, we focused on the clonality of these CD8+ T lymphocyte populations through the analysis of their V-beta sequences and then by means of high throughput DNA sequencing: in particular, we showed that these CD8+ T lymphocyte expansions were clonotypic in the skin. We also studied the expansion of these skin clones in the blood of TEN patients and showed that their blood expansion was directly correlated with clinical severity. Finally, we were able to demonstrate in vitro in two patients that these clones were specific to the suspected drug

Les cellules T régulatrices (Treg) jouent un rôle important dans différentes infections chroniques comme le VIH. Lors de l’infection chronique par le VIH, une augmentation du nombre de ces cellules limite la réponse des cellules T effectrices spécifiques du virus mais permet également le contrôle de la très forte activation du système immunitaire. La régulation de l’activité suppressive des Treg constitue une voie importante pour le développement d’un vaccin, l’efficacité de la surveillance tumorale et l’auto-immunité. Dans ce travail, nous avons étudié différents mécanismes de régulation des Treg chez les patients infectés par le VIH et sujets sains. Le but de mon travail a été d’étudier les mécanismes impliqués dans les fonctions suppressives des Treg et de leur régulation. Nous nous sommes particulièrement intéressés au rôle de Notch sur la sensibilité des cellules T effectrices à la fonction suppressive des Treg, en montrant que l’activation de Notch rendait les cellules T effectrices plus sensibles à l’action suppressive des Treg, et ceci même en présence d’un très faible nombre de Treg. Nous avons démontré que certains ligands de Notch, tels que DL-4 et Jagged-1 mais non DL-1, régulent l’effet inhibiteur des Treg sur les cellules T effectrices par une surexpression de TGFβ-RII et à la phosphorylation de Smad3. Le rôle important de l’enzyme CD39 dans la fonction suppressive des Treg a été décrit, mais peu d’études ont démontré son rôle dans l’infection par le VIH. Nous avons montré que les Treg de patients infectés par le VIH experiment plus fortement le CD39, et que leur effet suppresseur était inhibé en utilisant un anticorps monoclonal anti-CD39 et maintenu en utilisant un agoniste de l’adénosine. Nous avons également montré que le polymorphisme du gène CD39, associé à une plus faible expression de CD39, était corrélé à une plus lente progression de la maladie. Nos résultats montrent non seulement les mécanismes impliqués dans l’activité suppressive des Treg lors de l’infection par le VIH, mais constituent une approche intéressante pour en modifier les fonctions. Enfin, nous avons recherché l’effet de l’IL-7 sur le phénotype des Treg et l’expression de molécules impliquées dans leur fonction suppressive. Nos résultats montrent deux effets synergique de l’IL-7 sur les Treg mémoires: diminution de l’expression de CD39 à leur surface induisant une diminution de leur fonction suppressive, et surexpression du récepteur à l’ATP induisant un phénotype Th17. L’administration d’IL-7 in vivo chez des patients infectés par le VIH a confirmé la modification de phénotype des Treg en Th17 et notamment une surexpression du facteur de transcription spécifique des Th17, RORγt. En conclusion, notre travail apporte de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les fonctions inhibitrices des Treg et comment moduler ces fonctions. Ceci pourrait avoir un impact clinique direct, soit dans le traitement de maladies associées à un dysfonctionnement des Treg (infections chroniques virales, sclérose multiple, diabète de type 1, arthrite rhumatoide et lupus érythémateux), soit dans les stratégies vaccinales. / T regulatory cells (Treg cells) play an important role during various chronic infections like HIV. Increase in Treg cell number during chronic phase limit the HIV specific T effector cell response but may control exaggerated activation of the immune system. Modulation of regulatory T cell (Treg cells) suppression has important implications for vaccine development, the effectiveness of tumor surveillance, and the emergence of autoimmunity. Here we studied various mechanisms of Treg cells modulation in HIV+ patients and healthy subjects. The aim of my work was to decipher some aspects of the mechanisms involved in Treg cell mediated suppressive effects and the modulation of Treg cell suppressive effects in healthy subjects and HIV- infected patients.We have extended knowledge on the role of Notch