L'objectif de cette étude s'inscrit dans une démarche de développement de céramiques apatites phosphocalciques et de leur évaluation biologique. Les matériaux étudiés sont des hydroxyapatites silicatées ou carbonatés denses en monophasées. Il s'agit d'un travail interdisciplinaire, qui va de la synthèse et la mise en œuvre de matériaux céramiques à la biomécanique cellulaire et les essais de cultures cellulaires in vitro. La dimension originale du projet concerne le suivi de la réponse des cellules osseuses déposées sur ces céramiques par l'indentation à l'aide d'un AFM. Ces travaux montrent d'une part, que la bioactivité des matériaux étudiés était semblables et d'autre part, que la relaxation de cellules ensemencées sur TA6V et hydroxyapatite stochiométrique suivent une loi puissance (exposant ≈ 0.2) sur 2-200 secondes. La méthode originale utilisée montre par ailleurs que la relaxation d'une fibre d'actine est différentiable de la relaxation de la membrane cellulaire.

Les peptides élastiques (ELP, Elastin-like peptide) sont d'excellents exemples de polymères biomimétiques récemment proposés en médecine régénérative, en particulier dans le domaine de l'ingénierie tissulaire des tissus mous (peau, vaisseaux sanguins, poumons…) pour lesquels la modélisation est complexe car l'instruction correcte des cellules nécessite une élasticité fonctionnelle. L'ajustement précis de la structure primaire des ELP peut moduler voire améliorer les propriétés physico-chimiques, structurales et fonctionnelles de la protéine native. De plus, la capacité des ELP à ajuster leurs caractéristiques physico-chimiques en réponse à des stimuli externes (température, pH), les définit comme des polymères intelligents. Ces polymères bioactifs offrent ainsi une large gamme d'applications très prometteuses encore très peu explorées dans les technologies d'ingénierie tissulaire et les systèmes d'administration de médicaments. Dans ce travail de thèse, nous avons développé, caractérisé et évalué les potentiels thérapeutiques d'une protéine élastique synthétique, Elactiv', inspirée de la structure unique de la tropoélastine humaine, précurseur soluble de l'élastine. Elactiv' conserve les caractéristiques physico-chimiques (comportement thermosensible, propriétés d'autoassemblage) et les fonctions biologiques de la protéine native (prolifération, différenciation et survie des fibroblastes dermiques et kératinocytes humains, sensibilité à la dégradation enzymatique). De plus, Elactiv' possède la particularité in vitro de s'incorporer dans les fibres élastiques néo-synthétisées par des fibroblastes dermiques sains, et d'induire la synthèse de tropoélastine fibrillaire par des fibroblastes pathologiques, syndrome de Williams-Beuren, qui ne synthétisent pas ou très peu de fibres élastiques. Un hydrogel formé exclusivement d'Elactiv' a permis d'accéder aux propriétés mécaniques de l'ensemble et de vérifier sa biocompatibilité in vitro et son innocuité et sa résorption in vivo. Enfin, l'association de la protéine Elactiv' aux dendrigrafts de poly(L-lysine), polymères synthétiques hautement fonctionnalisables, a permis de faire évoluer l'architecture de l'hydrogel vers un biomatériau hybride dans le but d'augmenter ses propriétés mécaniques et biologiques. Ainsi, les potentiels biomimétiques et thérapeutiques de la protéine Elactiv' en font un candidat prometteur pour la régénération des tissus mous / Elastin-like peptides are excellent examples of biomimetic polymers recently proposed in regenerative medicine, particularly for soft tissue engineering (skin, blood vessels, lung ...) for which modeling is a complex task requiring functional elasticity to insctruct cells properelly. Fine-tuning of ELP’s primary structure can modulate or improve physicochemical, structural and functional properties of the native protein. In addition, the adjustment of ELP physicochemical characteristics through external stimuli (temperature, pH) defined them as intelligent polymers. These bioactive polymers thus provide a wide range of very promising applications in tissue engineering and drug delivery, although this has been under-explored until then. In this thesis, we have developed, characterized and evaluated therapeutic potentials of Elactiv', a synthetic elastic protein inspired by the unique structure of the