La fibroïne de soie extraite des fibres de cocons de vers à soie Bombyx mori a été utilisée dans une vaste gamme d'applications telles que la culture cellulaire, la régénération de tissus osseux et la libération contrôlée de molécules actives. Le choix de cette protéine fibreuse pour la conception de biomatériaux voués à l'ingénierie tissulaire est motivé par leurs impressionnantes propriétés mécaniques, leur biocompatibilité et leur biodégradabilité. Le but du projet de recherche principal présenté dans ce mémoire était de préparer des matériaux poreux à base de fibroïne de soie séricicole pour créer une matrice 3D utilisable comme support pour culture cellulaire in vitro. Dans cette optique, l'impact de l'addition de NaCl (0-250 mM) dans les solutions de fibroïne avant la congélation ainsi que l'effet de la température de congélation (-22°C ou -73°C) ont été étudiés lors de la préparation de matrices 3D lyophilisées. Les matériaux ont ensuite été traités au méthanol pour induire leur insolubilité, puis immergés dans l'eau pour extraire le sel. Tel qu'observé par microscopie électronique à balayage (MEB), la morphologie des matrices préparées à -22°C est constituée d'un réseau poreux interconnecté devenant moins serré avec l'ajout de sel. Les biomatériaux préparés à -73°C possèdent plutôt une structure en feuillets orientés sur lesquels des filaments et micropores sont apparus lors de l'addition de sel. Aux deux températures de congélation, les matrices ont affiché un ratio de gonflement plus élevé et une résistance à la compression plus faible lors de leur préparation en présence de sel. Les différences morphologiques des matrices ont été corrélées avec les variations dans les processus de nucléation et de croissance des cristaux de glace lors de la congélation. L'étude des matériaux par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et diffraction des rayons X (XRD) a révélé un changement dans la structure secondaire de la fibroïne, passant d'un mélange d'hélices a et pelotes statistiques dynamiques, vers une structure majoritairement en feuillets β induite par le traitement au méthanol. Aucune différence n'a cependant été observée en fonction de l'ajout de sel ou de la variation de la température de congélation. La microscopie confocale à balayage laser a permis de constater que des cellules ensemencées dans les matrices demeuraient viables et avaient pénétré la majorité des biomatériaux pour s'organiser en agrégats après 24 h de culture. Cette étude permet de conclure qu'il est possible d'adapter la morphologie de matrices 3D lyophilisées pour une utilisation comme support pour culture cellulaire. Aussi, un second projet de recherche présenté dans ce mémoire aura permis d'évaluer le potentiel d'utilisation d'un isolat de protéines de soja mélangé à l'amidon riche en amylose (ARA) pour la production d'un excipient pharmaceutique visant la libération de molécules actives par voie orale. Les résultats de libération de la 8-hydroxyquinoline (HQN) comme traceur ont montré que l'ajout d'ARA gélatinisé n'améliore pas le comportement de l'isolat de protéines de soja Pro, cependant l'ajout de Pro semble plutôt améliorer les propriétés de l'ARA gélatinisé comme excipient. La Pro ajoutée aux formulations d'ARA a apparemment favorisé la cohésion des particules en milieux digestifs simulés, présentant un potentiel d'additif liant dans les formulations. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : fibroïne de soie, matrices 3D, culture cellulaire, lyophilisation, cristaux de glace, chlorure de sodium, température de congélation, isolat de protéines de soja, amidon