in Treg/Effectors T cells cross talk. Here we focused our interest on the role of Notch pathway on the sensitivity of effectors T cells to Treg cell-mediated suppression, showing that Notch activation may significantly increase the sensitivity of effector cells to Treg cells even at a low ratio. We demonstrated that Notch ligands DL-4 and Jagged-1, but not DL-1 modulate significantly the suppressive effect of Treg cells on effectors T cells through an up regulation of TGF-RII expression and the phosphorylated form of Smad3 protein.A critical role of CD39 has been described for Treg cells in general but only a few studies have analyzed its role in HIV infection. We showed an increase in CD39 expression on Treg cells in a cohort of HIV- infected patients. Treg cells inhibitory effects were relieved by CD39 down modulation using an antiCD39 monoclonal antibody and this suppressive effect was reproduced on effector CD8+ T cells by an adenosine agonist. We found that CD39 gene polymorphism associated with a lower CD39 expression correlated with slower progression to AIDS. Our results shows not only the mechanism by which Treg cell suppression occurs during HIV infection but also provide an attractive approach to modify Treg cell functions.Finally, we have investigated the role of IL-7 on the phenotype of Treg cells and expression of molecules involved in the suppressive functions of these cells. Our results show that IL-7 exerts two synergistic effects on memory Treg cells. It decreases their suppressive effect by decreasing CD39 expression and increases ATP receptor leading to a switch towards a Th17 phenotype. In vivo administration of IL-7 tipped the balance towards a higher expression of RORγT in PBMCs from HIV infected patients.In conclusion our study bring new findings in the mechanisms involved in Treg cell mediated suppression and the way to modulate these cells which could have direct clinical impact either in the treatment of diseases associated with Treg cell dysregulation (chronic viral infections, autoimmune disorders like multiple sclerosis, type 1 diabetes, rheumatoid arthritis, and systemic lupus erthematosus) or during vaccination.

Lors de l’infection par le VIH, les réponses T CD8+ présentent de nombreux défauts fonctionnels d’ordre qualitatif et quantitatif. Les « HIV controllers » (HIC) constituent un rare groupe de patients (0,5%) qui contrôle spontanément in vivo la réplication virale. Des études ont montré que les fortes réponses T CD8+ observées chez les HIC jouent probablement un rôle majeur dans ce contrôle. Par ailleurs, l’activation immunitaire joue un rôle clé dans la déplétion T CD4+ et la progression. En effet, les patients virémiques présentent une forte activation mesurée par la fréquence de lymphocytes T CD8+ CD38+/HLA-DR+ alors que l’activation observée chez les HIC est faible, similaire à celle des patients sous traitements anti-rétroviraux ce qui pourrait expliquer l’absence fréquente de progression chez ces patients. De plus, les HIC sont caractérisés par une activation paradoxale avec une forte proportion de lymphocytes T CD8+ présentant une forte expression de HLA-DR contrastant avec une faible expression de CD38 et donc une fréquence plus importante de lymphocytes T CD8+ exprimant le phénotype particulier CD38-/HLA-DR+ que les lymphocytes T CD8+ des patients ne contrôlant pas le VIH.L’objectif de mon projet de thèse a été de caractériser les réponses T optimales pour le contrôle de la réplication virale chez les patients HIC. En étudiant la sous population CD38-/HLA-DR+, nous avons démontré que cette sous population exprime un phénotype particulier avec l’expression seule de HLA-DR comme marqueur d’activation mais aussi qu’elle possède de très bonnes fonctions effectrices (cytotoxicité) et mémoires (survie, polyfonctionnalité et prolifération). Nous avons par la suite étudié le mécanisme responsable de l’induction de ce phénotype particulier et démontré qu’une activation par de faibles doses d’antigènes induit préférentiellement le phénotype d’intérêt CD38-/HLA-DR+ alors qu’une activation par de fortes doses d’antigènes induit préférentiellement le phénotype CD38+/HLA-DR+.Nous avons par la suite caractérisé les lymphocytes T CD8+ des HIC à l’aide de marqueurs associés à une activité cytotoxique : les facteurs de transcription de la « boîte T », T-bet et Eomes et le marqueur CD57. Nous avons ainsi montré qu’il existe une hétérogénéité de l’expression d’Eomes et que seules les sous populations