human tropoelastin, the soluble precursor of elastin. Elactiv’ retains physicochemical characteristics (thermoresponsive behavior, self-assembly properties) and biological functions of the native protein (proliferation, differentiation and survival of human keratinocytes and dermal fibroblasts, susceptibility to enzymatic degradation). Besides, Elactiv’ is able to incorporate into neosynthesized elastic fibers by healthy dermal fibroblasts, and to induce fibrillar tropoelastin synthesis by pathological fibroblasts, Williams-Beuren syndrome, which do not synthesize or very few elastic fibres. A hydrogel formed exclusively of Elactiv’ allowed to access to mechanical properties of the scaffold and to verify its biocompatibility in vitro and its safety and resorption in vivo. Finally, the association of Elactiv' protein to poly(L-lysine) dendrigrafts, highly functionalizable synthetic polymers, enabled to evolve the hydrogel's architecture to a hybrid biomaterial in order to increase its mechanical and biological properties for skin tissue engineering. Taken together, biomimetic and therapeutic potentials of Elactiv' protein make it a promising candidate for soft tissue regeneration

Les stents urétéraux et les sondes de néphrostomie sont constitués de silicone ou de polyuréthane thermoplastique (TPU). Afin de limiter les risques infectieux lors de leur implantation, une modification topographique par création de pores permettrait de limiter l’adhésion des bactéries et de former des réservoirs pour une libération in situ de substances antiinfectieuses. Ce travail vise à préparer des surfaces en polymère ayant un motif poreux tubulaire ordonné. Une réplication en deux temps à partir de surfaces ordonnées poreuses d’oxyde d’aluminium (PAAO) préparées par 2 méthodes (double anodisation douce et double anodisation dure/douce) a été mise en œuvre pour reproduire le motif initial sur des surfaces en silicone et TPU. Pour le moule intermédiaire trois matériaux ont été testés (acrylonitrile butadiène styrène, polystyrène et résine polyacrylate). Les surfaces ont toutes été caractérisées par des techniques microscopiques et spectroscopiques. Les surfaces en PAAO préparées par double anodisation douce possédaient des pores d’environ 50 nm de diamètre et 100 nm de profondeur, alors que celles obtenues après mise au point de la méthode dure/douce étaient de taille supérieure, d’environ 125 nm de diamètre et ayant des profondeurs de quelques centaines de nanomètres. La surface du moule intermédiaire est constituée de picots. Une adhésion latérale de ceux-ci a été observée pour certaines conditions. La meilleure réplication du motif a été obtenue pour le TPU. Les surfaces ainsi obtenues pourront être utilisées et optimisées lors de l'étude ultérieure de l'adhésion du biofilm. / Ureteral stents and nephrostomy catheters are made of silicone or thermoplastic polyurethane (TPU). A topographical modification creating an ordered porous surface could limit the infectious risks during their implantation, by reducing bacterial adhesion and creating a loading platform from which anti-infectious compounds could be released.In this work, a two-steps replication method was used to create ordered porous polymer surfaces (silicone or TPU) using porous anodic aluminium oxide (PAAO) as master template. The PAAO surfaces were prepared by double mild or double hard/mild anodization. Three intermediate mould materials were tested (acrylonitrile butadiene styrene, polystyrene, polyacrylate resin). The polymer material (silicone or TPU) was then moulded onto the intermediate mould surfaces that possessed freestanding pillar arrays, to imprint pores. The obtained surfaces were characterized by microscopic and spectroscopic methods. The initial PAAO surfaces prepared by double mild anodization possessed pores of about 50 nm diameter and 100 nm depth, whereas those prepared after development of the double hard/mild anodization method were bigger, of about 125 nm diameter and several hundred nanometers deep. The intermediate mould structure possessed freestanding arrays, but instabilities (lateral adhesion) were noted for certain conditions. The best pattern replication was observed for TPU. In conclusion, these novel porous polymeric surfaces could be optimized and tested for an anti-biofilm effect.

