Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La fibroïne de soie extraite des fibres de cocons de vers à soie Bombyx mori a été utilisée dans une vaste gamme d'applications telles que la culture cellulaire, la régénération de tissus osseux et la libération contrôlée de molécules actives. Le choix de cette protéine fibreuse pour la conception de biomatériaux voués à l'ingénierie tissulaire est motivé par leurs impressionnantes propriétés mécaniques, leur biocompatibilité et leur biodégradabilité. Le but du projet de recherche principal présenté dans ce mémoire était de préparer des matériaux poreux à base de fibroïne de soie séricicole pour créer une matrice 3D utilisable comme support pour culture cellulaire in vitro. Dans cette optique, l'impact de l'addition de NaCl (0-250 mM) dans les solutions de fibroïne avant la congélation ainsi que l'effet de la température de congélation (-22°C ou -73°C) ont été étudiés lors de la préparation de matrices 3D lyophilisées. Les matériaux ont ensuite été traités au méthanol pour induire leur insolubilité, puis immergés dans l'eau pour extraire le sel. Tel qu'observé par microscopie électronique à balayage (MEB), la morphologie des matrices préparées à -22°C est constituée d'un réseau poreux interconnecté devenant moins serré avec l'ajout de sel. Les biomatériaux préparés à -73°C possèdent plutôt une structure en feuillets orientés sur lesquels des filaments et micropores sont apparus lors de l'addition de sel. Aux deux températures de congélation, les matrices ont affiché un ratio de gonflement plus élevé et une résistance à la compression plus faible lors de leur préparation en présence de sel. Les différences morphologiques des matrices ont été corrélées avec les variations dans les processus de nucléation et de croissance des cristaux de glace lors de la congélation. L'étude des matériaux par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et diffraction des rayons X (XRD) a révélé un changement dans la structure secondaire de la fibroïne, passant d'un mélange d'hélices a et pelotes statistiques dynamiques, vers une structure majoritairement en feuillets β induite par le traitement au méthanol. Aucune différence n'a cependant été observée en fonction de l'ajout de sel ou de la variation de la température de congélation. La microscopie confocale à balayage laser a permis de constater que des cellules ensemencées dans les matrices demeuraient viables et avaient pénétré la majorité des biomatériaux pour s'organiser en agrégats après 24 h de culture. Cette étude permet de conclure qu'il est possible d'adapter la morphologie de matrices 3D lyophilisées pour une utilisation comme support pour culture cellulaire. Aussi, un second projet de recherche présenté dans ce mémoire aura permis d'évaluer le potentiel d'utilisation d'un isolat de protéines de soja mélangé à l'amidon riche en amylose (ARA) pour la production d'un excipient pharmaceutique visant la libération de molécules actives par voie orale. Les résultats de libération de la 8-hydroxyquinoline (HQN) comme traceur ont montré que l'ajout d'ARA gélatinisé n'améliore pas le comportement de l'isolat de protéines de soja Pro, cependant l'ajout de Pro semble plutôt améliorer les propriétés de l'ARA gélatinisé comme excipient. La Pro ajoutée aux formulations d'ARA a apparemment favorisé la cohésion des particules en milieux digestifs simulés, présentant un potentiel d'additif liant dans les formulations. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : fibroïne de soie, matrices 3D, culture cellulaire, lyophilisation, cristaux de glace, chlorure de sodium, température de congélation, isolat de protéines de soja, amidon

L’utilisation de cellules vivantes dans un procédé industriel tire profit de la complexité inhérente au vivant pour accomplir des tâches complexes et dont la compréhension est parfois limitée. Que ce soit pour la production de biomasse, pour la production de molécules d’intérêt ou pour la décomposition de molécules indésirables, ces procédés font appel aux multiples réactions formant le métabolisme cellulaire. Afin de décrire l’évolution de ces systèmes, des modèles mathématiques composés d’un ensemble d’équations différentielles sont utilisés. Au fur et à mesure que les connaissances du métabolisme se sont développées, les modèles mathématiques le représentant se sont complexifiés. Le niveau de complexité requis pour expliquer les phénomènes en jeu lors d’un procédé spécifique est difficile à définir. Ainsi, lorsqu’on tente de modéliser un nouveau procédé, la sélection du modèle à utiliser peut être problématique. Une des options intéressantes est la sélection d’un modèle provenant de la littérature et adapté au procédé utilisé. L’information contenue dans le modèle doit alors être évaluée en fonction des phénomènes observables dans les conditions d’opération. Souvent, les modèles provenant de la littérature sont surparamétrés pour l’utilisation dans les conditions d’opération des procédés ciblées. Cela fait en sorte de causer des problèmes d’identifiabilité des paramètres. De plus, l’ensemble des variables d’état utilisées dans le modèle n’est pas nécessairement mesuré dans les conditions d’opération normales. L’objectif de ce projet est de cibler l’information utilisable contenue dans les modèles par la simplification méthodique de ceux-ci. En effet, la simplification des modèles permet une meilleure compréhension des dynamiques à l’oeuvre dans le procédé. Ce projet a permis de définir et d’évaluer trois méthodes de simplification de modèles mathématiques servant à décrire un procédé de culture cellulaire. La première méthode est basée sur l’application de critères sur les différents éléments du modèle, la deuxième est basée sur l’utilisation d’un critère d’information du type d’Akaike et la troisième considère la réduction d’ordre du modèle par retrait de variables d’état. Les résultats de ces méthodes de simplification sont présentés à l’aide de quatre modèles cellulaires provenant de la littérature.

