Au cours des dernières décennies, les approches expérimentales nous ont permis d'obtenir des informations importantes en biologie du développement et nous ont conduit à la définition de réseaux complexes de régulation contrôlant les processus développementaux. Actuellement, notre compréhension de ces réseaux est entravée par leur complexité même. La modélisation mathématique est de plus en plus utilisée pour intégrer les voies de régulation et prévoir les effets de perturbations génétiques. Durant ma thèse, je me suis intéressée à la différentiation du mésoderme chez Drosophila melanogaster. Elle commence par la spécification du mésoderme en 4 différents tissus: le muscle viscéral, le coeur, le muscle somatique et le corps gras. La formation de ces tissus se traduit par une organisation segmentale répétitive le long du mésoderme. Mon premier but était de construire un modèle qui récapitule la spécification de ces quatre tissus entre les stades 8 et 10. Par la suite, je me suis concentrée sur le développement du coeur dans le but de proposer un modèle de régulation de la diversification des cellules cardiaques contractiles (cardioblastes) entre les stade 10 et 12. Afin de comprendre ces processus complémentaires, j'ai été amené à modéliser les voies de signalisation qui jouent un rôle important dans le développement du mésoderme et des cardioblastes. Je me suis appuyée sur des données génétiques et des analyses haut-débit publiées (HhIP-chip, ChIP-seq et transcriptome) pour déterminer et annoter des graphes de régulation complet pour chacun de ces réseaux ou voies. / During the past decades, experimental approaches have allowed us to gain important insights in developmental biology, and led to the delineation of complex regulatory networks controlling developmental processes. Currently, our understanding of these networks is hindered by their sheer complexity. Mathematical modelling is increasingly used to integrate regulatory pathways and predict the effects of genetic perturbations. My thesis focuses on the development of the specification of the mesoderm in Drosophila melanogaster. Its development results in the formation of different tissues segmentally iterated: the visceral muscle, the heart, the somatic muscle, and the fat body. My first goal was to build a network model recapitulating the specification of these 4 mesodermal tissues during stages 8 to 10. Then, focusing on heart development, my second aim was to build a network model recapitulating contractile cardiac cell (cardioblast) diversification during stages 10 to 12. To understand these complementary processes, I was further led to model the signalling pathways that play important roles in mesoderm and cardioblast development. I rely on a combination of published genetic data and high- throughput analyses (ChIP-chip, ChiP-seq, transcriptome) to delineate and annotate comprehensive regulatory graphs for each of these networks or pathways. Using a logical formalism and the GINsim software, I have further defined logical rules enabling the simulation of wild type and mutant behaviours for each of this networks or pathways. By and large, my model simulations recapitulate all relevant published data.

Les cellules épithéliales fournissent différentes fonctions biologiques: elles servent de barrière entre l'extérieur et l'intérieur d'un organisme et forment un continuum mécanique à travers les jonctions adhérentes qui les connectent. Au cours du développement, elles subissent des modifications extrêmes pour former l'embryon: elles changent de forme, modifient leur position relative ou perdent leur intégrité épithéliale. La plus part de ces changement se basent sur la modulation de l'actomyosine corticale et jonctionale, et sur la modulation des protéines qui définissent et maintiennent la polarité apico basale. Neuralized (Neur) est une E3 ubiquitine ligase qui est conservée des nématodes jusqu'aux mammifères. Elle a été découverte pour son rôle dans la régulation de la signalisation Delta/Nocth. Dans ce travail on décrit deux autres functions Notch-indépendantes de Neur dans le remodelage des épithéliums. En premier temps, on montre que Neur régule négativement la protéine apicale Crumbs à travers une isoforme de Stardust, ce qui permet le remodelage de l'intestin postérieur de la Drosophile et favorise la migration trans-epithéliale des cellules germinales primordiales. Puis, on présente que, pendant la gastrulation, Neur module la contractilité de l'actomyosine dans le mésoderme, et indirectement dans l'ectoderme, pour contrôler la formation du sillon ventral. / Epithelial cells serve many biological functions: they act as a barrier to separate the interior from the exterior, and form a mechanical continuum through the junctions that interconnect them. During development, they undergo dramatic changes to shape the embryo: they change their shape, modify their relative position or lose their epithelial integrity. Most of these changes rely on the modulation of cortical and junctional actomyosin, and the regulation of the proteins that define and maintain the epithelial apical/basal polarity. Neuralized (Neur) is an E3 ubiquitin ligase conserved from nematodes to mammals. It was first discovered for its role in the regulation of Delta/Notch signalling. Here we describe two Notch independent roles of Neur in epithelial remodelling. First, we show that Neur negatively regulates the apical protein Crumbs though a specific isoform of Stardust. This allows the remodelling of the drosophila posterior midgut and favours the trans-epithelial migration of the primordial germ cells. Finally, we present that Neur modulates actomyosin contractility in the mesoderm, and indirectly in the ectoderm, to control ventral furrow formation during gastrulation.