Plusieurs modèles animaux de perte osseuse ont été développés : le modèle du rat orchidectomisé (ORX) et paralysé par la toxine botulique (BTX), le modèle du rat injecté avec des cellules Walker induisant des métastases ostéolytiques, le modèle du rat injecté avec des cellules MAT-Ly-Lu induisant des métastases ostéocondensantes. Nous avons montré que la combinaison ORX-BTX avait des effets cumulatifs ; elle induit des changements microarchitecturaux et une perte osseuse massive et rapide due à une hausse rapide et transitoire du remodelage osseux. Le modèle ORX-BTX a été utilisé pour l'implantation d'un biomatériau injectable qui a été transitoirement remplacé par de l'os non mature résorbé ensuite sans être substitué par de l'os lamellaire mature. Des mesures densitométrique, histomorphométrique et microtomographique chez le rat ORX-BTX ont montré que le risédronate a un effet protecteur contre la perte osseuse trabéculaire et la modification de la microarchitecture et un effet plus modéré sur la perte osseuse corticale. La testostérone ne prévient pas la perte osseuse mais préserve la masse maigre corporelle. L'analyse de texture et la microtomographie ont permis de détecter et de différencier les altérations osseuses induites par métastases ostéolytiques ou ostéocondensantes. Nous avons également montré par études histologique et immunohistochimique que les interactions cellules cancéreuses-cellules stromales provoquent une production stromale de cytokines aboutissant à l'ostéoclastogénèse uniquement dans le microenvironnement osseux. Le microenvironnement osseux peut donc avoir un rôle important dans l'établissement et la prolifération métastatique.

Les biomatériaux interviennent dans de nombreuses applications médicales. La connaissance de leur évolution une fois implantés dans l'organisme est primordiale pour les améliorer et en créer de nouveaux. Dans cette optique, nous avons réalisé une modélisation à deux dimensions de la transformation d'un biomatériau en os. Pour cette modélisation, nous utilisons la théorie de la percolation. Celle-ci traite de la transmission d'information à travers un milieu où sont distribués un très grand nombre de sites pouvant localement relayer cette information. Nous présentons un modèle de double percolation sites-liens, pour prendre en compte d'une part la vascularisation (et/ou résorption) du biomatériau de l'implant dans un os, et d'autre part sa continuité mécanique. Nous identifions les paramètres pertinents pour d'écrire l'implant et son évolution, qu'ils soient d'origine biologique, chimique ou physique. Les différents phénomènes sont classés suivant deux régimes, percolant ou non-percolant, qui rendent compte des phases avant et après vascularisation de l'implant. Nous avons testé notre simulation en reproduisant les données expérimentales obtenues pour des implants de corail. Nous avons réalisé une étude des différents paramètres de notre modèle, pour déterminer l'influence de ceux-ci sur chaque phase du processus. Cette simulation est aussi adaptable à différents systèmes d'implants. Nous montrons la faisabilité d'une modélisation à trois dimensions en transposant la partie statique de notre simulation.