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Biological studies always start from curious observations. This is exemplified by description of cells for the first time by Robert Hooke in 1665, observed using his microscope. Since then the field of microscopy and cell biology grew hand in hand, with one field pushing the growth of the other and vice-versa. From basic description of cells in 1665, with parallel advancements in microscopy, we have travelled a long way to understand sub-cellular processes and molecular mechanisms. With each day, our understanding of cells increases and several questions are being posed and answered. Several high-resolution microscopic techniques are being introduced (PALM, STED, STORM, etc.) that push the resolution limit to few tens of nm, taking us to a new era where ‘seeing is believing'. Having said this, it is to be noted that the world of cells is vast, with information spread from nanometers to millimetres, and also over extended time-period, implying that not just one microscopic technique could acquire all the available information. The knowledge in the field of cell biology comes from a combination of imaging and quantifying techniques that complement one another.Majority of modern-day microscopic techniques focuses on increasing resolution which, is achieved at the expense of cost, compactness, simplicity, and field of view. The substantial decrease in the field of observation limits the visibility to a few single cells at best. Therefore, despite our ability to peer through the cells using increasingly powerful optical instruments, fundamental biology questions remain unanswered at mesoscopic scales. A global view of cell population with significant statistics both in terms of space and time is necessary to understand the dynamics of cell biology, taking in to account the heterogeneity of the population and the cell-cell variability. Mesoscopic information is as important as microscopic information. Although the latter gains access to sub-cellular functions, it is the former that leads to high-throughput, label-free measurements. By focussing on simplicity, cost, feasibility, field of view, and time-lapse in-incubator imaging, we developed ‘Lensfree Video Microscope' based on digital in-line holography that is capable of providing a new perspective to cell culture monitoring by being able to capture the kinetics of thousands of cells simultaneously. In this thesis, we present our lensfree video microscope and its applications in in-vitro cell culture monitoring and quantification.We validated the system by performing more than 20,000 hours of real-time imaging, in diverse conditions (e.g.: 37°C, 4°C, 0% O2, etc.) observing varied cell types and culture conditions (e.g.: primary cells, human stem cells, fibroblasts, endothelial cells, epithelial cells, 2D/3D cell culture, etc.). This permitted us to develop label-free cell based assays to study the major cellular events – cell adhesion and spreading, cell division, cell division orientation, cell migration, cell differentiation, network formation, and cell death. The results that we obtained respect the heterogeneity of the population, cell to cell variability (a raising concern in the biological community) and the massiveness of the population, whilst adhering to the standard cell culture practices - a rare combination that is seldom attained by existing real-time monitoring methods.We believe that our microscope and associated metrics would complement existing techniques by bridging the gap between mesoscopic and microscopic information. / Biological studies always start from curious observations. This is exemplified by description of cells for the first time by Robert Hooke in 1665, observed using his microscope. Since then the field of microscopy and cell biology grew hand in hand, with one field pushing the growth of the other and vice-versa. From basic description of cells in 1665, with parallel advancements in microscopy, we have travelled a long way to understand sub-cellular processes and molecular mechanisms. With each day, our understanding of cells increases and several questions are being posed and answered. Several high-resolution microscopic techniques are being introduced (PALM, STED, STORM, etc.) that push the resolution limit to few tens of nm, taking us to a new era where ‘seeing is believing'. Having said this, it is to be noted that the world of cells is vast, with information spread from nanometers to millimetres, and also over extended time-period, implying that not just one microscopic technique could acquire all the available information. The knowledge in the field of cell biology comes from a combination of imaging and quantifying techniques that complement one another.Majority of modern-day microscopic techniques focuses on increasing resolution which, is achieved at the expense of cost, compactness, simplicity, and field of view. The substantial decrease in the field of observation limits the visibility to a few single cells at best. Therefore, despite our ability to peer through the cells using increasingly powerful optical instruments, fundamental biology questions remain unanswered at mesoscopic scales. A global view of cell population with significant statistics both in terms of space and time is necessary to understand the dynamics of cell biology, taking in to account the heterogeneity of the population and the cell-cell variability. Mesoscopic information is as important as microscopic information. Although the latter gains access to sub-cellular functions, it is the former that leads to high-throughput, label-free measurements. By focussing on simplicity, cost, feasibility, field of view, and time-lapse in-incubator imaging, we developed ‘Lensfree Video Microscope' based on digital in-line holography that is capable of providing a new perspective to cell culture monitoring by being able to capture the kinetics of thousands of cells simultaneously. In this thesis, we present our lensfree video microscope and its applications in in-vitro cell culture monitoring and quantification.We validated the system by performing more than 20,000 hours of real-time imaging, in diverse conditions (e.g.: 37°C, 4°C, 0% O2, etc.) observing varied cell types and culture conditions (e.g.: primary cells, human stem cells, fibroblasts, endothelial cells, epithelial cells, 2D/3D cell culture, etc.). This permitted us to develop label-free cell based assays to study the major cellular events – cell adhesion and spreading, cell division, cell division orientation, cell migration, cell differentiation, network formation, and cell death. The results that we obtained respect the heterogeneity of the population, cell to cell variability (a raising concern in the biological community) and the massiveness of the population, whilst adhering to the standard cell culture practices - a rare combination that is seldom attained by existing real-time monitoring methods.We believe that our microscope and associated metrics would complement existing techniques by bridging the gap between mesoscopic and microscopic information.