La crête neurale (CN) est une structure multipotente transitoire de l'embryon de vertébrés. La CN céphalique (CNC), mais pas la CN troncale (CNT), fournit des tissus mésenchymateux (squelette, derme et tissus adipeux de la face). Cette capacité de la CNC est liée à l'absence d'expression des gènes de type Hox. Cependant, les cellules de la CNT possèdent des potentialités mésenchymateuses à l'état dormant, qui peuvent s'exprimer en culture. Les mécanismes moléculaires qui régulent les potentialités mésenchymateuses de la CN le long de l'axe antéro-postérieur restent incompris. Chez l'embryon d'oiseau, nous avons étudié l'influence des facteurs de transcription Hox et Six sur la formation du mésenchyme par la CN. D'une part, nos analyses in vivo et in vitro montrent que Six1 est présent dans des cellules mésenchymateuses de la CN et du mésoderme, suggérant un rôle dans le développement musculo-squelettique de la tête. D'autre part, nous avons testé l'hypothèse d'un rôle inhibiteur des facteurs Hox. Nos résultats montrent que l'expression ectopique de Hoxa2 dans les cellules de CNC en culture inhibe la production d'ostéoblastes, sans affecter celle des cellules nerveuses et mélanocytaires. Dans la CNT, nous avons trouvé que la différentiation osseuse, cartilagineuse et adipocytaire, est fortement réduite après la surexpression de Hoxa2, sans effet sur les autres phénotypes dérivés de la CN. Ces résultats suggèrent que les potentialités mésenchymateuses de la CN sont régulées, au moins en partie, par un mécanisme commun aux cellules de CNC et CNT, mettant en jeu une inhibition de l'activité du gène Hoxa2. / The neural crest (NC) is a transitory multipotent structure of the vertebrate embryo. The cephalic NC (CNC), not the trunk NC (TNC), gives rise to mesenchymal cell types (contributing to craniofacial skeleton, dermis and adipose tissue). This capacity of the CNC has been linked to the absence of Hox gene expression in the most rostral region of the embryo. However, TNC cells do have mesenchymal potentialities, although in a dormant state in vivo, but which can be disclosed after NC in vitro culture. The molecular mechanisms that regulate mesenchymal potentials of the NC cells along the rostral-caudal axis are still elusive. Here, we have used the avian embryo model to investigate the possible influence on NC mesenchymal fate, of Hox and Six transcription factor genes. On the one hand, in vivo and in vitro culture analyses show that Six1 gene is expressed in mesenchymal cell populations derived from both cranial NC and mesoderm, suggesting a role for Six1 in muscle-skeletal development in the head. On the other hand, we have tested the hypothesis of an inhibitory action of Hox genes on NC cell mesenchymal differentiation using NC in vitro cultures. In CNC cells, we found that ectopic expression of Hoxa2 strongly reduces the production of osteoblasts, while neural and melanocytic phenotypes are unaffected. In the cultured CNT cells, overexpression of Hoxa2 results in largely impaired differentiation into bone cells, chondrocytes and adipocytes, whereas other NC derivatives are unchanged. These results suggest that mesenchymal potentials of the CNC and TNC are controlled, at least in part, via a common mechanism that involves inhibition of Hoxa2 gene activity.