Notre équipe a développé une stratégie innovante de fonctionnalisation d’implants nanofibreux synthétiques à base de nanoréservoirs actifs pour la médecine régénérative osseuse. Notre objectif essentiel est de proposer un implant synthétique, biodégradable, et nanostructuré permettant d’accélérer la réparation du tissu osseux. Ces nouveaux implants synthétiques représentent un choix alternatif aux membranes de collagène d’origine animale. Notre stratégie consiste à construire des nanoréservoirs de chitosane, contenant des facteurs ostéoinducteurs tels que la BMP-2 afin d’enrober les nanofibres de nos implants. L’implant synthétique et biomimétique a été conçu à partir du le poly(ε-caprolactone) (PCL),polymère biocompatible et biodégradable approuvé par la FDA, et élaboré grâce à la technique de l’electrospinning afin de mimer la matrice extracellulaire. L’optimisation de ce procédé a permis la mise en oeuvre d’implants d’épaisseurs différentes (jusqu’à 10mm). La double fonctionnalisation de l’implant a permis de le rendre bioactif et vivant en utilisant la combinaison de facteur de croissance et de cellules souches mésenchymateuses. L’efficacité de la double fonctionnalisation des implants de PCL a ainsi été mise en évidence par l’accélération de la régénération osseuse in vivo.L’activité de ces implants fonctionnalisés de nanoréservoirs bioactifs est en cours d’analyse dans le cadre de tests précliniques pour une application maxillo-faciale, parodontale et orthopédique en vu d’obtenir un marquage CE. De plus, une start-up (ARTiOS NanoMed) basée sur cette nanotechnologie a été crée. En conclusion, nous pensons que la technologie développée par notre laboratoire a permis une avancée dans le domaine de la régénération osseuse et que cette technologie présente un fort potentiel d’application en clinique. / Our team has developped a novel and unique strategy to functionnalize nanofibrous and synthetic implants based on active nanoreservoirs for bone regeneration. We propose a new synthetic biodegradable and nanostructured implant to accelarate restoration of bone tissue. These new implants could replace collagen membranes from animal origin. The nanoreservoirs are based on chitosan containing osteoinductive growth factors such as BMP-2. Poly(ε-caprolactone) (PCL) is a biodegradable and biocompatible polymer approved by FDA and has been used to produce the synthetic and biomimetic implants by electrospinning in order to mimic the bone extracellular matrix. Optimization of this process has allowed the elaboration of nanofibrous implants with different thicknesses reaching 10 mm. Using the combination of growth factors and mesenchymal stem cells in a double functionalization created a bioactive and living implant. This strategy has been validated in vitro and in vivo thanks to bone site implantation in murin model. Acceleration of bone regeneration in vivo has brought to light the efficiency of the double functionalization onto the PCL implants.The functionalized implants bioactivity is still currently in study for pre-clinical trials in order to obtain authorization for applications in maxillo-facial, parodontal, and orthopaedic fields. Moerover, astat-up (ARTiOS NanoMed) based on this nanotechnology has been founded.To conclude, we believe that our nanotechnology could lead to a new generation of engineered bone implants which has a great potential to be used in the clinic.

La cicatrisation parodontale est un processus complexe, composé de quatre phases hautement intégrées (hémostase, inflammation, prolifération, remodelage), qui nécessite une interaction complexe entre les différents types tissulaires (épithélium, conjonctif, os) ainsi que la synthèse de médiateurs, tels que les hormones et les facteurs de croissance. La difficulté à pouvoir obtenir une régénération des tissus parodontaux est en partie due à la réponse inflammatoire qui interfère avec le processus de cicatrisation, via la surexpression des cytokines pro-inflammatoires, ainsi qu’à la croissance rapide des cellules épithéliales le long de la surface de la racine qui porte atteinte à la vraie organisation des tissus, essentielle à la régénération parodontale. Notre objectif a été de mettre au point des membranes nanofibreuses implantables à base de polycaprolactone (PCL) fonctionnalisés par plusieurs molécules actives (Alpha-Melanocyte Stimulating Hormone (α-MSH)), ibuprofène, atorvastatine) et implantables, permettant à la fois un contrôle physique et biochimique de la cicatrisation parodontale. En d’autres termes, nous avons cherché à ralentir la colonisation de la surface radiculaire par les cellules épithéliales et à moduler l’inflammation de la phase post-chirurgicale afin de promouvoir la cicatrisation parodontale. Pour cela, nous avons mis au point un modèle d’inflammation in vitro mimant le tissu superficiel du parodonte en utilisant des cellules parodontales, à savoir des kératinocytes et fibroblastes gingivaux humains, stimulées par du lipopolysaccharide de Porphyromonas gingivalis (LPS-Pg). Les résultats obtenus ont montré une bonne biocompatibilité des systèmes (α-MSH, ibuprofène) ainsi qu’une diminution de la prolifération, migration des kératinocytes, fibroblastes gingivaux humains et une diminution significative de l’expression des marqueurs pro- ou anti-inflammatoires (TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-8), des marqueurs d’adhérence, de prolifération (Intégrine, Laminine, Fibronectine) et de remodelage (COL-IV). En conclusion, les