CD57+/Eomeshi et CD57+/Eomesint présentent ex vivo des capacités cytotoxiques. Il s’avère que les lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH des HIC expriment préférentiellement le phénotype CD57+/Eomeshi qui démontre de bonnes fonctionnalités (prolifération, survie). De plus la fréquence de cette sous population corrèle avec une faible charge virale suggérant que ces cellules CD57+/Eomeshi participent au contrôle de la réplication virale. Cependant, les fortes réponses T CD8+ ne sont pas retrouvées chez tous les patients HIC et il existe un certain nombre de patients, authentiquement contrôleurs in vivo mais dont les lymphocytes T CD8+ ne possèdent pas une activité inhibitrice ex vivo et que l’on a appelé « Weak Responders » par opposition aux « Strong Responders » qui présentent une forte capacité antivirale. Notre étude a permis de montrer que les réponses T CD8+ sont corrélés aux réponses T CD4+ : les « Weak Responders » présentent de faibles réponses T CD4+ et T CD8+ et les « Strong Responders » présentent de fortes réponses T CD4+ et T CD8+. Ces résultats ont permis de définir deux sous populations T CD8+ probablement impliquées dans le contrôle de la réplication virale in vivo. La faible dose d’antigène et la faible activation des lymphocytes pourraient être impliquées dans l’induction et la persistance de fortes réponses T CD8+ anti-VIH. L’utilisation de faibles doses d’antigènes permettant d’induire des lymphocytes T CD8+ avec une forte capacité d’inhibition de la réplication virale pourrait être envisagée dans de futurs essais cliniques vaccinaux. / Several defects of the immune response have been evidenced during HIV infection, especially CD8+ T cell response. A rare group of patients (0.5%) called HIV controllers (HIC) can spontaneously control HIV infection and studies showed that these patients present high HIV-specific CD8+ T cell responses. Moreover excessive activation of CD8+ T cells seems to play a major role since this parameter correlates strongly with disease progression. Indeed, immune activation observed in HIC is lower than in viremic patients and similar as in HAART-treated patients. Furthermore HIC exhibit a peculiar activation phenotype with low CD38 expression and high HLA-DR expression and characterized by a higher frequency of CD38-/HLA-DR+ expressing cells. The aim of these works was to characterize optimal HIV-specific T cells which are implicated in the control of viral replication in HIC. We first studied this subpopulation CD38-/HLA-DR+ and showed that it is characterized by an absence of activation marker expression except for HLA-DR and by efficient effector functions (high cytotoxicity) and good memory functions (better survival, proliferation and higher frequency of polyfunctional cells). We then deciphered the mechanism responsible for the induction of this phenotype and demonstrated that low dose of antigen induce preferentially CD38-/HLA-DR+ phenotype while high dose of antigen induce preferentially CD38+/HLA-DR+. We next characterized HIV-specific CD8+ T cells from HIC by markers associated with cytotoxicity: T-box transcription factor T-bet and Eomes and CD57. We demonstrated heterogeneity of Eomes expression and only CD57+/Eomeshi and CD57+/Eomesint subpopulation exhibit cytotoxic capacity ex vivo. We then showed that HIC exhibited higher frequency of CD57+/Eomeshi expressing HIV specific CD8+ T cells with high functionalities (proliferation, survival). Furthermore frequency of this subpopulation correlated with low viral load suggesting a role of CD57+/Eomeshi in the control of viral replication. Nevertheless, the high CD8+ T cell responses are not found in all HIC and some patients who control viral replication in vivo exhibit low inhibition by CD8+ T cells ex vivo and are called Weak Responders by opposition to Strong Responders who exhibit high inhibition by CD8+ T cells. Our study demonstrated that the CD8+ T cell response is associated with the CD4+ T cells: Weak Responders showed low CD4+ and CD8+ T cell responses especially low CD38-/HLA-DR+ frequency and Strong Responders showed high CD4+ and CD8+ T cell response especially high CD38-/HLA-DR+ frequency. We therefore defined two subpopulations which are overrepresented in HIC and which are probably implicated in control of HIV. The low dose and low immune activation could be involved in the induction and persistence of high anti-HIV CD8+ T cell response and might have implications for HIV vaccine strategies.