Dans la première partie de cette thèse effectuée en collaboration avec le groupe expérimental de C. Chazaud (Clermont Université), nous avons étudié théoriquement un processus de différenciation cellulaire intervenant avant l’implantation de l’embryon dans l’utérus. Il s’agit de la spécification des cellules de la masse cellulaire interne (MCI) en épiblaste (EPI) et en endoderme primitif (EPr), processus dans lequel les facteurs de transcription Nanog et Gata6 jouent un rôle essentiel. En effet, en absence de Nanog, les cellules de la MCI acquièrent toutes une identité EPr, tandis qu’en absence de Gata6, elles se différencient toutes en EPI. De plus, la voie de signalisation Fgf/Erk active l’expression de Gata6 et inhibe celle de Nanog. Enfin, Nanog active la sécrétion dans le milieu extracellulaire de Fgf4, une molécule qui active la voie de signalisation Fgf/Erk en se liant au FgfR2. Nous avons développé un modèle mathématique pour ce réseau de régulations, fondé sur des équations différentielles ordinaires décrivant l’évolution temporelle des niveaux de protéines Nanog, Gata6, Fgf4 et Fgfr2 et de l’activité de la voie Fgf-Erk. Nous avons validé ce modèle en montrant qu’il récapitule les résultats expérimentaux obtenus in vivo, dans les embryons wild-type et dans les mutants Nanog-/- et Gata6-/-. De plus, l’analyse des résultats du modèle permet de proposer un nouveau mécanisme pour l’émergence d’une population mixte de cellules EPI et EPr au sein de la MCI. Ce mécanisme repose sur le fait que le système décrit par notre modèle peut présenter trois états stationnaires stables, dont les niveaux d’expression de Nanog et Gata6 correspondent à l’EPI, l’EPr et la MCI non-différenciée, respectivement. De plus, le modèle a été utilisé afin d’interpréter des résultats expérimentaux récents et contre-intuitifs, concernant les embryons hétérozygotes Gata6+/-. Enfin, nous avons établi des prédictions théoriques, dont certaines ont été ultérieurement vérifiées en laboratoire. <p>Dans la seconde partie de la thèse, effectuée dans le laboratoire d’O. Pourquié (Université de Strasbourg), nous avons étudié un processus de différenciation in vitro, par une approche expérimentale. Il s’agit de la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES) en cellules de mésoderme paraxial, un tissu dont dérivent –au cours du développement embryonnaire– les cellules formant notamment les vertèbres, les côtes, la peau et les muscles squelettiques du dos.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez les Vertébrés, le plan d’organisation du corps est mis en place lors de l’élongation de l’axe antéro-postérieur. L’importance du mésoderme pré-somitique (PSM) dans l’élongation a précédemment été démontrée chez l’embryon de poulet. Il a été proposé qu’un gradient de motilité cellulaire aléatoire, contrôlé par un gradient de morphogène, était nécessaire à l’élongation de l’axe. À ce jour, les interactions entre un profil de signalisation moléculaire bien connu et un mécanisme physique d’élongation restent à explorer. En particulier, plusieurs questions de mécanique doivent être étudiées. Tout d’abord, un gradient de motilité cellulaire peut-il provoquer l’extension du PSM ? Ensuite, la force générée par l’extension du PSM peut-elle être à l’origine de l’élongation de l’axe ? Enfin, comment l’extension du PSM est-elle couplée mécaniquement à l’élongation des autres tissus ? Pour répondre à ces questions, une meilleure description des propriétés mécaniques des tissus embryonnaires est nécessaire. De plus, afin d’estimer la contribution des différents tissus au processus d’élongation, une analyse quantitative de la production de force de ces tissus est essentielle. Dans cette thèse de doctorat, nous présentons le profil des propriétés visco-élastiques du PSM et du tube neural le long de l’axe. Nous démontrons également que des PSM isolés sont capables de s’allonger de manière autonome et nous mesurons leur contribution à la force totale d’élongation. / In vertebrates, the elongation of the anteroposterior axis is a crucial step during embryonic development as it results in the establishment of the basic body plan. A previous study highlighted the importance of the presomitic mesoderm (PSM) in elongation and showed that a gradient of random cell motility along the anteroposterior axis is necessary for proper elongation of the chicken embryo. It was proposed that a gradient of random cell motility, downstream of a morphogen gradient, drives axis extension. To date, the potential interaction between well-established molecular signaling and physical mechanisms involved in axis elongation remains largely unexplored. In particular, several mechanical questions need to be addressed. First, can the cell motility gradient lead to PSM extension? Second, is the force generated by PSM extension capable of promoting axis elongation? Third, how is PSM extension mechanically coupled with the elongation of all embryonic tissues? In order to tackle these questions, a better description of the mechanical properties of the embryonic tissues is required. Moreover, to assess specific tissues' contribution to elongation, a quantitative analysis of their force production is needed. In this Ph.D. thesis, we measure how the viscoelastic properties of both the PSM and the neural tube vary along the anteroposterior axis. We also demonstrate that isolated PSM explants are capable of autonomous elongation and we measure their contribution to the total force production in the embryo.