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Dans le cas d'une tumeur pancréatique, la chirurgie d'exérèse est le traitement de première intention lorsqu'elle est possible. Les pancréatectomies sont des actes à haut risque, entraînant un taux de morbidité de 50%. L'une des complications les plus graves est l'apparition de fistules pancréatiques (FP) qui surviennent dans 15 à 20 % des cas, pour lesquelles il n'existe aucune solution de prévention. Cette thèse porte sur l'élaboration d'un biomatériau pour la prévention des FP. Le cahier des charges, défini avec l'équipe chirurgicale, nous a orienté vers un dispositif médical sous forme de pansement absorbant, présentant des propriétés mécaniques adaptées, ainsi qu'une résistance aux enzymes pancréatiques serait intéressant. Un biomatériau constitué de deux couches a été imaginé : 1) une matrice absorbante constituée d'un complexe polyélectrolyte (PEC) sous forme de film, 2) une couche supérieure imperméable permettant de limiter la diffusion des enzymes pancréatiques dans le milieu péritonéal ; afin de répondre aux spécifications demandées par l'équipe médicale. La première partie de ce travail a porté sur l'optimisation de la mise en forme de la matrice sous forme de film à partir de PEC d'alginate (ALG) et de chitosane (CHI) présentant différents ratio de polymères (ALG-CHI 50/50 et ALG-CHI 63/37). L'influence de la technique d'homogénéisation des PEC, sous ultra-turrax (UT) ou au Stephan (ST) a été étudiée sur les propriétés physico-chimiques des films obtenus. Les propriétés de biodégradation, de gonflement et de cytotoxicité sont principalement influencées par le ratio des polymères. En revanche, leurs structure et propriétés mécaniques sont essentiellement influencées par la technique d'homogénéisation utilisée lors de l'élaboration du PEC. Au vu de ces résultats, le choix de la matrice au contact de l'anastomose ou de la tranche pancréatique s'est arrêté sur le PEC ALG-CHI 63/37 UT. La deuxième partie de cette thèse a été consacrée à l'incorporation d'une couche imperméable à la surface supérieure du film. Deux polymères ont été testés : l'acide polylactique (PLA) et le polycaprolactone (PCL). Ils ont été incorporés après fonctionnalisation de la surface du film. La matrice ALG-CHI 63/37 UT recouverte de PLA présente une surface plus hydrophobe, des propriétés mécaniques adaptées, une bonne résistance aux enzymes pancréatiques tout en possédant des propriétés de gonflement intéressantes. Le biomatériau ainsi obtenu est un bon candidat qui répond au cahier des charges d'un pansement indiqué pour la prévention des fistules pancréatiques. / Resection surgery is the first-line treatment indicated for pancreatic tumor. The morbidity of this surgery is high with a complication rate around 50%. One of the most serious complications is the occurrence of pancreatic fistula (PF), which occurs in 15-20% of cases. To date, no biomaterial available on the market is indicated for the prevention of the onset of PF following pancreatectomy. This project focuses on the development of a biomaterial for the prevention of PF. Specifications identified by the surgical team oriented us to ward an absorbent dressing with sufficient mechanical properties and pancreatic enzymes resistance. A biomaterial made up of two layers was designed: 1) an absorbent matrix, in the form of a film, constituted by a polyelectrolyte complex (PEC), 2) an impermeable backing layer expected to limit the diffusion of the pancreatic enzymes into the peritoneal medium; to meet surgeons' specifications. The first part of this work focused on the optimization of the preparation of the matrix, composed of alginate (ALG) and chitosan (CHI) PECs films with different polymer ratios (ALG-CHI 50/50and ALG-CHI 63/37). The influence of the technique of homogenization of PEC, ultra-turrax (UT) or Stephan (ST) was studied on the physicochemical properties of the films. Biodegradation, swelling and cytotoxicity were shown to be mainly influenced by the ratio of polymers used. On the other hand, structure and mechanical properties are mainly influenced by the homogenization technique. With these results, the choice of the matrix to pancreatic application was set as the PEC ALG-CHI 63/37 UT. The second part of the present work was devoted to the incorporation of an impermeable backing layer on the upper film surface. Two polymers were evaluated: polylactic acid (PLA) and polycaprolactone (PCL). They were incorporated after the functionalization of the film surface. The PLA-coated ALG-CHI 63/37 UT matrix led to more hydrophobic surfaces, as well as adaptated mechanical properties and resistance to pancreatic enzymes with interesting swelling properties. The obtained biomaterial is a promising candidate responding to the specifications for a dressing indicated for the prevention of PF.