stratégies développées (α-MSH, ibuprofène) au sein de notre laboratoire ont permis de mettre en évidence l’intérêt de délivrer une molécule anti-inflammatoire à partir d’un biomatériau et représentent un fort potentiel d’application clinique pour la parodontologie mais aussi pour la médecine de demain. / Periodontal wound healing is a process involving hemostasis, inflammatory phase, proliferation and maturation/matrix remodeling. These phases require cell-to-cell interaction of different cell types (epithelial cells, fibroblasts, osteoblasts, and cementoblasts) orchestrated by growth factors, cytokines and extracellular matrix components. After conventional periodontal therapy, wound healing corresponds more to tissue reparation than regeneration. This absence of true regeneration is considered to be mainly due to the competition between the different periodontal tissues (gingiva, cementum, alveolar bone) and the differential rate of proliferation, migration and differentiation of periodontal cells during wound healing. Therefore, the inflammatory response could interfere with the healing process depending on the secretion/activity level of matrix metalloproteinase (MMPs), cytokines, chemokines and also the imbalance with their antagonists/inhibitors, which leads to fibrosis and excessive scarring. Our aim was to develop implantable nano-fibrous membranes based on polycaprolactone (PCL) and functionalized by several active molecules (Alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)), ibuprofen, atorvastatin) allowing both physical control and biochemical periodontal healing features. Furthermore, we developed an in vitro inflammatory model mimicking the periodontal tissue surface, using periodontal cells ; keratinocytes and human gingival fibroblasts stimulated with lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis (Pg-LPS). The results obtained showed good biocompatibility systems (α-MSH, ibuprofen) and a decrease in the proliferation and migration of keratinocytes, human gingival fibroblasts. Moreover, a significant decrease of pro- or anti-inflammatory markers expression (TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-8), adhesion markers of proliferation (Integrin, laminin, fibronectin) and remodeling (COL-IV) could be achieved. In conclusion, the strategies developed in our laboratory (α-MSH, ibuprofen), have helped to highlight the interest of the release of an anti-inflammatory molecule from a biomaterial, and represented a strong potential for clinical application not only in periodontics but also in general medicine.

Le septum nasal joue un rôle prépondérant dans la croissance de l’étage moyen de la face et la physiologie ventilatoire. Sa solidité, sa rectitude et sa position sagittale sont déterminantes pour percevoir un confort respiratoire diurne et nocturne. Vulnérable aux traumatismes de part sa projection antérieure, la destruction ou l’inefficience de son squelette entraîne une demande de réparation fonctionnelle et esthétique. Dans les cas les plus sévères, le remplacement tissulaire fait appel à des volumineux greffons autologues pour lesquels la morbidité du site donneur et leurs imperfections propres restent un écueil. Pour les remplacer, certains biomatériaux ont été essayés de manière empirique sans donner de résultats fiables. Le premier objectif de notre travail été d’évaluer le comportement d’un implant phosphocalcique biphasique pour la reconstruction du septum nasal afin d’éviter ces greffons tout en répondant aux objectifs biofonctionnels locaux, au contact d’un milieu septique et susceptible d’être exposé aux particules aéroportées de l’environnement. Le deuxième objectif était d’évaluer la cytotoxicité des nanotubes de carbone à double paroi sur des cellules de l’arbre respiratoire, premier organe concerné par une exposition potentielle lors de leur fabrication. Par la suite, les résultats de ces deux sujets différents ont été utilisés de manière synergique pour répondre au troisième objectif qui était, d’évaluer l’influence des nanotubes de carbone sur la cicatrisation du septum nasal en présence ou non de l’implant phosphocalcique. / The nasal septum plays a paramount role in the growth of the face and respiratory physiology. Its solidity, its straightness and its sagittal position are determining to perceive a diurnal and night respiratory comfort. Vulnerable to the traumas, the destruction or the inefficiency of its skeleton involves request for a functional and aesthetic repair. In severe cases, the tissue replacement requires large autologous grafts for which the morbidity of the donor site and their own imperfections remain a problem. To replace them, certain biomaterials were tested in an empirical way without giving reliable results. The primary goal of our work was to evaluate the behaviour of a biphasic phosphocalcic implant to repair nasal septum in order to avoid these grafts with an adapted biofunctional implant, exposed to the septic nasal content and the airborne particles of the environment. The second objective was to evaluate the cytotoxicity of the double wall carbon nanotubes on epithelial respiratory cells, first organ concerned by a potential exposure during their manufacture. Thereafter, the results of these two different subjects were used in a synergistic way to answer the third objective which was, to evaluate the influence of the carbon nanotubes on the cicatrization of the nasal septum in presence or not of the phosphocalcic implant.