La thérapie cellulaire représente une alternative intéressante aux approchespharmacologiques dans le cadre de certaines pathologies comme les dystrophiesneuromusculaires ou l’ischémie du myocarde. La transplantation de précurseurs adultes deces tissus peut améliorer ces pathologies. Toutefois, le faible nombre de ces précurseursdans l’organisme et la difficulté de leur culture et expansion in vitro sont des facteurslimitants. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches embryonnaires (ES)constituent une source alternative pour la thérapie cellulaire. Cependant, leur efficacité dedifférenciation dans un lignage donné doit être finement contrôlée avant de pouvoir lesutiliser avec succès.Afin de mieux connaître le potentiel thérapeutique des cellules dérivées de cellulesES, il est essentiel de caractériser les mécanismes moléculaires qui engagent les cellules ESvers différents lignages. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la voie designalisation p38MAPK, qui est largement impliquée dans la différenciation cellulaire et lasurvie cellulaire. Nous avons plus précisement étudié l’implication de p38MAPK au coursdes différenciations endothéliale, du muscle lisse et du muscle squelettique.Nous avons mis en évidence que les cellules ES p38!-/- ne se différencient plus encellules endothéliales, en cellules du muscle lisse et en cellules du muscle squelettique. Laré-expression de p38MAPK dans ces cellules restaure partiellement les différenciationsdérivées du mésoderme (les différenciations endothéliale, du muscle lisse,cardiomyocytaire et de muscle squelettique). Parallèlement grâce à une inhibitionspécifique de la voie p38MAPK au cours de la différenciation des cellules ES, nous avonsmontré que la voie p38MAPK agit via deux mécanismes moléculaires distincts successifspour réguler la différenciation mésodermique des cellules ES. Le premier mécanisme estcorrèlé à l’expression de Brachyury, un marqueur précoce du mésoderme, alors que lesecond mécanisme est indépendant de Brachyury.Nous avons ensuite poursuivi l’étude de l’implication de p38MAPK dans lamyogénèse des cellules ES et nous avons pu mettre en évidence que p38MAPK estnécessaire à la fois pour l’engagement précoce et la différenciation terminale des cellulesmusculaires.En combinant des approches biochimiques et génétiques, nous avons démontré que lavoie de signalisation p38MAPK est nécessaire très précocement à la différenciation deslignages issus du mésoderme.Ces résultats permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculairesimpliqués dans la différenciation des cellules ES, ce qui constitue une étape préalable ausuccés de futures thérapies cellulaires. / Embryonic stem (ES) cells give rise, in vivo, to all of the three germ layers and, invitro, to differentiate into a broad variety of cell lineages which opens up largeperspectives in regenerative medicine. We previously found that the p38MAPKpathway controls the commitment of ES cells toward either cardiomyogenesis (p38on) or neurogenesis (p38 off ). In this study, we show that p38a knock-out ES cellsdo not differentiate into cardiac, endothelial, smooth muscle, and skeletal musclelineages. Reexpression of p38MAPK in these cells partially rescues theirmesodermal differentiation defects and corrects the high level of spontaneousneurogenesis of knock-out cells. Wild-type ES cells were treated with a p38MAPKspecificinhibitor during the differentiation process. These experiments allowed us toidentify 2 early independent successive p38MAPK functions in the formation ofmesodermal lineages. Further, the first one correlates with the regulation of theexpression of Brachyury, an essential mesodermal-specific transcription factor, byp38MAPK. Moreover, we also showed that p38MAPK is required for the late stageskeletal muscle differentiation. In conclusion, by genetic and biochemicalapproaches, we demonstrate that p38MAPK activity is essential for the commitmentof ES cell into cardiac, endothelial, smooth muscle, and skeletal muscle mesodermallineages.