Ce travail porte sur l'alliage Ti45Zr38Ni17 qui a la particularité de former des structures amorphes et quasicristallines (QC) par refroidissement rapide. Reconnus pour leur excellente résistance à l'usure et leur dureté, ces matériaux sont des candidats potentiels pour améliorer les propriétés tribologiques des implants métalliques. Toutefois, la caractérisation des structures non périodiques au regard des critères de la biocompatibilité n'a, à ce jour, jamais été effectuée. La première étape a consisté en l'élaboration des phases amorphes et quasicristallines par hypertrempe sur roue. La caractérisation microstructurale des alliages Ti45Zr38Ni17 a mis en évidence la possibilité de contrôler la nature des phases présentes en fonction des conditions de trempe, depuis une structure amorphe avec dispersion de précipités nanométriques cubiques centrés β jusqu'à une structure mixte β/QC. D'après les analyses thermiques, la dévitrification de la matrice est associée à la précipitation de quasicristaux et les précipités β évoluent de la même façon qu'un matériau β-métastable massif, avec formation de sous-domaines omega isotherme. Les QCs obtenus par traitement thermique développent certaines relations d'orientation avec les particules β/omegaiso. A la surface des alliages, quelle que soit la structure sous-jacente, la couche d'oxyde est essentiellement constituée de TiO2 et ZrO2, Ni étant ségrégé dans la sous-couche métallique. Les ostéoblastes adoptent le même comportement quelle que soit la microstructure. Le développement cellulaire suit un processus classique d'adhésion, prolifération et différenciation, mettant ainsi en évidence la biocompatibilité de Ti45Zr38Ni17 à moyen terme.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

La biocompatibilité d'un implant est principalement contrôlée par l'interface entre le biomatériau et le tissu environnant. Afin de contrôler cette interaction et de favoriser l'adhésion des cellules sur l'implant, nous avons créé à la surface d'alliages de titane des domaines nanométriques concentrés en séquence Arginine-Glycine-Acide Aspartique (RGD) reconnue pour ses propriétés adhésives. Après avoir modifié la chimie de surface par un agent de liaison aminosilane, nous avons utilisé les méthodes de synthèse de dendrimères ou liés des nanoparticules à l'aminosilane afin de démultiplier le nombre de amines primaires par site. Ces amines primaires étant ensuite utilisées pour attacher la séquence RGD à la surface du matériau. L'adhésion d'ostéoblastes sur les matériaux préparés a été étudié par acoustique picoseconde. / Abstract

Nous avons imaginé et développé une méthode pour la préparation d’hydrogels par procédé sol-gel à partir de blocs hybrides (bio)organiques-inorganiques. Les blocs hybrides sont obtenus par introduction de groupements silylés, triéthoxysilanes ou hydroxydiméthylsilanes, sur des polymères synthétiques ou des molécules d’intérêt biologique telles que des peptides. Ces blocs hybrides peuvent être combinés dans des proportions choisies pour former des hydrogels multifonctionnels. Le procédé de gélification se déroule à 37°C à pH 7.4 dans un tampon physiologique. L’hydrolyse et la condensation des précurseurs silylés conduit à la formation d’un réseau tridimensionnel covalent dans lequel les entités organiques sont reliées par des liaisons siloxanes. Dans un premier temps, cette méthode a été appliquée à la synthèse d’hydrogels à base de PEG. Nous avons ensuite montré que ces hydrogels pouvaient être fonctionnalisés de façon covalente par des entités bioactives au cours de leur préparation. Des hydrogels possédant des propriétés antibactériennes ou favorisant l’adhésion cellulaire ont ainsi été préparés. Dans un deuxième temps, un peptide hybride inspiré du collagène naturel a été synthétisé et a permis l’obtention d’hydrogels qui présentent des propriétés de prolifération cellulaire similaires à celles observées sur des substrats de collagène naturel. La biocompatibilité du procédé sol-gel a été démontrée par l’encapsulation de cellules souches dans l’hydrogel au cours de sa formation. Enfin, l’impression 3D d’hydrogels hybrides a été réalisée. Ce travail de thèse met donc en lumière le potentiel de la chimie sol-gel pour la conception à façon de matériaux biomimétiques particulièrement prometteurs pour des applications en ingénierie tissulaire. / We designed and developed a method for the preparation of hydrogels through the sol-gel process. It is based on (bio)organic-inorganic hybrid blocks obtained by functionalization of synthetic polymers or bioactive molecules, such as peptides, with silyl groups (triethoxysilanes or hydroxydimethylsilanes). These hybrid blocks can be combined in desired ratio and engaged in the sol-gel process to yield multifunctional hydrogels. Gelation proceeds at 37°C at pH 7.4 in a physiological buffer. Hydrolysis and condensation of silylated precursors result in a three-dimensional covalent network in which molecules are linked through siloxane bonds. First, this method was applied to the synthesis of PEG-based hydrogels. Then, we demonstrated that hydrogels could be covalently functionalized during their formation. Thus, hydrogels exhibiting antibacterial properties or promoting cell adhesion were obtained. Secondly, a hybrid peptide whose sequence was inspired from natural collagen was synthesized and used to prepare hydrogels that provided a cell-friendly environment comparable to natural collagen substrates. Stem cells could be encapsulated in these hydrogels with high viability. Finally, hybrid hydrogels were used as bio-inks to print 3D scaffolds. This PhD work highlights the potential of the sol-gel chemistry for the design of tailor-made biomimetic scaffolds that could be particularly promising for tissue engineering applications.

