La fibroïne de soie extraite des fibres de cocons de vers à soie Bombyx mori a été utilisée dans une vaste gamme d'applications telles que la culture cellulaire, la régénération de tissus osseux et la libération contrôlée de molécules actives. Le choix de cette protéine fibreuse pour la conception de biomatériaux voués à l'ingénierie tissulaire est motivé par leurs impressionnantes propriétés mécaniques, leur biocompatibilité et leur biodégradabilité. Le but du projet de recherche principal présenté dans ce mémoire était de préparer des matériaux poreux à base de fibroïne de soie séricicole pour créer une matrice 3D utilisable comme support pour culture cellulaire in vitro. Dans cette optique, l'impact de l'addition de NaCl (0-250 mM) dans les solutions de fibroïne avant la congélation ainsi que l'effet de la température de congélation (-22°C ou -73°C) ont été étudiés lors de la préparation de matrices 3D lyophilisées. Les matériaux ont ensuite été traités au méthanol pour induire leur insolubilité, puis immergés dans l'eau pour extraire le sel. Tel qu'observé par microscopie électronique à balayage (MEB), la morphologie des matrices préparées à -22°C est constituée d'un réseau poreux interconnecté devenant moins serré avec l'ajout de sel. Les biomatériaux préparés à -73°C possèdent plutôt une structure en feuillets orientés sur lesquels des filaments et micropores sont apparus lors de l'addition de sel. Aux deux températures de congélation, les matrices ont affiché un ratio de gonflement plus élevé et une résistance à la compression plus faible lors de leur préparation en présence de sel. Les différences morphologiques des matrices ont été corrélées avec les variations dans les processus de nucléation et de croissance des cristaux de glace lors de la congélation. L'étude des matériaux par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et diffraction des rayons X (XRD) a révélé un changement dans la structure secondaire de la fibroïne, passant d'un mélange d'hélices a et pelotes statistiques dynamiques, vers une structure majoritairement en feuillets β induite par le traitement au méthanol. Aucune différence n'a cependant été observée en fonction de l'ajout de sel ou de la variation de la température de congélation. La microscopie confocale à balayage laser a permis de constater que des cellules ensemencées dans les matrices demeuraient viables et avaient pénétré la majorité des biomatériaux pour s'organiser en agrégats après 24 h de culture. Cette étude permet de conclure qu'il est possible d'adapter la morphologie de matrices 3D lyophilisées pour une utilisation comme support pour culture cellulaire. Aussi, un second projet de recherche présenté dans ce mémoire aura permis d'évaluer le potentiel d'utilisation d'un isolat de protéines de soja mélangé à l'amidon riche en amylose (ARA) pour la production d'un excipient pharmaceutique visant la libération de molécules actives par voie orale. Les résultats de libération de la 8-hydroxyquinoline (HQN) comme traceur ont montré que l'ajout d'ARA gélatinisé n'améliore pas le comportement de l'isolat de protéines de soja Pro, cependant l'ajout de Pro semble plutôt améliorer les propriétés de l'ARA gélatinisé comme excipient. La Pro ajoutée aux formulations d'ARA a apparemment favorisé la cohésion des particules en milieux digestifs simulés, présentant un potentiel d'additif liant dans les formulations. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : fibroïne de soie, matrices 3D, culture cellulaire, lyophilisation, cristaux de glace, chlorure de sodium, température de congélation, isolat de protéines de soja, amidon

La thèse intitulée Structures de biopolymères pour la reconstruction de tissus biologiques, structurée en 4 chapitres, présente la possibilité d'obtenir des structures biopolymériques qui peuvent être utilisées dans la reconstruction des tissus, notamment dans la reconstruction des tissus osseux. Les objectifs spécifiques suivants ont été définis et suivis dans les chapitres 2, 3 et 4: 1) L'obtention de structures basées sur le PHA et des fibres naturelles, pour leur utilisation médicale - films, fibres, structures compactes et/ou poreuses, 2) Modification physique ou chimique des structures obtenues pour améliorer leur biocompatibilité, 3) Caractérisation biologique in vitro et in vivo des matériaux; 4) Etude de l'influence des métaux sur la minéralisation du tissu osseux. Le Chapitre I résume les biomatériaux utilisés en génie tissulaire basé sur la littérature. Le Chapitre II présente les différentes structures biopolymériques étudiées: films, microparticules, fibres, tubes et structures microporeuses et l'évaluation des propriétés physiques, chimiques et mécaniques des PHA et fibres naturelles et une étude sur la porosité en utilisant le microCT. Le chapitre III traite de l'influence de la porosité sur l'adhésion cellulaire des films de PHA, une étude in vitro et le comportement in vivo des fibres de PHBV. La dernière partie inclut une étude sur la modification des fibres de fibroïne et de cellulose, pour améliorer leur minéralisation. Le chapitre IV traite l'influence de l'aluminium sur la minéralisation osseuse. Cette étude a été motivée par les conclusions alarmantes des effets nocifs de l'aluminium sur la minéralisation osseuse. La dernière section contient des observations finales et des perspectives.