Durant ma thèse je me suis intéressé à trois sujets différents connectés par la méchanotransduction au cours du développement. Mon intérêt principal étant porté sur les impacts évolutifs apportés par la méchanotransduction. Mais qu’est-ce que la méchanotransduction ? C’est la conversion d’un stimulus mécanique en une activité biochimique. Ces mécanismes sont présents dans bien des domaines : motilité des cellules, différentiation cellulaire, création de structures. Durant ma thèse je me suis principalement intéressé aux mécanismes de méchanotransduction liés à l’invagination du mésoderme chez la drosophile. Ce mouvement est l’un des tous premiers mouvements morphogénétique et fait partie d’une étape clé du développement qu’est la gastrulation mécanisme commun à toutes les espèces animales. Dans un premier temps je me suis focalisé cette invagination du mésoderme chez la Drosophile. Cette invagination est générée par des accumulations apicales de myosine qui vont entrainer une constriction apicale des cellules. Mon premier travail a été de comprendre et de modéliser ce mouvement en me basant sur le travail effectué dans le laboratoire. En effet il a été prouvé que les contraintes mécaniques entrainent directement l’invagination du mésoderme : par une indentation sur le mésoderme d’embryons incapables de réaliser une invagination on arrive à restaurer cette dernière. La modélisation que j’ai réalisée permet de montrer la plausibilité de réaliser un couplage bio-mécanique afin d’expliquer la formation de cette invagination. Le modèle est composé d’une chaine de cellules couplées mécaniquement entre elles par des jonctions adhérentes. Les cellules sont excitées individuellement par une force sinusoïdale leur taille va donc être modifiée. Grace au couplage certains comportements collectifs vont apparaitre. Pour les cellules associées à certaines conditions génétiques une fois que la taille seuil sera dépassée, la cellule va générer une force de constriction. Comme la cellule se constricte elle va déformer les cellules voisines qui seront plus à même de franchir la taille pallier. Une invagination globale va s’en suivre. Ce modèle reproduit quantitativement la dynamique de constriction des apex et permet de vérifier la possibilité d’obtenir une invagination à partir d’interactions mécaniques entre les cellules. Il permet met aussi en évidence l’importance de l’étude des comportements collectifs qui permettent par différents couplages. Dans une seconde partie j’ai effectué le parallèle entre l’invagination du mésoderme de la drosophile et l’initiation de l’épibolie du poisson zèbre en se focalisant sur le rôle de contraintes mécaniques développées par ces premiers mouvements morpho-génétiques. Ces premiers mouvements vont déterminer la création des différents feuillets et notamment la différentiation des cellules du mésoderme. Ces deux espèces montrent des mécanismes de méchanotransduction communs avec la phosphorylation de la beta-catenin (b-cat) Y667. Cette phosphorylation entraine l’expression de gènes twist (Drosophile) et notail (Danio rerio) nécessaire aux mouvements morphogénétiques. Les expériences réalisées consistent à bloquer les mouvements par l’intermédiaire de drogues (pour le poisson zèbre) ou de mutations (pour la Drosophile) et exercer une déformation mécanique sur les embryons. En l’absence de contraintes mécaniques la betacatenin n’est plus phosphorylée, de ce fait on elle n’est plus présente dans les noyaux ce qui entraine une perte d’expression des gènes twi ou notail. Avec une déformation mécanique alors que les mouvements sont bloqués nous arrivons à réactiver la phosphorylation de la βcat et ré induire l’expression des gènes. Ma contribution majeure pour ces expériences a été la mise en place d’un système magnétique permettant de mimer les mouvements de l’épibolie. (...) / In this thesis, I first focused on the testing of the hypothesis of the mechanotransductive activation of the apical accumulation of Myosin-II (Myo-II) that leads to Drosophila embryos mesoderm invagination, in response to the active cell apex pulsations preceding gastrulation in the mesoderm. This hypothesis was proposed on the basis of previous experiments realized in my host lab, having consisted in the rescue of mesoderm invagination in pulsation and invagination defective mutants, in response to a simple mechanical indent of the mesoderm. Here I demonstrated quantitatively the plausibility of such mechanical trigger of the active apical accumulation of Myo-II leading to subsequent mesoderm