Les prothèses diaphragmatiques en ePTFE utilisées dans la hernie diaphragmatique congénitale à large défect ont une faible étirabilité, ce qui entrainera des récidives herniaires au cours de la croissance de l’enfant. En effet, l’analyse en imagerie montre que la surface du diaphragme grandit de 4-5 fois jusqu’à l’adolescence. De plus, les mesures de rigidité des surfaces de prothèses explantés, montrent l’influence des contraintes mécaniques appliquées sur la structure des matrices extracellulaires néoformées. Afin de favoriser l’intégration tissulaire du ePTFE, nous avons testé un moyen de fonctionnaliser le ePTFE avec la polydopamine sur une seule face. Le revêtement nanoscopique favorise la colonisation cellulaire. Enfin, ce travail de thèse présente une méthode originale de réalisation d’une nouvelle membrane bicouche avec des propriétés mécaniques conformes aux exigences chirurgicales. Ce biomatériau innovant et prometteur fait actuellement l’objet d’une Déclaration d’invention. / Electron microscopy assessments of ePTFE prosthesis explants for diaphragmatic congenital hernia repair strongly suggest that the tissue responses are directly related to the surface microstructure of the biomaterial. AFM measurements (Young moduli) emphasize the influence of the mechanical stress applied to the implant on the mechanical properties of the newly formed extracellular matrices. In order to guide the host responses, we undertook to functionalize with polydopamine the ePTFE biomaterial. Electron microscopy investigations reveal the interest of that surface treatment regarding cell colonization of implant. To optimize that approach, we developed an original method aimed to coat only one face of the biomaterial. After determination of the growth rate of the diaphragm from birth to adolescence, we explored the possibility to design a new double-faced mesh able to follow body growth. From this point of view, the initial prototypes are promising and under patent application.

Les biomatériaux interviennent dans de nombreuses applications médicales. La connaissance de leur évolution une fois implantés dans l’organisme est primordiale pour les améliorer et en créer de nouveaux. Dans cette optique, nous avons réalisé une modélisation à deux dimensions de la transformation d’un biomatériau en os. Pour cette modélisation, nous utilisons la théorie de la percolation. Celle-ci traite de la transmission d’information à travers un milieu où sont distribués un très grand nombre de sites pouvant localement relayer cette information. Nous présentons un modèle de double percolation sites-liens, pour prendre en compte d’une part la vascularisation (et/ou résorption) du biomatériau de l’implant dans un os, et d’autre part sa continuité mécanique. Nous identifions les paramètres pertinents pour d´écrire l’implant et son évolution, qu’ils soient d’origine biologique, chimique ou physique. Les différents phénomènes sont classés suivant deux régimes, percolant ou non-percolant, qui rendent compte des phases avant et après vascularisation de l’implant. Nous avons testé notre simulation en reproduisant les données expérimentales obtenues pour des implants de corail. Nous avons réalisé une étude des différents paramètres de notre modèle, pour déterminer l’influence de ceux-ci sur chaque phase du processus. Cette simulation est aussi adaptable à différents systèmes d’implants. Nous montrons la faisabilité d’une modélisation à trois dimensions en transposant la partie statique de notre simulation. / Biomaterials play an important role in many medical applications. To know how they evolve once inserted in the human body is essential to improve them and to create new ones. For this purpose, we have elaborated a two dimensional model for the transformation of biomaterial into bone. For this model, we have used the percolation theory. This general theory accounts for the transmision of information across an environment in wich a huge number of sites relay localy this piece of information. We present a double site-bond percolation model to account, on the one hand, for the vascularization (and/or resorption) of biomaterial implant in bones and, on the other hand, for its mechanical continuity. We identify the relevant parameters to describe the implant and its evolution, and separate their biological or chimical origin from their physical one. We classify the various phenomena in two regimes, percolating or non-percolating, which concern the two stages before and after the vascularization of the implant. We have tested our simulation by comparing them with experimental results obtained withcoral implants. We have studied how the various parameters of our model can influence each stage of the process. This simulation can also be applied to different types of implants. We show that a three dimensional model is possible by transposing the static part of our simulation.