La soie est un biopolymère synthétisé par certains arthropodes. Cette fibre est constituée de protéines arrangées en une microstructure semi-cristalline et possède d'intéressantes propriétés mécaniques. L'axe principal de ce travail de thèse concerne la compréhension du processus de formation de la fibre de soie. La soie de Bombyx mori a été choisi comme modèle. Sa protéine, nommée Fibroïne, a été utilisée pour produire une fibre dans une cellule microfluidique construite pour mimer l'appareil de filage du ver à soie. Le processus de formation de la soie a été suivi par des techniques de diffusion des rayons X (SAXS et WAXS) et par spectroscopie Raman. Elle débute par une étape d'agrégation. La taille des agrégats est de l'ordre de 100 nm. Dans ces particules, la Fibroïne est sous une forme compactée. Cette agrégation est suivie d'une phase de compaction des agrégats. Plus tard, à une échelle de temps de quelques heures, la Fibroïne subit une transition conformationnelle depuis une structure principalement amorphe (Silk I) vers la structure caractéristique de la soie naturelle (Silk II). Ce processus est proposé comme un modèle de la formation de la fibre de soie in vivo. Le second axe de ce travail est orienté vers la connaissance des propriétés physiques de la soie naturelle de B. mori. Sa résistance aux hautes températures est étudiée d'un point de vue structural, moléculaire et mécanique. L'effet des hautes pressions sur la structure de la fibre de soie est aussi présentée.

Une lésion au niveau d’un nerf périphérique peut provoquer la perte de fonction sensorielle et motrice, et dans le cas de neurotmésis, la régénération spontanée ne se produira pas. De plus, si l’espace entre les deux segments de nerf est trop important, une suture directe n’est pas possible et l’implantation d’une greffe est nécessaire afin de créer une liaison entre les deux segments de nerf. L’autogreffe de nerf est le « gold standard » pour des procédés de réparation nerveuse : une portion d’un nerf sein (qui est considéré comme un nerf moins important) est prise du même patient et implantée au site de la lésion. Cependant, il existe plusieurs désavantages avec ce procédé comme une deuxième chirurgie, la perte de fonction au site du don, la possibilité de développer un neurome sur ce même site, ainsi qu’un taux de réussite de 50% dans les cas où l’espace entre les deux segments de nerf est très important. Il reste donc, un besoin de trouver un procédé alternatif afin d’augmenter le taux de réussite et d’éliminer les désavantages de l’autogreffe. L’objectif de cette étude est d’avancer vers une solution alternative de l’autogreffon en utilisant des biomatériaux. Cette thèse se divise en trois parties. La première se focalise sur le développement d’un modèle de guide nerveux basé sur des nanofibres de fibroïne de soie. Ce matériau est composé d’une organisation complexe qui inclut deux surfaces de nanofibres alignées avec une couche de nanofibres aléatoires à l’intérieur afin d’améliorer des propriétés mécaniques du matériau sans la perte d’orientation des fibres pour la régénération nerveuse. Le matériau est ensuite manipulé pour fabriquer un tube, multi-canaux avec une « enveloppe » supplémentaire afin de faciliter le procédé d’implantation chirurgicale. Ce guide nerveux a été soumis pour l’obtention d’un brevet européen le 12 juillet 2017 et cela est le sujet d’un deuxième article qui a été soumis pour publication. La deuxième partie de cette étude explore des possibilités d’une fonctionnalisation du matériau afin d’améliorer son efficacité pour la régénération nerveuse. Cette étude explore la fonctionnalisation de la fibroïne de soie avec une deuxième protéine, plusieurs facteurs de croissance, et des nanoparticules. Chacune de ces fonctionnalisations donne une possibilité d’ajouter des propriétés favorables à la fibroïne de soie, un matériau naturel et biocompatible. La troisième partie de cette étude examine l’efficacité d’un guide nerveux composé de la fibroïne