L’architecture des biomatériaux de comblement osseux à un réel impact sur l’activité cellulaire, la vascularisation et la diffusion de facteurs de croissance. Dans un premier temps, différentes membranes de polystyrène (PS) composées de fibres alignées ou aléatoires ont été étudiées. Elles sont non biodégradables et pourraient servir de supports pour la régénération de larges défauts osseux. Nous avons montré la cytocompatibilité in vitro des membranes en analysant l’adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaire. Ensuite, des membranes de PS ont été enrichies de grains de β-TCP ou de nanoparticules d’or. Nous les avons implantées dans un modèle de défaut crânien de taille critique chez la souris. L’addition de β-TCP a stimulé la repousse osseuse grâce à la grande bioactivité des céramiques. Les membranes ont été biotolérées, les fibres ont été encapsulées dans l’os néoformé mais également dans un tissu conjonctif dense. Les nanoparticules d’or immobilisées sur des fibres ont migré dans l’os ou ont été phagocytées. Dans un second temps, différentes formulations de granules poreux de β-TCP ont été analysées par nanotomographie aux rayons X. L’architecture macroporeuse des granules varie inversement avec la concentration en β-TCP. Les faces internes montrent une grande hétérogénéité de minéralisation. Pour mimer les conditions d’utilisation en chirurgie maxillo-faciale, les granules ont été empilés dans des tubes. Nous avons montré que l’architecture des empilements de granules dépendait de leur forme. L’empilement de granules commerciaux (contenant12,5g de β-TCP) mime l’architecture naturelle et les propriétés physiques de l’os. / The architecture of bone filling biomaterials has a real impact on cellular activity, vascularization and diffusion of growth factors. As a first step, different polystyrene (PS) scaffolds composed of aligned or random fibers were studied. They were non-biodegradable and could be used as supports for regeneration of large bone defects. We showed the in vitro cytocompatibility of the scaffolds by analyzing cell adhesion, proliferation and differentiation. Then, polystyrene scaffolds were enriched with β-TCP grains or gold nanoparticles. We implanted them in a model of critical size defect in mouse calvaria. Addition of β-TCP stimulated bone regrowth due to the high bioactivity of the ceramics. Scaffolds were biotolerated, fibers were encapsulated in the newly formed bone and also in a dense connective tissue. The gold nanoparticles immobilized on fibers migrated into the bone or were phagocytized. As a second step, different formulations of porous granules of β-TCP were analyzed by X-ray nanotomography. The macroporous architecture of granules varies inversely with the concentration of β-TCP. The internal faces howed a great heterogeneity of mineralization. Tomimic the conditions in maxillofacial surgery, granules were stacked in tubes. We have shown that the architecture of the granules depends on their shape.The stacks of commercial granules (containing 12.5 g ofβ-TCP) mimicked the natural architecture and physical properties of bone.