invagination, in response to the mechanical strains developed by the endogenous pulsative movements of mesoderm cell apexes, in silico. In a second part, I tested experimentally the role of the mechanical strains developed by the very first morphogenetic movements of zebrafish (Danio rerio) and Drosophila embryos, in the early specification of mesoderm cells identity. Specifically, to test this hypothesis, I developed magnetic biophysical tools to mimic the epiboly morphogenetic movements in epiboly defective zebrafish embryos. We found the beta-catenin (B-cat) Y667 phosphorylation as the common mechano-transductive pathway involved in earliest mesoderm genes expression notail and twist respectively, in response to the very first morphogenetic movements of embryogenesis in both species, epiboly and mesoderm invagination, respectively. This allowed to suggest such mechanotransduction pathway as conserved from the last common ancestor of both species, namely the last common ancestor of bilaterians, therefore possibly involved in the origins of mesoderm emergence in the ancestor, which represents a currently important opened question of evo-devo. In a third part, I developed experiments of mechanical indent of Drosophila embryos germ cells, and demonstrated the production of generational heritable developmental defects induced on at least 3 generations. These experiments suggest accidental mechanical perturbation of germ cells as a putative new motor mode of heritable modulations in the genetic developmental program of embryogenesis, with the molecular mechanism underlying such transmission being currently in progress.

Au cours de gastrulation chez la Drosophile, deux vagues successives de constriction ont lieux au niveau des cellules ventrales menant à l'invagination du mésoderme. La première vague de constriction est stochastique et entraine la constriction de 40% des cellules mesodermales réparties aléatoirement et est contrôlée par le facteur de transcription Snail. La seconde vague de constriction arrive immédiatement après et implique également la constriction des 60% manquant de cellules mésodermales. Cette seconde vague est contrôlée par le facteur de transcription Twist et requière la présence de la protéine sécrétée Fog. L'invagination complète du mésoderme riquière la redistribution de la protéine moteur Myosine II au niveau de l'apex des cellules en cours de constriction. Il a été montré que la mutation de Snail mène à une perte des deux phases de constriction, mais qu'une indentation sur les cellules du mésoderme permet de rétablir la seconde phase de constriction Twist dépendante. Nous avons cherché à étudier les interaction entre les deux phases de constriction, la protéine sécrétée Fog et le moteur moléculaire Myosine II à l'aide d'une simulation numérique. Nous avons également chercher à étudier la corélation entre l'invagination globale du mésoderme et la phosphorylation de la Bêta-Cathenine qui est impliquée dans l'activation de Twist. Nous avons étudier l'invagination de l'endoderme postérieur qui présente de nombreuses similitude avec l'invagination de l'endoderme et leurs interactions. Enfin également à l'aide d'une simulation numérique, nous avons testé l'hypothèse de l'apparition d'une invagination dans un organisme primitif mécano-sensible ( la gastræ d'HAECKEL ) au contact avec le plancher océanique. / During Drosophila gastrulation, two waves of constriction occur in the apical ventral cells, leading to mesoderm invagination. The first constriction wave is a stochastic process mediated by the constriction of 40% of randomly positioned mesodermal cells and is controlled by the transcription factor Snail.The second constriction wave immediately follows and involves the other 60% of the mesodermal cells. The second wave is controlled by the transcription factor Twist and requires the secreted protein Fog. It is known that Snail mutation lead to the loss of the two constriction phases but a mechanical poking on the mesoderm cells can rescue de second phase of Twist dependent constriction. The interactions between the two constriction phases, la secreted protein Fog and the molecular motor Myosin II with a numerical simulation. The posterior endoderm invagination that presents similarities with mesoderm invagination have been study, as well as the interaction between them. Finally with an other numerical simulation, the hypothesis of an induced invagination on a primitive mechanosensible organism ( the HAECKEL grastrae ) on the contact with the oceanic floor has been tested.