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La famille des facteurs de transcription lkaros, est composée des protéines lkaros, Helios, Aiolos et Eos. Elles sont exprimées pendant le développement et régulent la différenciation des lymphocytes B et T. Ces protéines présentent une forte homologie de leurs séquences nucléiques et protéiques et sont toutes impliquées dans l'apparition de leucémies lymphoblastiques T ou B. Ces facteurs présentent toutefois de très fortes divergences dans leurs profils d'expression, leurs fonctions et leurs gènes cibles. Ce travail à partir d'une lignée cellulaire T immature déficiente pour lkaros à permis d'étudier les différences fonctionnelles et moléculaires des membres de la famille. La réexpression d'lkaros, d'Aiolos et d'Helios permet la différenciation et la diminution de la prolifération de ces cellules. Cette expérience a montré que les différents membres de la famille avaient des capacités distinctes pour activer ou réprimer certains gènes cibles. Un échange des séquences des domaines de liaison à l'ADN de Aiolos et d'lkaros, a permis de montrer que la spécificité fonctionnelle est en partie déterminée par le domaine de liaison à l'ADN, mais aussi par les autres régions d'lkaros et d'Aiolos. / The lkaros transcription factor family is made of the proteins lkaros, Helios, Aiolos and Eos. They are expressed during the development and regulate the differentiation of lymphocytes B and T. These proteins present a strong homology between their nucleic and protein sequences and are involved the appearance of T or B lymphoblastic leukaemia. However these factors present strong differences in their profiles of expression, their functions and their target genes. An immature T cell line, deficient for lkaros, allows us to study the functional and molecular differences of members of the family. There-expression of lkaros, Aiolos and Helios allows the differentiation and the decrease of the proliferation of these cells. I also showed that the various members of the family had different capacities to activate or repress certain target genes. An exchange of the protein sequences coding for the DNA binding domain (DBD), shows that the functional specificity is partially determined by the DBD domain, but also by the other regions of lkaros and Aiolos.

La niche des cellules souches hématopoïétiques représente un compartiment complexe et radiosensible. Sa protection est nécessaire pour la restauration de l'hématopoïèse faisant suite à la myélosuppression due à l'exposition aux rayonnements ionisants. Nous avons dans un premier temps étudié l'effet des RI sur les progéniteurs endothéliaux et mésenchymateux de la niche par une étude de radiosensiblilité et une étude d'évaluation de la mort cellulaire. Nous avons proposé par la suite une stratégie innovante de thérapie génique basée sur la sécrétion locale et à court terme du morphogène Sonic hedgehog visant à favoriser la réparation de niche vasculaire et de stimuler les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices résiduelles. Nous avons étudié la réponse hématopoïétique des singes irradiés à 8-Gy gamma après une seule injection intra-osseuse de cellules souches mésenchymateuses xénogéniques, multipotentes et d'origine adipocytaire transfectées avec un plasmide pIRES2-eGFP codant la protéine Shh. La durée de thrombocytopénie et celle de neutropénie ont été significativement réduites chez les animaux greffés et les clonogènes sont normalisés à partir du 42e jour. Les aires sous la courbe des numération des plaquettes et des neutrophiles entre 0 et 30 jours ont été significativement plus élevée chez les animaux traités que chez les témoins. La greffe d'explants de MatrigelTM colonisés ou non avec des ASC chez des souris immunodéprimées a démontré une activité pro-angiogénique notable des ASC transfectées avec le plasmide Shh . Le suivi à long terme (180 à 300 jours) a confirmé une reconstitution durable dans les quatre singes greffés. Globalement cette étude suggère que la greffe de cellules souches multipotentes Shh-peut représenter une nouvelle stratégie pour la prise en charge des dommages radio-induits de la niche.