de soie fonctionnalisée avec des facteurs de croissance pour la régénération nerveuse périphérique en comparaison avec un guide nerveux composé de la fibroïne de soie sans aucune fonctionnalisation et une suture direct (qui simule une autogreffe). Trois techniques d’évaluation différentes de la régénération nerveuse ont été réalisées afin d’obtenir une analyse plus complète. Il y a de nombreux mécanismes impliqués dans la régénération nerveuse, il est donc nécessaire d’étudier différents paramètres pour analyser l’efficacité de régénération. Les résultats d’analyses histologiques, d’électromyographie, et de capture de mouvement, ont été considérées ensemble afin d’arriver à une conclusion sur la réussite d’une régénération nerveuse pendant cette étude. Pour conclure cette étude, les guides nerveux fonctionnalisés avec une combinaison de facteurs de croissance démontrent une meilleure régénération nerveuse et une récupération de fonction supérieure. / Injury to a peripheral nerve can cause loss of sensory and motor function, and if the injury is very severe where the nerve undergoes neurotmesis, unassisted nerve regeneration may not occur. In this case, where the gap between nerve segments is too large to carry out a direct end to end suture, a graft is sutured to bridge the gap between sectioned nerve segments. The autologous nerve graft, where a portion of a less important nerve from the same patient is removed and grafted between nerve segments, continues to be the gold standard procedure for nerve repair. However, there are several drawbacks of this technique including a second surgical procedure, loss of function at the donor site, possibility of developing a painful neuroma at the donor site, and the 50% success rate of autografts used in large gaps. There is therefore a need for a tissue engineered nerve graft that can replace the autograft, and this study aims to advance toward an effective autograft alternative. This PhD is presented as a three part study consisting first of the development of a novel nerve guidance conduit based on a tri-layered silk fibroin nanofiber material comprised of a complex organization including two aligned fiber surfaces and a randomly deposited fiber interior to improve the mechanical properties of the material while not compromising the guidance capabilities of aligned nanofibers for nerve regeneration. The material is then used to fabricate a multi-channeled tube with an additional “jacket layer” in order to facilitate surgical implantation. This NGC has been submitted to be patented on July 12, 2017 and is the subject of the second article submitted for review for publication. The second part of this study explores the different possibilities of the functionalization of the material in order to improve the effectiveness for nerve regeneration. This study explores functionalizing the silk fibroin with a second protein, several growth factors, and nanoparticles that all have potential to add favorable properties to the natural biocompatible silk fibroin material. The final part of this study tests the effectiveness of growth factor-embedded silk fibroin NGCs for peripheral nerve regeneration in comparison with non-functionalized silk fibroin devices and a direct suture to simulate results obtained with an autograft. Three different techniques for the evaluation of nerve regeneration were used in order to produce a more comprehensive analysis. As there are many mechanisms involved in nerve regeneration, only one or two analysis techniques cannot paint a complete picture of the success of nerve regeneration. Therefore, histological analyses, electromyography analyses, and motion capture analyses were carried out and considered together in order to make a conclusion on the level of nerve regeneration success during this study. The conclusions from this study were that a NGC functionalized with a combination of growth factors appeared to exhibit the most successful nerve regeneration and functional recovery.