Le muscle strié squelettique possède de grandes capacités de régénération grâce à ses cellules souches, les cellules satellites. Après une lésion, le processus de régénération musculaire qui se met en place est finement régulé dans le temps et l’espace par le microenvironnement, constitué de cellules avoisinantes mais également par des éléments de la matrice extracellulaire (MEC). Cette dernière se compose de molécules structurales comme les collagènes et de composants possédant un rôle trophique comme les glycosaminoglycanes (GAGs). La MEC musculaire est peu étudiée à cause d’une organisation tridimensionnelle complexe rendant son exploration difficile. Lors d’une lésion avec perte de substance musculaire, la régénération est altérée, associée à une fibrose et une inflammation chronique. Ce type de lésion est fréquemment rencontré en traumatologie mais survient également chez le blessé de guerre. Malgré un traitement optimal, une invalidité fonctionnelle persiste chez ces patients. L’utilisation d’un biomatériau décellularisé, constitué de MEC pourrait fournir ce support physique et trophique faisant défaut dans ce type de lésion. Dans ce travail, nous avons entrepris l'établissement d'une MEC d’origine musculaire et nous avons établi un protocole de décellularisation permettant d’obtenir un biomatériau conservant l’architecture spécifique de la MEC musculaire avec une élimination de la majorité des antigènes cellulaires afin d'éviter une réponse immunitaire délétère après implantation. Néanmoins, le protocole retenu ne permet de conserver certaines molécules trophiques d’intérêt comme les GAGs. Les « ReGeneRaTing Agent®» (RGTA®) sont des mimétiques fonctionnels de ces GAGs, utilisés en clinique pour améliorer la cicatrisation cutanée et cornéenne. Ces mimétiques conservent une capacité de liaison aux facteurs de croissance avec une résistance aux dégradations enzymatiques. Nous avons évalué l’utilisation de ces molécules au cours de la réparation musculaire, dans un modèle in vivo chez le rongeur. Nous avons réalisé une analyse histologique précoce (8e jour de régénération) mettant en évidence une augmentation du nombre de noyaux par myofibre en faveur d’une augmentation de la fusion, validée également in vitro sur des progéniteurs musculaires. Nous avons également observé une augmentation du nombre de vaisseaux, suggérant une amélioration de l’angiogenèse. Le nombre de gouttelettes lipidiques, marqueur d’une mauvaise régénération, était en diminution. L’exploration histologique plus tardive (28e jour de régénération) n’a retrouvé que l’augmentation du nombre de vaisseaux en faveur d’un effet durable sur l’angiogenèse. Ces RGTA® peuvent être couplés aux biomatériaux et sont particulièrement résistants dans un environnement inflammatoire pouvant être rencontré dans les lésions avec perte de substance musculaire. Des chimiokines et des facteurs de croissance pourront également être ajoutés au biomatériau matriciel afin de favoriser la migration des différents progéniteurs nécessaires à une néoformation musculaire. L’efficacité thérapeutique de ces biomatériaux optimisés nécessitera d’être évaluée dans un modèle in vivo de perte de substance / Skeletal muscle exhibits high capacity for regeneration after an injury that relies on resident stem cells. Muscle regeneration is tightly regulated by both the immune response and other resident cells, as well as by cues from the local extracellular matrix (ECM), contributing to a coordinated repair process. Muscle ECM is a network of structural macromolecules with a large majority of collagens and trophic molecules such as glycosaminoglycans (GAGs). In the skeletal muscle tissue, ECM was overlooked due to its complex organization making investigations difficult. Muscle regenerative ability can be overtaken in large muscle wasting, such as in volumetric muscle loss (VML), leading to fibrosis formation and chronic inflammation. This type of injury predominantly occurs in traumatology and in war-wounded patients, with functional disability despite an optimal treatment. The use of biomaterials could provide the biochemical and physical cues that are missing in this pathologic repair. In this work we have focused on obtaining a biomaterial composed of skeletal muscle ECM. We have tested several decellularization protocols both to preserve the three-dimensional architecture of the muscle ECM and to completely remove cell components in order to avoid a deleterious immune response after implantation. However, the protocol did not allow the preservation of trophic molecules such as GAGs, in the scaffold.“ReGenerating Agents” (RGTA®) are functionally analogous of GAGs with a crucial property to resist enzymatic degradation. They function to restore a proper microenvironment for tissue healing with already a clinical application in skin and corneal repair. We have explored the effects of RGTA® in muscle regeneration using an in vivo model in mouse. At early time of regeneration (day 8), we performed histologic analysis. We showed that regenerating myofibers contained more nuclei in the treated animals, in favor of an increase of progenitor fusion, which has been validated in vitro in myogenic cultures. The number of capillaries was higher in favor of a better angiogenesis. Lipid droplets, a marker of impaired regeneration, were reduced by RGTA® administration. At later time of regeneration (day 28), capillary number was still improved in favor of a durable effect of RGTA® on angiogenesis. RGTA® could be incorporated into biomaterials and are particularly resistant in an inflammatory environment, such as that occurring after a VML injury. Chemokines and growth factors could also be added in ECM-based scaffolds to promote the migration of progenitors that are essential for myofiber neoformation. Therapeutic efficacy of these optimized biomaterials will require to be evaluated in an in vivo model of VML