Le répertoire T CD8 préimmun correspond aux lymphocytes T spécifiques d'antigène circulant en périphérie, et n'ayant pas encore été activés. Ces cellules sont très rares, et de ce fait, n'ont jusqu'ici pas pu être étudiées de façon approfondie. Nous avons dans un premier temps développé un protocole d'enrichissement basé sur la technologie des tétramères. Nous avons pu détecter et énumérer des lymphocytes T CD8 naïfs spécifiques d'antigènes dans le sang de sujets sains. Nous avons ensuite utilisé cet outil pour évaluer le répertoire T préimmun de patients chroniquement infectés par le virus de l'hépatite C (cHCV). Nous avons démontré que celui-ci est significativement perturbé, avec des cellules hypersensibles à l'activation TCR et une proportion importante de lymphocytes T de phénotype mémoire alors qu'ils n'ont pourtant pas rencontré leur antigène cible. Ces anomalies disparaissent après résolution de l'infection, soulignant l'intérêt d'instaurer précocément un traitement antiviral chez ces patients. Enfin, nous avons observé dans un modèle de souris transgéniques (OTI) une proportion importante de T inexpérimentés de phénotype mémoire chez les animaux non-immunisés déficients en cxcr3. Nos travaux démontrent que les lymphocytes T inexpérimentés peuvent perdre leur naïveté dans différentes situations pathologiques. Ces résultats devraient être pris en considération pour l'optimisation de futures stratégies d'immunothérapie, notamment lorsque des patients dits "inflammatoires" sont la cible de vaccinations. Enfin, nos résultats soulignent la difficulté d'interpréter les données d'immunophénotypage en l'absence d'information sur la spécificité antigénique. / The CD8 preimmune repertoire is defined as the set of circulating antigen-specific T CD8 lymphocytes that have not been activated yet by their cognate antigen. Because those cells are very rare, they have not been evaluated in humans. We developed a tetramer-based enrichment protocol that allowed for the first time direct detection and enumeration of those rare naive antigen-specific CD8 T cells in healthys. We then used this tool to characterize the CD8 preimmune repertoire in patients with chronic hepatitis C viral infection. We found that their naive CD8 T cells are dysregulated, being hypersensitive to TCR signals, and with increased proportions of memory-phenotype (MP) cells in inexperienced populations. These perturbations are reversible after viral clearance, highlighting the added benefit of early antiviral treatment. Finally, using a transgenic model (OTI), we observed high proportions of MP inexperienced T cells in the blood of cxcr3-deficient unimmunized mice. This suggests that CXCR3-dependent lymphocyte trafficking could account for some preimmune repertoire alterations. Altogether, our work demonstrates that inexperienced T cells can lose their naiveté in several pathological situations. The impact of these findings will need to be considered when designing future immunotherapeutic strategies - especially when « inflammatory » patients are being targeted. Additionally, we highlight the challenge of interpreting T-cell immunophenotyping studies without getting knowledge into antigen-specific populations.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.